李 萌，羅美玲

( 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西 南寧 530021)

質(zhì)譜(mass spectrometry)是一種利用離子化技術(shù)將原本不帶電荷的物質(zhì)先轉(zhuǎn)化為帶電荷的離子，再按照各種離子質(zhì)核比的差異進(jìn)行分離測(cè)定，從而確定待測(cè)物中離子種類(lèi)和含量的方法，廣泛地應(yīng)用于生物、化學(xué)、環(huán)境、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域?；|(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)針對(duì)臨床微生物檢驗(yàn)的需求進(jìn)行了相應(yīng)調(diào)整與優(yōu)化，是目前臨床微生物實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用最為廣泛的質(zhì)譜技術(shù)[1]。

1 MALDI-TOF MS的原理

傳統(tǒng)的細(xì)菌/真菌的檢查與鑒定方法存在操作繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)，試驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，導(dǎo)致難以對(duì)某些疑難病原微生物做出準(zhǔn)確而及時(shí)的檢查與鑒定[2]，影響臨床患者的治療。MALDI-TOF MS是一種基于微生物蛋白質(zhì)指紋圖譜分析的技術(shù)，其主要原理是先提取未知微生物蛋白質(zhì)分子，并利用合適的基質(zhì)與上述蛋白質(zhì)分子形成共結(jié)晶，在激光照射下使原本不帶電的蛋白質(zhì)分子電離帶上電荷，然后在電場(chǎng)作用下通過(guò)一個(gè)真空管道移動(dòng)(飛行)至檢測(cè)器。由于不同質(zhì)荷比(m/z)的離子抵達(dá)檢測(cè)器的先后順序不盡相同，便可獲得特異性的蛋白質(zhì)指紋圖譜，再通過(guò)各種算法分析圖譜峰型數(shù)據(jù)，并與數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知微生物蛋白指紋圖譜進(jìn)行比對(duì)，從而確定該未知微生物的種類(lèi)。

2 MALDI-TOF MS在細(xì)菌/真菌檢測(cè)與鑒定中的應(yīng)用

與傳統(tǒng)方法相比，MALDI-TOF MS具有快速、簡(jiǎn)便、精確等優(yōu)勢(shì)，鑒定時(shí)間可壓縮至15～60 min之內(nèi)[3-5]，同時(shí)準(zhǔn)確性達(dá)到了新的高度。如Sogawa等[6]利用MALDI-TOF MS對(duì)92種共計(jì)468株細(xì)菌進(jìn)行了測(cè)試，91.7%的菌株被準(zhǔn)確鑒定到種，97.0%的細(xì)菌被準(zhǔn)確鑒定到屬。而在Faron等[7]在一項(xiàng)多中心研究中報(bào)告，2263株細(xì)菌(共計(jì)61種)被準(zhǔn)確鑒定到98.2%的種水平及99.8%的屬水平。在真菌鑒定方面，Sendid等[8]使用MALDI-TOF MS與基于生物化學(xué)的傳統(tǒng)真菌鑒定方法進(jìn)行了比對(duì)，在臨床常見(jiàn)的28種1207株酵母菌中，MALDI-TOF MS鑒定準(zhǔn)確率為97.5%，略高于生物化學(xué)法(97.1%)，且時(shí)間更短，成本更低。對(duì)于絲狀真菌而言，MALDI-TOF MS也能取得很好的鑒定效果，如Mcmullen等[9]利用升級(jí)后的商業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)144株曲霉菌進(jìn)行了鑒定，結(jié)果93.6%(133/144)的菌株被準(zhǔn)確鑒定到了種水平。

