劉丹寧 黃國(guó)東 楊鑫勇

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬國(guó)際壯醫(yī)醫(yī)院1 腎病科,2 腦病科，廣西南寧市 530000)

【提要】 糖尿病腎病是糖尿病嚴(yán)重且常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥之一，目前仍缺乏有效的特異性治療方法，且缺乏良好的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，目前糖尿病腎病主要的造模方法有誘發(fā)性、自發(fā)性、轉(zhuǎn)基因法等方法，還有結(jié)合中醫(yī)理論而建立的病證結(jié)合模型法，常見(jiàn)病證包括氣虛證、氣陰兩虛證、血瘀證、陽(yáng)虛證等。中醫(yī)藥在治療糖尿病腎病上具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，但其機(jī)制機(jī)理目前尚不十分明確，因此研發(fā)理想的糖尿病腎病動(dòng)物模型對(duì)于研究糖尿病腎病的病因、發(fā)病機(jī)制、干預(yù)措施，以及防治終末期腎臟病具有重要意義。本文對(duì)近年來(lái)國(guó)內(nèi)外關(guān)于糖尿病腎病模型動(dòng)物的選擇、造模方法及模型成功的判定指標(biāo)進(jìn)行綜述。

糖尿病是由于胰島素分泌相對(duì)或絕對(duì)不足、靶細(xì)胞胰島素敏感性下降或胰島自身結(jié)構(gòu)缺陷而導(dǎo)致代謝紊亂的慢性疾病[1-2]。持續(xù)性高血糖、胰島素抵抗和脂代謝紊亂可導(dǎo)致糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病(diabetes nephropathy,DN)、糖尿病足和周?chē)窠?jīng)病變等一系列并發(fā)癥，DN是糖尿病嚴(yán)重且常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥之一，也是終末期腎病和腎衰竭的主要原因之一，全球疾病負(fù)擔(dān)調(diào)查結(jié)果顯示，2017年全球糖尿病患者人數(shù)約為4.51億，預(yù)計(jì)到2045年還將增加2.42億，男性和女性DN的年齡標(biāo)準(zhǔn)化患病率分別為15.48/1 000和16.50/1 000[3-4]。目前對(duì)DN的治療尚缺乏特異性的、有效的方法。中醫(yī)學(xué)并無(wú) DN 之病名，多將其列入“消渴”“水腫”“脹滿”等的范疇。而隨著中醫(yī)藥在治療DN上的優(yōu)勢(shì)愈發(fā)突出，建立良好的病證結(jié)合的DN實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型對(duì)于研究中醫(yī)藥治療DN的機(jī)制，以及推動(dòng)中醫(yī)及中西醫(yī)結(jié)合治療DN的方藥、藥理的研究進(jìn)展具有重要意義。理想情況下，病證結(jié)合的DN實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型應(yīng)具有與人類相似的臨床狀態(tài)特征，并且能夠在整個(gè)穩(wěn)定的慢性病理生理進(jìn)化過(guò)程中檢測(cè)血流動(dòng)力學(xué)和生化參數(shù)的變化。然而，雖然有關(guān)建立病證結(jié)合的DN動(dòng)物模型的研究取得了重大進(jìn)展，但現(xiàn)有的病證結(jié)合的DN動(dòng)物模型仍不能完全反映人類DN的病理和病理生理變化[5]。本文就近年來(lái)國(guó)內(nèi)外關(guān)于DN實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的選擇、造模方法及建模成功的判定指標(biāo)進(jìn)行綜述。

1 DN實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型

目前DN的發(fā)病機(jī)制還不完全明確，理想的DN動(dòng)物模型不僅要能模擬DN的發(fā)生、發(fā)展,而且對(duì)藥物的反應(yīng)也需要與人類相似。目前，DN動(dòng)物模型的構(gòu)建方法主要包括誘發(fā)性、自發(fā)性、轉(zhuǎn)基因法三類方法，自發(fā)性及轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)動(dòng)物模型來(lái)源有限，價(jià)格昂貴，對(duì)飼養(yǎng)和繁殖條件要求較高，因此，藥物誘發(fā)性DN動(dòng)物模型是目前最常用的造模方法。

