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      血管內(nèi)皮生長因子-C 對鼻咽癌CNE-2 細(xì)胞小鼠移植瘤的輻射敏感性的影響

      2023-01-02 13:13:34吳錫芳彭麗莎
      關(guān)鍵詞:瘤體鼻咽癌免疫組化

      吳錫芳 ,汪 勇 ,彭麗莎 ,羅 潔 ,王 楓

      (1)昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院頭頸外科,云南 昆明 650118;2)昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院放療科,云南 昆明 650032)

      鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是常見頭頸部惡性腫瘤之一,很容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,目前治療主要以放療為主綜合治療。鼻咽癌新生血管在它的發(fā)生、發(fā)展及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)高表達(dá)可促進(jìn)血管新生,VEGF 高表達(dá)的患者治療后總體生存情況較差,并且更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長因子-C(vascular endothelial growth factor-C,VEGF-C)是促淋巴管生長因子,VEGF-C 在鼻咽癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮很大的作用,但目前關(guān)于VEGF-C在鼻咽癌輻射敏感性方面報道很少。

      本研究以VEGF-C 作為研究問題著眼點,探討VEGF-C 對鼻咽癌CNE-2 細(xì)胞小鼠移植瘤輻射敏感性影響及其機(jī)制,以期為鼻咽癌抗VEGFC 治療聯(lián)合放療提供理論支持,也為鼻咽癌患者的治療提供新的治療靶點。

      1 材料與方法

      1.1 實驗材料

      細(xì)胞株,CNE-2 細(xì)胞來源于上海復(fù)旦大學(xué),培養(yǎng)條件:1 640+10%FBS+1%雙抗+1%谷氨酰胺完全培養(yǎng)基,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%時,接種細(xì)胞于6 孔板,待細(xì)胞長至70%,按組別進(jìn)行換液,常規(guī)傳代。

      1.2 研究方法

      1.2.1 質(zhì)粒和siRNA 干擾用銳博human VEGFC siRNA 轉(zhuǎn)染套裝對CNE-2 細(xì)胞進(jìn)行VEGF-C siRNA 干擾預(yù)實驗,篩選出干擾效果最好的siRNA 序 列。VEGF-C siRNA 靶序列如下:siRNA-1,5 ′-GGCTTATGCAAGCAAAGATCTG G-3′;siRNA-2,5′-ACCCAGAATATTGGAAAA TGTAC-3′;siRNA-3,5′-CAGAATATTGGAA AATGTACAAG-3′;NC,5′-UUCUCC GAACG UGUCACGUTT-3′。

      CNE-2 細(xì)胞組換液為1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基,siRNA NC 對照組換液為含80 nM NC 的1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基;干擾序列換液為含80 nM siRNA 干擾序列的1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基;培養(yǎng)48 h 后,收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA,Q-PCR 檢測各組細(xì)胞VEGFC 的表達(dá)情況,通過分析,發(fā)現(xiàn)干擾效果最好序列,并采用此序列進(jìn)行后續(xù)實驗。

      1.2.2 定量RT-PCR(qRT-PCR)按Trizol 法提取細(xì)胞總RNA,先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA,以逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中獲得的cDNA 為模板,GAPDH 為內(nèi)參對照,SYBR? Green PCR Master Mix 用于qPCR 測定、20 μL PCR 擴(kuò)增體系。反應(yīng)條件為:95 ℃ 15 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,共進(jìn)行40 個循環(huán)。2-ΔΔCt法計算目標(biāo)基因的相對表達(dá)水平。