對(duì)于臨床上某些罕見(jiàn)的病原體，比如非結(jié)核分枝桿菌(NTM)和諾卡菌等，如果按照傳統(tǒng)的表型鑒定方法鑒定菌種，不僅操作繁瑣，且耗時(shí)較長(zhǎng)。MALDI-TOF MS的出現(xiàn)，給上述病原體的準(zhǔn)確鑒定提供了新的選擇。Rodriguez-Temporal等[10]的研究納入了臨床分離到的67種共計(jì)1453株非結(jié)核分枝桿菌，MALDI-TOF MS成功鑒定出了其中的64種，準(zhǔn)確率為95.5%。該研究者還進(jìn)一步指出，當(dāng)檢測(cè)得分不小于1.60分(scores ≥1.60)時(shí)，大部分種類(lèi)的NTM均鑒定正確，這為質(zhì)譜檢測(cè)NTM閾值分?jǐn)?shù)的設(shè)定范圍提供了依據(jù)。王蔚等[11]的研究也證實(shí)，液體培養(yǎng)的NTM，包括堪薩斯分枝桿菌和膿腫分枝桿菌在內(nèi)，其MALDI-TOF MS正確鑒定率達(dá)到88.46%(69/78)。而對(duì)于諾卡菌來(lái)說(shuō)，完善的數(shù)據(jù)庫(kù)及適當(dāng)?shù)那疤幚砜赡軙?huì)對(duì)正確鑒定產(chǎn)生一定的影響。Buckwalter等[12]曾使用了自建數(shù)據(jù)庫(kù)與商業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)相結(jié)合的模式，使鑒定準(zhǔn)確率從原來(lái)的42%提高到了90%。王鵬等[13]通過(guò)改進(jìn)樣本前處理方式，將46株諾卡菌的種水平鑒定率從84.8%提高到了93.5%(43/46)。

3 MALDI-TOF MS在細(xì)菌分型方面的應(yīng)用

細(xì)菌分型對(duì)于聚集性感染暴發(fā)的監(jiān)測(cè)至關(guān)重要。既有的分子生物學(xué)方法，如多位點(diǎn)序列分型(multi locus sequence typing，MLST)及脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulse field gel electrophoresis，PFGE)，在細(xì)菌分型方面發(fā)揮了強(qiáng)大的作用，但也存在設(shè)備昂貴、操作繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)、適用性不強(qiáng)等缺點(diǎn)[14]。為了尋求簡(jiǎn)便快速、成本低廉的新方法，不少學(xué)者利用MALDI-TOF MS高解析度的特點(diǎn)，在細(xì)菌分型方面做了嘗試。

大腸埃希菌被分為幾個(gè)系統(tǒng)群，A群和B1群與非致病性定植有關(guān)，而B(niǎo)2群和D群與腸外疾病有關(guān)[15]，其中ST131亞群被認(rèn)為與醫(yī)院感染密切相關(guān)[16]。Egli等[17]使用MALDI-TOF MS和PFGE同時(shí)對(duì)產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的大腸埃希菌進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)前者快速簡(jiǎn)便，且結(jié)果與PFGE一樣可靠。Nakamura等[18]發(fā)現(xiàn)指紋圖譜在7650m/z及7707m/z形成的特征性峰型可將大腸埃希菌ST131亞群與其他亞群相區(qū)分。彭海等[19]也證實(shí)了MALDI-TOF MS對(duì)于多重耐藥的大腸埃希菌同源性聚類(lèi)分析具有較好的潛力。

金黃色葡萄球菌是臨床微生物實(shí)驗(yàn)室中最常見(jiàn)的分離菌之一，具有多種不同的耐藥機(jī)制，耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)不但耐藥性強(qiáng)，而且也是院內(nèi)感染的重要來(lái)源[20]。Lindgren等[21]先將111株已知PFGE分型的MRSA使用MALDI-TOF MS制成超級(jí)圖譜，再利用該超級(jí)圖譜進(jìn)行其它待測(cè)MRSA的分型，結(jié)果顯示67.4%的待測(cè)MRSA分型與PFGE一致。Steensels等[22]嘗試MALDI-TOF MS對(duì)新生兒ICU內(nèi)暴發(fā)的MRSA進(jìn)行直接分型，發(fā)現(xiàn)分型結(jié)果與PFGE符合率為93%(14/15)，但重復(fù)性較差。郭坤山等[23]分析了80株金黃色葡萄球菌臨床分離株，發(fā)現(xiàn)質(zhì)荷比為6812 m/z、7594 m/z和11990 m/z的蛋白峰是區(qū)分MRSA和MSSA最主要的特征性峰型，可用于MRSA的快速篩查。

