高效液相色譜法在牛奶中磺胺類藥物殘留檢測(cè)的應(yīng)用

高 爽

盤錦檢驗(yàn)檢測(cè)中心，遼寧盤錦 124010

0 引言

乳房炎是影響奶牛持續(xù)健康的一類生產(chǎn)性疾病，具有發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高、發(fā)病范圍廣等特點(diǎn)[1]，可引發(fā)奶牛乳房炎的病原微生物種類超過150多種，對(duì)國(guó)內(nèi)大型奶牛場(chǎng)臨床乳房炎病例調(diào)查結(jié)果顯示，大腸埃希氏菌（74.5%）、克雷伯氏菌屬（60.9%）、停乳鏈球菌（59.0%）、金黃色葡萄球菌（55.9%）為其主要病原菌[2]。在實(shí)際生產(chǎn)中，為縮短奶牛乳房炎的治療時(shí)間，或治療奶牛因日采食量大，粗放管理飼喂或誤食霉變飼料而出現(xiàn)的腸道感染疾病時(shí)，抗菌藥物是主要的治療手段[3]?；前奉愃幬锸且环N人工合成的、以對(duì)位氨基苯磺酰胺為基本結(jié)構(gòu)的衍生物，對(duì)部分革蘭氏陰性菌、多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌和衣原體屬等病原菌具有較好的抑制作用，是臨床用于治療奶牛病原菌感染的常用藥物之一。

但磺胺類藥物與其他抗菌藥物相同，長(zhǎng)期使用會(huì)出現(xiàn)耐藥性問題，且隨著藥劑量增大，出現(xiàn)藥物殘留問題，甚至引發(fā)食用者過敏或中毒。動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物殘留的檢測(cè)方法主要有免疫法（如膠體金免疫層析法[4]、酶連免疫吸附法[5]、放射性免疫法[6]等）和理化法（如毛細(xì)管電泳法[7]、氣相-色譜質(zhì)譜法[8]、高效液相色譜法[9]等）。理化法的分析準(zhǔn)確度要高于免疫法，可降低檢測(cè)中假陽(yáng)性率或假陰性率，其中高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）提取難度低，操作簡(jiǎn)便，回收率和靈敏度均高，是農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定的重要定量方法之一，在磺胺類藥物殘留中的檢測(cè)得到廣泛推廣和應(yīng)用。

1 磺胺類藥物特點(diǎn)及其檢測(cè)意義

1.1 磺胺類藥物的作用機(jī)理

磺胺類藥物是一類人工合成的、具有對(duì)氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的抗菌類藥物，不易溶于水，易溶于乙醇、乙腈或丙酮，其鈉鹽復(fù)合物易溶于水?；前奉愃幬镏饕ㄟ^抑制敏感菌的葉酸代謝來實(shí)現(xiàn)抑菌、殺菌作用。

1.2 磺胺類藥物的耐藥性

目前臨床上有20 余種磺胺類藥物，種類繁多[10]。養(yǎng)殖業(yè)常用到的磺胺類藥物有磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶等[11]。磺胺嘧啶對(duì)鏈球菌治療效果好，但由于用藥時(shí)間較長(zhǎng)，治療同時(shí)易出現(xiàn)耐藥性，其藥效也會(huì)變?nèi)?；磺胺二甲基嘧啶抗菌效果與磺胺嘧啶相似，但藥物排泄速度慢；磺胺間甲氧嘧啶的耐藥性慢，但長(zhǎng)期或大量使用會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)結(jié)晶尿，因此磺胺類藥物在使用過程中必須注意用藥量和用藥時(shí)間。一般磺胺類藥物以口服方式治療全身感染時(shí)，血液中濃度會(huì)在服用后（3±1）h時(shí)間段內(nèi)達(dá)到最大值[12]。由于磺胺類藥物穩(wěn)定性較高，在腸道內(nèi)可維持一定時(shí)間的高濃度藥效，在抑菌的同時(shí)，體內(nèi)的敏感菌株受到較長(zhǎng)時(shí)間的選擇性抑制，會(huì)產(chǎn)生耐藥性并大量繁殖，因此在藥物治療過程中會(huì)出現(xiàn)隨著治療時(shí)間延長(zhǎng)，藥量逐漸增多的現(xiàn)象。