      1.2.3 免疫印跡分析收到細(xì)胞后,將培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液吸干凈,PBS 洗滌2 次,每孔細(xì)胞板,加入300 μL 的RIPA 裂解液(含50 μL 蛋白酶抑制劑),冰盒上裂解5 min,然后用細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞,將細(xì)胞收集到1.5 mL 離心管中,并加入100 μL SDS 蛋白上樣緩沖液,水浴93 ℃ 10 min,取出后自然冷卻,測定總蛋白濃度。經(jīng)過SDSPAGE 電泳,轉(zhuǎn)膜(采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜)。免疫反應(yīng),將PVDF 膜置于5%的牛血清白蛋白中,室溫(20 ℃~30 ℃)封閉1 h;脫色搖床上,TBST 漂洗3 次,每次5 min;盡量吸干BSA 液,加入一抗(VEGFC 蛋白抗體稀釋比1∶200,GAPDH 蛋白抗體稀釋比1∶3 000)5 mL,裝入雜交袋中,將剪好的PVDF 膜置于其中,捆綁于靜音混合儀上,放置4 ℃冰箱中過夜;取出雜交袋,室溫復(fù)溫10 min,去除一抗液體,加入TBST 緩沖液洗膜3 次,每次10 min;加入酶標(biāo)二抗(兔二抗 1∶3 000,鼠二抗 1∶3 000),室溫孵育2 h。TBST 洗膜3 次,每次10 min。ECL 顯色:用吸水紙盡量吸干PVDF 膜上的水分后,將其平放在采集化學(xué)發(fā)光信號凝膠成像儀里;吸取ECL 試劑盒中的A 液和B 液各50 μL 加入900 μL 雙蒸水中,混勻,均勻地滴加到膜上;點擊live aquire,開始采集圖像。

      1.2.4 細(xì)胞增殖實驗用CCK-8 溶液測定細(xì)胞存活率。收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清于96 孔板,另按試劑盒說明書設(shè)置空白孔、對照孔、陰性組,每組3 孔重復(fù);向每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液;培養(yǎng)箱中孵育24 h,酶標(biāo)儀(美國MD 公司)450 nm波長處測定吸光度。

      1.2.5 實驗動物與照射通過昆明醫(yī)科大學(xué)動物所購買周齡均為6 周左右的SPF 級BALB/C 小鼠用SPF 級飼料條件飼養(yǎng),經(jīng)過1 周時間待小鼠情況穩(wěn)定后,對小鼠進(jìn)行成瘤實驗(合格證號:1107271911003162)。

      照射條件:Synergy VAMT,放射源為6MV X-射線,細(xì)胞單次受照射劑量為2 Gy 源皮距100 cm 照射,劑量率為300 cGy/min。

      1.2.6 動物實驗設(shè)計向小鼠腋下皮下注射鼻咽癌細(xì)胞CNE-2,每日觀察瘤體生長情況,待瘤體體積達(dá)到0.7 cm3左右,將小鼠隨機(jī)分為6 組,每組6 只:模型瘤體組為瘤體內(nèi)注射50 μL 生理鹽水連續(xù)注射4 d,然后每3 d 補(bǔ)注射1 次;siRNANC 組,每天注射濃度為50 nM 的siRNA-NC 50 μL,連續(xù)注射4 d,然后每3 d 補(bǔ)注射1 次;siRNAVEGF-C 組,每天注射濃度為50 nM siVEGF-C 50 μL,連續(xù)注射4 d,然后每3 d 補(bǔ)注射1 次;照射組為瘤體內(nèi)注射50 μL 生理鹽水連續(xù)注射4 d,然后每3 d 補(bǔ)注射1 次,同時每日進(jìn)行2 Gy X 射線照射,連續(xù)照射4 d;siRNA-NC+照射組為瘤體內(nèi)注射siRNA-NC,連續(xù)注射4 d,瘤體每日照射2 Gy,連續(xù)照射4 d,然后每3 d 補(bǔ)注射1 次;照射組+siRNA-VEGF-C,瘤體內(nèi)注射50 nM si-VEGF-C 50 μL,連續(xù)注射4 d,瘤體每日照射2 Gy,連續(xù)照射4 d,然后每3 d 補(bǔ)注射1 次。照射后繼續(xù)飼養(yǎng)小鼠15 d,每天觀察腫瘤生長情況,同時用游標(biāo)卡尺對腫瘤體積測量1 次,V=a2×b/2(a 為瘤體長徑、b 為瘤體短徑)。15 d 后處死小鼠進(jìn)行瘤體取材,比較腫瘤大小。