4 MALDI-TOF MS在抗生素耐藥性快速檢測(cè)方面的應(yīng)用

自1928年弗萊明發(fā)現(xiàn)青霉素以來(lái)，隨著抗生素的大規(guī)模使用，細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性也與日俱增?？股啬退幮詸z測(cè)是臨床微生物實(shí)驗(yàn)室日常主要工作之一，常規(guī)的耐藥性檢測(cè)方法有紙片法、稀釋法、E-test等，然而上述方法均需要6 h以上的檢測(cè)時(shí)間，有時(shí)不能滿(mǎn)足盡早開(kāi)始針對(duì)性治療的需求，為此不少學(xué)者開(kāi)始著眼于MALDI-TOF MS快速價(jià)廉的優(yōu)勢(shì)，嘗試?yán)迷摷夹g(shù)進(jìn)行抗生素耐藥性的快速檢測(cè)，目前主要的應(yīng)用方向包括以下幾個(gè)方面。

4.1 基于圖譜特征的快速檢測(cè)

某些細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性之后，由于其表達(dá)的蛋白也同時(shí)發(fā)生了變化，在MALDI-TOF MS檢測(cè)圖譜中會(huì)體現(xiàn)出某些特定蛋白峰的出現(xiàn)、消失，峰強(qiáng)度(峰高)的變化以及峰坐標(biāo)位置的改變等特征[24]。這些特征可被特定軟件發(fā)現(xiàn)并提取出來(lái)，并以此構(gòu)建出專(zhuān)門(mén)針對(duì)該種耐藥菌株的自建數(shù)據(jù)庫(kù)。將樣本菌株得到的質(zhì)譜圖譜與該自建數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，即可快速判定該樣本菌株是否屬于相同耐藥表型[25]。如Centonze等[26]證實(shí)，在99.4%(175/176)的產(chǎn)KPC菌株質(zhì)譜圖譜中存在特異性的11109±8 m/z的蛋白峰，而對(duì)照組均缺乏該峰，靈敏度(98.7%)和特異性(100%)均較高；林曉暉等[27]也發(fā)現(xiàn)，3853 m/z、4218m/z、4619m/z是用于判定肺炎鏈球菌是否對(duì)青霉素敏感的3個(gè)最主要的特征峰。

4.2 基于抗生素分解的快速檢測(cè)

某些細(xì)菌產(chǎn)生的酶能夠?qū)⑻囟股胤纸鉃榉肿恿扛〉漠a(chǎn)物。把待測(cè)菌株接種于含有特定抗生素的培養(yǎng)基中孵育一段時(shí)間后，如果該菌株能夠產(chǎn)生相應(yīng)的酶，那么抗生素就會(huì)被其水解，殘留抗生素及其水解產(chǎn)物的存在會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)前后MALDI-TOF MS檢測(cè)圖譜峰型發(fā)生改變，通過(guò)對(duì)峰型的分析可以判斷是否存在相應(yīng)的酶，據(jù)此間接推斷待測(cè)菌株的耐藥性[28]。如Kost等[29]評(píng)估了MALDI-TOF MS對(duì)于碳青霉烯耐藥的腸桿菌(CRE)的檢測(cè)能力，厄他培南耐藥的檢出率為92.7%(89/96)，亞胺培南耐藥的檢出率為97.9%(94/96)； Sakarikou等[30]使用MALDI-TOF MS對(duì)55株來(lái)自血培養(yǎng)中的肺炎克雷伯菌進(jìn)行了厄他培南的水解產(chǎn)物檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)MALDI-TOF MS可以檢測(cè)并區(qū)分不同的產(chǎn)酶菌株，且結(jié)果與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)和基因型鑒定完全一致；李翔等[31]研究也指出，MALDI-TOF MS與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)及PCR的檢測(cè)效能差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但前者可大幅縮短檢測(cè)時(shí)間。