1.3 磺胺類藥的不良反應(yīng)

磺胺類藥物使用不當(dāng)易出現(xiàn)藥物殘留問題，用藥動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)皮疹、藥物熱等過敏反應(yīng)，且磺胺類藥物對(duì)動(dòng)物腎臟的損害較大，易在動(dòng)物腎小管內(nèi)形成結(jié)晶，損傷其腎小管，導(dǎo)致其出現(xiàn)尿少、結(jié)晶尿、血尿等問題。

1.4 磺胺類藥的檢測(cè)意義

一是降低磺胺類藥物對(duì)動(dòng)物機(jī)體的傷害?；前奉愃幬飳?duì)病原菌感染的治療效果較好，許多養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）會(huì)選擇用磺胺類藥物對(duì)奶牛痢疾和乳房炎等疾病進(jìn)行治療和預(yù)防，但牛羊等反芻動(dòng)物對(duì)磺胺類藥物的吸收率最低，藥物在體內(nèi)的代謝時(shí)間最長(zhǎng)[13]，奶牛在長(zhǎng)時(shí)間藥物治療后，會(huì)使體內(nèi)病原菌發(fā)生基因突變，產(chǎn)生奶藥性。為緩解病情，養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）往往通過增加藥量或通過增加其他藥物協(xié)同作用，增強(qiáng)藥效。但前者往往會(huì)導(dǎo)致病牛因中毒而出現(xiàn)的肌肉抽搐、四肢麻痹現(xiàn)象，嚴(yán)重的甚至死亡。因此牛奶中磺胺類藥物殘留的檢測(cè)可以及時(shí)探明產(chǎn)奶牛是否存在藥物過量使用問題，若發(fā)現(xiàn)，需要及時(shí)停藥，并通過大量飲水，補(bǔ)充適量碳酸氫鈉、維生素B、維生素C等緩解磺胺類藥物中毒情況。

二是保障牛奶產(chǎn)品的安全性。飲用含有磺胺類藥物殘留過多的牛奶可對(duì)人體產(chǎn)生不良毒副作用，出現(xiàn)過敏、嘔吐、頭暈、頭痛、排尿紊亂等癥狀。長(zhǎng)期或過量攝入可引發(fā)動(dòng)物和人類免疫功能下降，影響體內(nèi)核酸的合成[14]，甚至致殘、致畸、致癌[15]。因此對(duì)牛奶中磺胺類藥物進(jìn)行檢測(cè)可以保障牛奶產(chǎn)品的安全性，減少其對(duì)人體的傷害。

2 HPLC方法在牛奶中磺胺類藥物殘留檢測(cè)的應(yīng)用

2.1 牛奶中磺胺類藥物最高殘留限量規(guī)定

根據(jù)《GB 31650—2019 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》規(guī)定，所有動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物最高殘留限量為100 μg/kg（除磺胺二甲嘧啶），磺胺二甲嘧啶在牛奶中的最高殘留限量為25 μg/kg。美國(guó)、歐盟、日本規(guī)定牛奶中磺胺類藥物的最高殘留限量分別為10 μg/L、100 μg/kg、100 μg/kg[16]。