      1.2.7 小鼠移植瘤組織免疫組化實驗(1)石蠟切片制備 將固定好的組織放入包埋盒中,用乙醇進(jìn)行脫水處理,二甲苯透明,將透明好的組織塊置入在石蠟內(nèi),讓石蠟易于滲入。將過濾好的新蠟傾入包埋器中,盡快將浸透蠟的組織塊放到里面。用石蠟切片機(jī)將石蠟塊切成4 μm 厚的切片。進(jìn)行貼片,將完畢的石蠟切片在60 ℃烤箱烘烤過夜。

      (2)免疫組化染色 切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟、水化,用PBS 漂洗,抗原修復(fù),3%過氧化氫封閉,在用PBS 漂洗,用濾紙將切片周圍的水分吸干,用5%羊血清封閉,加合適濃度的第一抗體,反復(fù)用PBST 漂洗,滴加PV9000 試劑Ⅰ、Ⅱ,每張組織切片上滴加DAB 顯色液,室溫避光孵育5 min,蒸餾水沖洗,終止顯色,蘇木素復(fù)染。梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,光鏡下觀察顯色結(jié)果并拍照。

      1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

      采用SPSS 22.O 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,多組間比較用單因素方差分析(one way ANOVA),2 組間比較采用t檢驗。P< 0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義;應(yīng)用ImageJ 軟件做蛋白電泳條帶灰度分析。

      2 結(jié)果

      2.1 穩(wěn)定的沉默VEGF-C 表達(dá)鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2 的建立

      將VEGF-C 特異性siRNA 序列(siVEGF-C-1、siVEGF-C-2 和siVEGF-C-3)分別轉(zhuǎn)染到CNE-2細(xì)胞中。采用CCK-8 法、qRT-PCR 法和免疫印跡法檢測不同siRNA 對CNE-2 細(xì)胞增殖及VEGFC mRNA 和蛋白表達(dá)的影響。如圖1 所示,干擾CNE-2 細(xì)胞的VEGF-C 后,在0、12、24、36 h后,測定細(xì)胞增殖,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖逐漸下降,其中siVEGF-C-1 組細(xì)胞增殖下降最明顯,見圖A。采用qRT-PCR 法檢測mRNA 的表達(dá),3 組序列中,siVEGF-C-1 組mRNA 表達(dá)量最低,siVEGFC-1 組VEGF-C mRNA 與正常組和陰性對照組比較明顯降低(P< 0.01),見圖B。siRNA-1 序列轉(zhuǎn)染CNE-2 細(xì)胞48 h 后,通過免疫印跡法檢測VEGF-C 的蛋白表達(dá),如圖C 和D 所示,與正常組和陰性對照組(NC)相比,VEGF-C 蛋白表達(dá)顯著降低(P< 0.01)。結(jié)果表明,采用VEGF-C siRNA 轉(zhuǎn)染試劑盒(RBbio)第1 組序列,進(jìn)行干擾CNE-2 細(xì)胞VEGF-C 能降低VEGF-C mRNA和蛋白表達(dá),成功干擾鼻咽癌細(xì)胞CNE-2 中VEGF-C 表達(dá)。

      圖1 鼻咽癌細(xì)胞CNE-2 中VEGF-C 干擾序列篩選Fig. 1 The establishment of VEGF-C silenced NPC cell lines

      2.2 動物實驗檢測干擾VEGF-C 對小鼠移植瘤輻射敏感性影響

      對小鼠腋下皮下注射鼻咽癌細(xì)胞CNE-2,每日觀察瘤體生長情況,待瘤體直徑達(dá)到0.7 cm3左右,將小鼠隨機(jī)分為6 組,每組6 只。每3 d 觀察腫瘤大小,15 d 后處死小鼠進(jìn)行瘤體取材。收集數(shù)據(jù)繪制腫瘤生長折線圖,結(jié)果如圖2 所示,si-VEGFC 組腫瘤體積小于si-NC 陰性對照組和瘤體組;si-VEGFC+照射組腫瘤體積小于單獨照射組。結(jié)果說明:干擾VEGF-C 使腫瘤生長速度減慢,干擾VEGF-C 可增加輻射敏感性。

