幽門螺桿菌感染與胃癌組織Her-2、CyclinD1、miR-223的相關性及對腫瘤侵襲性的影響

陳進強,馬佳紅

陳進強,嘉興市第一醫(yī)院檢驗科 浙江省嘉興市 314000

馬佳紅,浙江省榮軍醫(yī)院檢驗科 浙江省嘉興市 314031

0 引言

胃癌是常見消化系統(tǒng)惡性腫瘤,仍是我國第3大常見惡性腫瘤,第2大致死性惡性腫瘤,是危害國人健康的重大疾病之一[1,2].胃癌的早期診斷與及時治療是改善預后的關鍵因素.人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,Her-2)是人表皮生長因子受體家族成員,細胞周期蛋白D1(CyclinD1)是調(diào)控細胞周期的重要蛋白,研究表明,二者在胃癌組織中表達異常升高[3,4].惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中,伴隨著多種微小RNA(miRNA)異常表達,其中miR-223發(fā)揮著癌基因的作用[5].幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染是誘發(fā)胃癌的最重要環(huán)境因素之一[6].研究發(fā)現(xiàn)[7,8],H.pylori與Her-2、CyclinD1、miR-223在胃癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮交互作用.基于此,本研究首次探討H.pylori感染與胃癌組織Her-2、CyclinD1、miR-223的相關性及對腫瘤侵襲性的影響,為揭示胃癌發(fā)生機制提供參考.報道如下.

1 材料和方法

1.1 材料 選取2018-06/2020-06我院54例胃癌患者作為研究對象,另取距離腫瘤5 cm以上的癌旁組織作為對照組.納入標準: 均經(jīng)病理學明確診斷為胃癌;活檢前或術前均未接受放化療及免疫治療;患者簽署知情同意書.排除標準: 合并其他惡性腫瘤;長期口服糖皮質(zhì)激素、非甾體類消炎藥.年齡: ＜60歲24例,≥60歲30例;性別: 男34例,女20例;腫瘤大小: ≤5 cm,32例,＞5 cm,22例;TNM分期: Ⅰ期9例,Ⅱ期13例,Ⅲ期20例,Ⅳ期12例;腫瘤位置賁門、胃底15例,胃體12例,胃竇27例.本研究符合醫(yī)學倫理學標準,經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(批號:QY2368).

1.2 方法 (1)胃癌組織及癌旁組織m i R-223表達:Invitrogen公司組織總RNA提取試劑Trizol,TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄酶,上海工碩生物技術有限公司實時定量聚合酶鏈式反應(PCR)的2×SYBR Green Master Mix.利用Trizol試劑提取組織總RNA,反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA,按2×SYBR Green Master Mix要求行實時定量PCR反應,在Bio-Rad實時定量PCR儀上進行,反應條件: 95 ℃ 30 s,緊接著40 個循環(huán)(95 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72℃ 30 s),以U6 RNA為內(nèi)參檢測miR-223表達水平.其中引物序列為F:5’-GCCGGCGCCCGAGCTCTGGCTC-3’,R:5’-TGTCAGTTTGTCAAATACCCCA-3’.內(nèi)參為U6: F:5’-GTGCTCGCTTCGGCAGCACAT-3’,R:5’-TACCTTGCGAAGTGCTTAAAC-3’;(2)胃癌組織及癌旁組織Her-2、CyclinD1表達: 英國Abcam公司兔抗人Her-2抗體,北京中杉金橋生物技術有限公司兔抗人CyclinD1單克隆抗體.免疫組織化學染色sp方法檢測胃癌組織、癌旁組織Her-2、CyclinD1表達,實施染色,陽性對照: 已知Her-2、CyclinD1染色陽性的胃癌組織,陰性對照: 磷酸緩沖鹽溶液(phosphate-buffered saline,PBS)代替一抗.觀察切片,每張切片隨機選取5個(×400倍)高倍視野,均計數(shù)100個細胞.參照《胃癌HER2檢測指南(2016版)》[9]判斷HER2結(jié)果: HER2陽性表達為細胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒,隨機選取5個視野(×200倍),均計數(shù)100個細胞,細胞膜均無著色或≤10%呈淡黃色為(-);＞10%細胞的細胞膜呈淡黃色或有隱約可見的膜染色,未包繞細胞膜,染色間斷為(+);＞10%細胞的細胞膜呈黃色或棕黃色,包繞細胞膜,染色連續(xù)為(2+);＞10%細胞的細胞膜呈深棕色,包繞細胞膜,染色連續(xù)為(3+).CyclinD1: 著色強度: 無著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別為0分、1分、2分、3分;陽性細胞數(shù)范圍: ＜5%、5%-25%、26%-50%、51-75%、＞75%分別為0分、1分、2分、3分、4分;兩項結(jié)果相加＜2分為陰性,＞2分為陽性;(3)H.pylori感染判定:胃粘膜組織快速尿素酶試驗、組織切片染色、H.pylori培養(yǎng)3項中任意一項顯示陽性.14C尿素呼氣試驗結(jié)果顯示陽性.