2.2 HPLC方法滿足多種磺胺類藥物同時(shí)檢測(cè)

HPLC方法對(duì)樣品的適應(yīng)性廣，通過顆粒極細(xì)的高效固定相的柱色譜分離技術(shù)使樣品中的各個(gè)組分在最佳的條件下被分離，70%以上的有機(jī)化合物均可用HPLC方法進(jìn)行分析，與傳統(tǒng)的氣相色譜分析技術(shù)相比，其應(yīng)用范圍廣；與經(jīng)典的液體色譜技術(shù)相比，其對(duì)樣品的分析速度、載流速度更快，極大地縮短了樣本分離時(shí)間，并在一次檢測(cè)中可同時(shí)檢測(cè)多種物質(zhì)[17]。王偉等[18]對(duì)牛奶中12 種磺胺類藥物殘留進(jìn)行檢測(cè)，不同磺胺類藥物的線性關(guān)系良好（0～500 μg/kg），相關(guān)系數(shù)R2＞0.998，12 種磺胺類藥物加標(biāo)回收率在60.6%～111.52%范圍波動(dòng)，RSD值為2.42%～12.66%，同時(shí)發(fā)現(xiàn)HPLC方法在2 次獨(dú)立檢測(cè)結(jié)果中的絕對(duì)差值小，除重復(fù)性好之外，對(duì)不同磺胺類藥物殘留檢測(cè)的精密度較高，符合《GB-T 27404—2008 實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》對(duì)磺胺類藥物檢測(cè)要求。趙寅等[19]對(duì)牛奶中22 種磺胺類藥物殘留進(jìn)行檢測(cè)，不同磺胺類藥物的線性關(guān)系良好（50～100 ng/mL），相關(guān)系數(shù)R2＞0.999，磺胺類藥物檢出限為4 μg/kg，加標(biāo)回收率為86.7%～98.2%，RSD值為1.6%～8.4%。由此可見，HPLC方法可滿足多種磺胺類藥物的同時(shí)檢測(cè)，有效地提高了牛奶中磺胺類藥物的檢測(cè)效率，適用于牛奶樣品中多種磺胺類藥物的檢測(cè)分析。

2.3 HPLC方法與其他檢測(cè)方法的比較優(yōu)勢(shì)

HPLC操作過程中，其色譜柱可重復(fù)使用，降低了檢測(cè)成本，同時(shí)在檢測(cè)過程可通過自動(dòng)化操作節(jié)約人力、減少人為誤差，提高整個(gè)檢測(cè)結(jié)果的精確度?？讘c德[20]對(duì)牛乳中磺胺嘧啶（SDZ）、磺胺甲基嘧啶（SMR）、磺胺二甲基嘧啶（SMZ）、磺胺間甲基嘧啶（SMM）4 種藥物殘留進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)（Association of Official Analytical Chemists，AOAC）方法的平均添加回收率為52.55～82.87%，CV值為6.79%～9.91%；HPLC方法的平均添加回收率為69.40%～123.50%，RSD值為1.5%～4.2%，可見本次檢測(cè)結(jié)果中HPLC方法的分析精準(zhǔn)度優(yōu)于AOAC方法，同時(shí)HPLC在檢測(cè)時(shí)可以使用比AOAC法較短的色譜柱，減少了磷酸鹽緩沖液使用時(shí)對(duì)色譜柱的損傷，避免檢測(cè)條件轉(zhuǎn)換時(shí)對(duì)色譜圖的影響，使得整個(gè)檢測(cè)分析操作更為簡(jiǎn)便；4 種磺胺類藥物檢出限值：SDZ、SMR、SMZ為0.010 mg/L、SMM為0.015 mg/L，均符合國(guó)內(nèi)外對(duì)磺胺類藥物的最高殘留限量規(guī)定。

3 HPLC方法在牛奶中磺胺類藥物殘留檢測(cè)的優(yōu)化

3.1 提取方法優(yōu)化

牛奶是一種以蛋白質(zhì)為主要基質(zhì)的產(chǎn)品。HPLC方法檢測(cè)時(shí)樣品在液液萃取或固相萃取時(shí)分層后會(huì)出現(xiàn)許多白色物質(zhì)，進(jìn)而降低回收率，影響檢測(cè)精密度。曹雪琴等[21]對(duì)HPLC檢測(cè)樣品前處理方法進(jìn)行優(yōu)化，以沉淀蛋白法代替液液萃取法，選擇5%高氯酸溶液為蛋白質(zhì)沉淀劑，其離心回收上清液清澈，30 min可以完成整個(gè)進(jìn)樣分析，縮短前處理時(shí)間，10 種磺胺類藥物的平均回收率為81.6%～105%，不同磺胺類藥物的線性關(guān)系良好（0.1～0.2 μg/mL），相關(guān)系數(shù)R2為0.9921～0.9999，可在牛奶中磺胺類藥物殘留的快速篩查中進(jìn)行應(yīng)用。王露等[22]選用石墨烯復(fù)合材料進(jìn)行磁性固相萃取，以HPLC檢測(cè)牛奶中SMR、磺胺甲二唑（SMTZ）、磺胺異唑（SIZ）、磺胺多辛（SDX）4 種藥物殘留，不同磺胺類藥物的加標(biāo)回收率在96.2%～105.0%，RSD值為1.8～3.9，該方法下牛奶樣品的損失程度小，靈敏度高，SMR、SMTZ、SIZ、SDX檢出限分別為0.02 μg/L、0.036 μg/L、0.046 μg/L、0.05 μg/L，相比C18、氨基固相萃取小柱、多壁堿納米管，磁性固相萃取法對(duì)樣本的富集倍數(shù)高，檢出限低，適合于微量磺胺類藥物的檢測(cè)。