      圖2 動物實驗檢測干擾VEGF-C 對腫瘤大小影響Fig. 2 Animal experiment to detect the influence of interfering VEGF-C on tumor size n=6。

      2.3 采用免疫組化檢測干擾VEGF-C 對小鼠VEGF-C、p-65、ATM 影響

      剝離小鼠的腫瘤,4%多聚甲醛固定、包埋、切片,進(jìn)行免疫組化染色,檢測VEGF-C、ATM、p65 蛋白表達(dá)變化。如圖3 所示免疫組化結(jié)果表明:在干擾組中,VEGF-C 蛋白表達(dá)明顯少于瘤體組和陰性對照組(P< 0.05),照射組與瘤體組相比VEGF-C 增加(P< 0.05);與照射組相比,干擾組+照射組中VEGF-C 蛋白表達(dá)降低(P< 0.05),這表明:干擾組成功降低VEGF-C 表達(dá),同時也說明輻射可刺激VEGF-C 表達(dá)升高。圖4 所示p65 蛋白表達(dá),與瘤體組相比,p65 蛋白表達(dá)在干擾組中增加(P< 0.05);但與照射組相比,干擾組+照射組p65 變化不明顯,細(xì)胞實驗表明干擾VEGF-C 可增加p65 表達(dá)。圖5 表示ATM 蛋白表達(dá)變化,與瘤體組和陰性組相比,干擾VEGF-C后ATM 表達(dá)減少(P< 0.05);與照射組和陰性對照組+照射組相比,照射組+干擾組中ATM 減少(P< 0.05)。免疫組化結(jié)果表明:干擾鼻咽癌細(xì)胞CNE-2 中VEGF-C,使p65NF-κB 升 高,NFκB 通路下游ATM 降低。

      圖3 免疫組化檢測VEGF-C 表達(dá)(×400)Fig. 3 Immunohistochemical detection of VEGF-C expression(×400)

      圖4 免疫組化檢測p65 表達(dá)(×400)Fig. 4 Immunohistochemical detection of p65 expression(×400)

      圖5 免疫組化檢測ATM 表達(dá)(×400)Fig. 5 Immunohistochemical detection of ATM expression(×400)

      3 討論

      目前研究表明鼻咽癌中VEGF 表達(dá)率可達(dá)60%~80%左右,通過Meta-analysis 分析發(fā)現(xiàn):組織和血清中血管內(nèi)皮生長因子水平的測定具有重要意義,可預(yù)測鼻咽癌預(yù)后[3]。鼻咽癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機(jī)率比較高,首診患者以頸部腫塊為主要癥狀的多達(dá)40%~50%左右。VEGF 亞型的VEGF-C 是較早發(fā)現(xiàn)能特異性促進(jìn)淋巴管新生的生長因子[4]。黃方等[5]研究發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌組織中高表達(dá)的VEGF-C、NF-κB p65 及Survivin 與鼻咽癌的臨床分期及頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),通過檢測VEGF-C、NF-κB p65 及Survivin 表達(dá)水平,可預(yù)判鼻咽癌惡性程度及轉(zhuǎn)移具有一定的意義。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞可通過自分泌和旁分泌形式釋放VEGF-C,與表達(dá)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的血管內(nèi)皮生長因子3 受體特異性結(jié)合,進(jìn)而刺激下游信號通路ERKl/2 和P13K/AKT 信號通路,誘導(dǎo)新生淋巴管和加速腫瘤細(xì)胞往區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[6-7]。

      為發(fā)現(xiàn)VEGF-C 更多潛在的功能,本研究使用RNA 干預(yù)技術(shù),實時定量PCR 檢測結(jié)果表明:VEGF-C 的mRNA 表達(dá)水平在siVEGF-C 組均顯著下調(diào);Western Blot 檢測VEGF-C 的蛋白質(zhì)表達(dá)水平,結(jié)果表明在siVEGF-C 組顯著下調(diào)。證明成功干擾鼻咽癌細(xì)胞 CNE-2 中VEGF-C 基因,可用此技術(shù)研究VEGF-C 與放射敏感性的關(guān)系。