1.3 觀察指標 (1)胃癌組織及癌旁組織Her-2、CyclinD1、miR-223表達;(2)H.pylori感染與未感染胃癌患者臨床資料;(3)H.pylori感染與未感染患者胃癌組織侵襲基因、Her-2、CyclinD1、miR-223表達;(4)胃癌組織Her-2、CyclinD1、miR-223表達、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與H.pylori感染的關系;(5)不同病理特征胃癌H.pylori感染患者Her-2、CyclinD1、miR-223表達.

統(tǒng)計學處理采用統(tǒng)計學軟件SPSS 22.0處理數(shù)據(jù),計數(shù)資料以例數(shù)描述,χ2檢驗,計量資料采取Bartlett方差齊性檢驗與Kolmogorov-Smirnov正態(tài)性檢驗,均確認具備方差齊性且近似服從正態(tài)布,以(mean±SD)描述,行t檢驗;影響因素采用Logistic回歸分析;雙變量正態(tài)分布采用Pearson分析相關性.均采用雙側(cè)檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義.

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織及癌旁組織Her-2、CyclinD1、miR-223表達 胃癌組織Her-2、CyclinD1、miR-223表達量高于癌旁正常組織,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05).見表1、圖1-3.

圖1 胃癌患者Her-2表達.A: 癌組織Her-2;B: 癌旁正常組織Her-2.Her-2: 為人表皮生長因子受體2.

表1 胃癌組織及癌旁組織Her-2、CyclinD1、miR-223表達量對比(mean±SD)

2.2 不同病理特征胃癌H.pylori感染患者Her-2、CyclinD1、miR-223表達 胃癌H.pylori感染患者Her-2、CyclinD1、miR-223表達與分化程度、浸潤深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(P＜0.05).見表2.

表2 不同病理特征胃癌H.pylori感染患者Her-2、CyclinD1、miR-223表達對比(mean±SD)

2.3H.pylori感染與未感染患者臨床資料H.pylori感染與未感染胃癌患者浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相比,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05).見表3.

表3 H.pylori感染與未感染胃癌患者臨床資料對比

2.4H.pylori感染與未感染患者胃癌組織Her-2、CyclinD1、miR-223表達H.pylori感染與未感染患者胃癌組織Her-2、CyclinD1、miR-223表達相比,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05).見表4.

2.5 Logistic回歸分析 分析可知,胃癌組織Her-2、CyclinD1、miR-223表達、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與H.pylori感染有關(P＜0.05).見表4.

表4 H.pylori感染與未感染患者胃癌組織Her-2、CyclinD1、miR-223表達(mean±SD)

3 討論

目前,胃癌確切機制尚不清楚,深入研究胃癌病因及發(fā)病機理仍是胃癌基礎研究的重中之重.臨床研究已證實,H.pylori感染是引發(fā)胃粘膜不典型增生、慢性萎縮性胃炎、胃潰瘍等癌前病變的重要因素,也是胃癌重要危險因素[10].世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)已經(jīng)將H.pylori列為Ⅰ類致癌因素[11].研究認為,H.pylori致病性主要依賴脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)、CagA等毒力因子,LPS、CagA通過與宿主發(fā)生相互作用,引起胃粘膜持續(xù)慢性炎癥,誘導胃癌發(fā)生、發(fā)展;并上調(diào)Toll樣受體4表達,促進胃癌細胞增殖;也可通過減弱γ干擾素介導的細胞免疫及單核細胞介導的抗腫瘤活性,促進胃癌進展[12,13].但詳細致癌機制尚不清楚.本研究數(shù)據(jù)顯示,胃癌患者浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與H.pylori感染有關,提示H.pylori感染參與胃癌浸潤、轉(zhuǎn)移過程,這與既往研究結(jié)果[14]類似,又不完全相同,可能與研究樣本量、病例分期等不同有關.

Her-2屬原癌基因,定位在染色體17q12,編碼產(chǎn)物為Ⅰ型跨膜生長因子受體酪氨酸激酶,可影響細胞生長、生存、分化及凋亡.研究發(fā)現(xiàn),乳腺癌、食管癌、胃癌等惡性腫瘤組織均檢測出Her-2過表達[15].細胞周期紊亂是腫瘤形成的決定因素之一.CyclinD1是細胞周期重要調(diào)節(jié)蛋白,可促進細胞周期由G1期進入S期.正常情況下,細胞進入S期后,cyclinD1迅速分解,若cyclinD1持續(xù)高表達,可導致細胞提前進入S期,出現(xiàn)增殖失控、紊亂,促進惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展.本研究數(shù)據(jù)顯示,胃癌組織Her-2、CyclinD1表達量高于癌旁正常組織,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),提示Her-2、CyclinD1表達均與胃癌發(fā)生有關,與既往研究[16,17]一致.惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中,存在多種miRNA異常表達.研究報道,定位于腫瘤脆弱區(qū)域或腫瘤相關區(qū)域的miRNA達50%,扮演著原癌或抑癌基因的角色.miR-223作為miRNA眾多與腫瘤相關家族中的一員,涉及細胞增殖、分化、凋亡等多種生物學功能,與腫瘤形成及發(fā)展直接相關[18].體外研究顯示[19],H.pylori感染可誘導AGS、GES-1胃癌細胞株的miR-223表達,且進一步研究顯示,miR-223模擬物轉(zhuǎn)染不僅可以促進AGS胃癌細胞生長、促進其克隆形成,還可以提高胃癌細胞的遷移和侵襲能力.本研究數(shù)據(jù)顯示,胃癌組織miR-223表達量高于癌旁正常組織,提示胃癌中miR-223可能發(fā)揮癌基因的作用.