3.2 流動(dòng)相優(yōu)化

HPLC流動(dòng)相內(nèi)加入一定量的酸性物質(zhì)有利于磺胺類藥物的電離，促進(jìn)色譜柱內(nèi)硅膠硅醇基的質(zhì)子化，減少與磺胺類藥物間的相互作用，以保證檢測(cè)器檢測(cè)時(shí)檢測(cè)信號(hào)連續(xù)，避免出現(xiàn)拖尾峰。邵金良等[23]比較了4 種不同的流動(dòng)相對(duì)13 種不同磺胺藥物的色譜分離行為，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲酸溶液-乙腈體系無法很好分離磺胺氯噠嗪、磺胺6-甲基嘧啶，冰乙酸溶液-乙腈體系在增減冰乙酸溶液濃度后仍無法實(shí)現(xiàn)磺胺二甲基嘧啶、磺胺5-甲基嘧啶、磺胺甲氧噠嗪的基線分離，磷酸/三乙胺溶液-乙腈體系無法很好分離磺胺嘧啶、磺胺噻唑藥物，其余分離的磺胺類藥物的峰型較差，基線波動(dòng)較大，而磷酸溶液-乙腈體系不僅可分離13 種磺胺類藥物，且獲得的峰型對(duì)稱、尖銳，是一種相對(duì)穩(wěn)定且分離效果較好的流動(dòng)相。

3.3 檢測(cè)器優(yōu)化

紫外和熒光檢測(cè)器均屬于HPLC常用檢測(cè)器。紫外檢測(cè)器可檢測(cè)核酸、氨基酸、蛋白質(zhì)、多天等多種物質(zhì)，但其線性范圍寬，溫度感應(yīng)較為遲鈍；熒光檢測(cè)器檢測(cè)靈敏度高，但只能檢測(cè)帶有熒光的有機(jī)化合物。段婕等[24]對(duì)牛奶中磺胺脒（SGD）、SDZ、磺胺噻唑（STZ）、SMZ4 種藥物殘留進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)以Ag（Ⅲ）-Luminol化學(xué)發(fā)光體系作為HPLC的新型檢測(cè)器比傳統(tǒng)的紫外、二極管陣列、熒光檢測(cè)器更為靈敏，且儀器的運(yùn)行成本較低，線性范圍寬，結(jié)果表明SGD、SDZ、STZ、SMZ檢出限分別0.15 μg/mL、0.96 μg/mL、1.10 μg/mL、1.50 μg/mL，4 種磺胺類藥物加標(biāo)回收率為81.0%～101.5%。

4 結(jié)語(yǔ)

HPLC檢測(cè)方法具有分辨率強(qiáng)、重復(fù)性能好、檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，可適用于牛奶中不同磺胺類藥物同時(shí)檢測(cè)，在檢測(cè)過程中可通過優(yōu)化提取方法、流動(dòng)相和檢測(cè)器等色譜條件來提高檢測(cè)分析精準(zhǔn)度。但由于磺胺類藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)類似，HPLC方法檢測(cè)時(shí)仍易受到基質(zhì)污染，出現(xiàn)定量偏差和色譜分離度不高等問題，因此在今后的檢測(cè)中除了繼續(xù)優(yōu)化色譜條件外，還可以進(jìn)行HPLC聯(lián)用分析，通過多種檢測(cè)方法共用，實(shí)現(xiàn)磺胺類藥物的精準(zhǔn)定量，進(jìn)而保障食用牛奶及其相關(guān)制品的安全性。