      小鼠移植瘤實驗結(jié)果證明,干擾VEGF-C 后,接種了鼻咽癌CNE-2 細(xì)胞小鼠生長速度減慢,對于照射組,干擾+照射組腫瘤明顯變小。15 d 后處死小鼠,通過免疫組化發(fā)現(xiàn),與照射組相比,干擾+照射組,VEGF-C、ATM 減少,與瘤體組相比,干擾組p-65 增加,VEGF-C、ATM 減少。動物實驗結(jié)果表明:根據(jù)腫瘤生長曲線和免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn),干擾鼻咽癌細(xì)胞CNE-2 中VEGF-C通過NF-κB 信號通路增加輻射敏感性。這與細(xì)胞學(xué)實驗結(jié)果相一致:在鼻咽癌CNE-2 細(xì)胞干擾VEGF-C 后,通過NF-κB 信號通路引起ATM減少引起細(xì)胞DNA 損傷修復(fù)減少,進(jìn)而提高放療敏感性[8]。

      Gorski 等[9]研究證實:Lewis 肺癌細(xì)胞體外接受電離輻射后,VEGF 的表達(dá)明顯增高。這提示電離輻射誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞VEGF 高表達(dá),可能是腫瘤治療過程中產(chǎn)生抵抗性有關(guān)。有研究證實VEGFR2 在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)高低與其對放射線抗拒密切相關(guān),阻斷腫瘤細(xì)胞內(nèi)VEGFR2 能提高腫瘤細(xì)胞放射敏感性[10]。劉亮等[11]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮抑素能增強(qiáng)VEGFR2 高表達(dá)肺癌細(xì)胞放射敏感性,其機(jī)制可能是內(nèi)皮抑素降低VEGFR2 表達(dá)后,通過PI3K/AKT 和MAPK/ERK 2 條非乏氧途徑下調(diào)HIF-1a 表達(dá),進(jìn)而增強(qiáng)肺癌細(xì)胞放射敏感性。動物實驗也表明:抑制鼻咽癌CNE-2 小鼠VEGFC 表達(dá)后,明顯增加輻射敏感性。

      放療引起的DNA 損傷可激活NF-κB,調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[12]。NF-κB 可以同時存在促進(jìn)轉(zhuǎn)錄和抑制轉(zhuǎn)錄的作用,轉(zhuǎn)錄因子究竟發(fā)揮促進(jìn)還是抑制作用,與其結(jié)合的調(diào)控因子有關(guān),而究竟哪些調(diào)控因子會一起結(jié)合上去,則與刺激因素有關(guān)[13-14]。NF-κB 作為一種轉(zhuǎn)錄因子,可與ATM 發(fā)生特異性的結(jié)合,進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的DNA 損傷。Jung 等[15]研究表明:ATM 能夠激活NF-κB,并影響輻射敏感性,他們數(shù)據(jù)表明,ATM 功能降低通過激活NF-κB,促進(jìn)放療敏感性。ATM 作為P53 上游基因,P53 蛋白有2 個絲氨酸位點被ATM 磷酸化后活性上調(diào)來調(diào)控DNA修復(fù),當(dāng)損傷不能被完全修復(fù),P53 介導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)DNA 損傷修復(fù)基因ATM,在siVEGF-C+照射組中,免疫組化表明ATM 表達(dá)下降,導(dǎo)致了細(xì)胞DNA 修復(fù)受損,進(jìn)而使DNA 損傷加重,增加放療敏感性。

      綜上所述,在移植鼻咽癌CNE-2 細(xì)胞小鼠中,干擾VEGF-C 后可明顯提高放療療效,其機(jī)制主要通過激活NF-κB 信號通路進(jìn)而降低ATM 表達(dá),使DNA 損傷修復(fù)能力下降。本研究結(jié)果為鼻咽癌的抗血管治療提供實驗依據(jù),隨著研究不斷深入,相信越來越多證據(jù)將會證實輻射聯(lián)合抗血管治療可提高放療療效。

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