圖2 胃癌患者CyclinD1表達.A: 癌組織CyclinD1;B: 癌旁正常組織CyclinD1.CyclinD1: 細胞周期蛋白D1.

為明確胃癌患者與H.pylori感染與胃癌組織Her-2、CyclinD1、miR-223表達的關系,進一步深入了解胃癌發(fā)生機制,本研究創(chuàng)新性探討發(fā)現(xiàn),H.pylori感染患者胃癌組織Her-2、CyclinD1、miR-223表達升高,且與H.pylori感染有關.推測H.pylori自身及其代謝產(chǎn)物具有潛在致癌活性,可能引起Her-2、CyclinD1、miR-223擴增、激活,促進胃癌浸潤、轉(zhuǎn)移過程.但詳細機制仍有待后續(xù)研究一步證實.進一步分析發(fā)現(xiàn),胃癌H.pylori感染患者Her-2、CyclinD1、miR-223表達與分化程度、浸潤深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關.分析機制可能為,HER-2過度表達,通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子表達,促進腫瘤新生血管生成,參與腫瘤進展[20];CyclinD1是細胞周期調(diào)控機制中的重要基因,可促進細胞增殖[21];miR-223可通過調(diào)控PI3K/AKT通路、JAK2/STAT3通路等,增強胃癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力,抑制胃癌細胞凋亡[22].Her-2、CyclinD1、miR-223亦可能通過與H.pylori相互影響,共同促進胃癌進展.

表5 Logistic回歸分析

圖3 癌組織患者miR-223表達.A: 癌組織miR-223;B: 癌旁正常組織miR-223.miR-223: 微小RNA-223.

4 結(jié)論

綜上可知,H.pylori感染可能通過影響胃癌組織Her-2、CyclinD1、miR-223表達而對腫瘤侵襲性產(chǎn)生影響.本研究可能為胃癌及其轉(zhuǎn)移患者的診斷與治療提供新思路.

文章亮點

實驗背景

胃癌是常見消化系統(tǒng)惡性腫瘤,仍是我國第3大常見惡性腫瘤,第2大致死性惡性腫瘤.胃癌的早期診斷與及時治療是改善預后的關鍵因素.幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染是胃癌發(fā)生的因素之一,但詳細致癌機制尚不清楚,人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,Her-2)、細胞周期蛋白D1(CyclinD1)、微小RNA-223(miR-223)、發(fā)展中也具有重要作用,猜想H.pylori感染可能影響Her-2、CyclinD1、miR-223從而影響病情進展.

實驗動機

本研究首次探討H.pylori感染與胃癌組織Her-2、CyclinD1、miR-223的相關性及對腫瘤侵襲性的影響,為揭示胃癌發(fā)生機制提供參考.

實驗目標

探討H.pylori感染與胃癌組織Her-2、CyclinD1、miR-223的相關性及對腫瘤侵襲性的影響.

實驗方法

選取2018-06/2020-06我院54例胃癌患者作為研究對象,另取距離腫瘤5 cm以上的癌旁組織作為對照組.對比胃癌組織及癌旁組織Her-2、CyclinD1、miR-223表達,采用Pearson相關性分析H.pylori感染與未感染患者臨床資料、Her-2、CyclinD1、miR-223表達的相關性,采用Logistic回歸分析胃癌H.pylori感染的影響因素.

實驗結(jié)果

胃癌組織Her-2、CyclinD1、miR-223表達量高于癌旁正常組織;H.pylori感染與胃癌組織Her-2、CyclinD1、miR-223具有顯著相關性及對腫瘤侵襲性產(chǎn)生影響,揭示了胃癌發(fā)生機制,設計合理,數(shù)據(jù)詳實.

實驗結(jié)論

H.pylori自身及其代謝產(chǎn)物具有潛在致癌活性,可能引起Her-2、CyclinD1、miR-223擴增、激活,促進胃癌浸潤、轉(zhuǎn)移過程.且胃癌H.pylori感染患者Her-2、CyclinD1、miR-223表達與分化程度、浸潤深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關;Her-2、CyclinD1、miR-223亦可能通過與H.pylori相互影響,共同促進胃癌進展.

展望前景

本研究通過腫瘤新生血管生成、細胞周期調(diào)控基因和信號通路探討了胃癌進展的作用機制,設計合理,數(shù)據(jù)詳實,切合實際,值得推廣繼承和研究.對臨床具有指導意義,可為胃癌及其轉(zhuǎn)移患者的診斷與治療提供新思路.