4.3 基于生長(zhǎng)特性的快速檢測(cè)

細(xì)菌或真菌在各個(gè)生長(zhǎng)階段表達(dá)的蛋白具有一定差異性，將待測(cè)菌株置于含有梯度濃度抗生素的培養(yǎng)基中，待測(cè)菌株受到不同梯度濃度抗生素的抑制，其在相應(yīng)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)特性不同，蛋白表達(dá)也不同，利用MALDI-TOF MS檢測(cè)各個(gè)培養(yǎng)基中的蛋白峰型，利用數(shù)學(xué)模型計(jì)算出綜合相關(guān)指數(shù)(composite correlation index，CCI)，可以快速判斷待測(cè)菌株是否對(duì)該抗生素耐藥[32]。如Vella等[33]利用上述方法，將白色念珠菌對(duì)棘白菌素抗真菌藥物的敏感性判斷時(shí)間由原來(lái)的24 ～ 48 h壓縮至3 h。Sparbier等[34]對(duì)上述方法進(jìn)行了改進(jìn)，不再使用CCI，而是使用MALDI-TOF MS直接逐一檢測(cè)各培養(yǎng)基中的質(zhì)譜圖譜，再通過(guò)內(nèi)標(biāo)、峰值強(qiáng)度與檢測(cè)數(shù)值共同計(jì)算相對(duì)微生物含量，從而判定最小抑菌濃度。Van等[35]對(duì)100株多殺巴斯德菌使用上述方法進(jìn)行耐藥性快速檢測(cè)，敏感性和特異性分別為95.7%和100%。

目前，培養(yǎng)與鑒定仍然是臨床上診斷細(xì)菌或真菌感染的金標(biāo)準(zhǔn)，但傳統(tǒng)的表型或生化鑒定方法耗時(shí)較長(zhǎng)，有時(shí)難以滿(mǎn)足對(duì)病原體尤其是危重癥感染病原體快速診斷的需求。MALDI-TOF MS的出現(xiàn)，縮短了檢測(cè)時(shí)間，優(yōu)化了工作流程，且提高了臨床微生物實(shí)驗(yàn)室對(duì)于罕見(jiàn)菌、疑難菌、苛養(yǎng)菌、厭氧菌等的鑒定能力。相信未來(lái)MALDI-TOF MS的發(fā)展重心將是數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷擴(kuò)充與完善，特定軟件的研發(fā)與優(yōu)化，從而拓展以菌株鑒定與分型為核心功能相關(guān)的應(yīng)用場(chǎng)景。

另一方面，不少學(xué)者嘗試?yán)肕ALDI-TOF MS進(jìn)行抗生素耐藥性的快速檢測(cè)試驗(yàn)，雖然檢測(cè)方法缺乏標(biāo)準(zhǔn)化，但目前的研究已顯示其具有優(yōu)秀的潛力，未來(lái)的研究將會(huì)朝著簡(jiǎn)便化、標(biāo)準(zhǔn)化、自動(dòng)化的方向推進(jìn)，使其接近甚至達(dá)到傳統(tǒng)耐藥性檢測(cè)方法的水準(zhǔn)，能夠精準(zhǔn)及時(shí)地為臨床用藥提供有力支持。隨著研究的深入進(jìn)展，MALDI-TOF MS將給臨床微生物實(shí)驗(yàn)室?guī)?lái)新的革命。