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

1.1.1 DN小鼠模型：自20世紀(jì)80年代以來(lái)，隨著小鼠胚胎干細(xì)胞技術(shù)和基因敲除技術(shù)的出現(xiàn)，使得小鼠逐漸取代大鼠成為醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中建立DN模型最常用的動(dòng)物。最新研究表明，將C57BL/6J小鼠的瘦素受體基因敲除后可得到db/db小鼠模型，單側(cè)腎切除術(shù)后的db/db小鼠模型表現(xiàn)出早期DN的臨床特征，可以用于DN病情初期進(jìn)展機(jī)制的研究[6-7]。

非肥胖糖尿病(non-obesity diabetes，NOD)小鼠模型是目前最常用的1型糖尿病自發(fā)性模型[8]。C57BL/6J小鼠是研究DN最常用的品系，許多自發(fā)性DN小鼠都是由該品系基因突變而成的。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，與C57BL/6J小鼠相比，從高脂飲食喂養(yǎng)的第4周開(kāi)始，KK-Ay小鼠的脂質(zhì)代謝指標(biāo)(總膽固醇、三酰甘油、LDL-C)水平明顯高于C57BL/6J小鼠，兩組的差異在高脂飲食喂養(yǎng)第12周時(shí)最顯著，而在高脂飲食喂養(yǎng)的第16周后，KK-Ay小鼠脂質(zhì)代謝指標(biāo)(總膽固醇、三酰甘油)水平仍明顯高于C57BL/6J小鼠[1]。有學(xué)者在糖尿病db/db小鼠與C57BL/KsJ小鼠的基礎(chǔ)上研究出一種具有內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)完全遺傳缺陷的小鼠系,這種新型的eNOS-/-db/db C57BL/KsJ小鼠表現(xiàn)出的高血壓、尿白蛋白等癥狀較KK-Ay小鼠更為明顯,同時(shí)出現(xiàn)廣泛的腎小球系膜基質(zhì)擴(kuò)張、腎小球膜炎、腎小球基膜增厚、小動(dòng)脈透明變性和腎小管間質(zhì)纖維化等與人類DN相似的病理表現(xiàn)。研究表明，與鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)誘導(dǎo)的空腹血糖升高或僅胰島素抵抗的SD大鼠相比，空腹血糖和胰島素抵抗性均較高的KK-Ay小鼠更容易發(fā)展為DN，KK-Ay小鼠模型更能表現(xiàn)出與2型糖尿病相關(guān)的典型病理特征，其早期表現(xiàn)和腎臟病變更明顯[1]。

在DN疾病進(jìn)展過(guò)程中，DN合并高血壓是DN是發(fā)展為終末期腎病的主要危險(xiǎn)因素，由于DN動(dòng)物模型晚期沒(méi)有高血壓表現(xiàn)，缺乏存在腎臟病理變化的DN合并高血壓小鼠模型是研發(fā)DN新治療方法的一個(gè)重大障礙。

1.1.2 DN大鼠模型：研究表明，相比于小鼠，大鼠在認(rèn)知行為等方面與人類的相似度更高。與小鼠相比，大鼠體型較大，其生理學(xué)特征易于觀察，是多種疾病的重要模型動(dòng)物。DN大鼠造模品系以Wistar和SD為主,6～8周齡，體重在200～250 g之間[9]。生物繁殖大鼠和LEW.1AR1/Ztm-iddm大鼠是目前最常用的1型糖尿病自發(fā)性模型[8]。

農(nóng)慧等[10]主張采用SD大鼠建立糖尿病模型,因?yàn)镾D大鼠的免疫力強(qiáng)于Wistar大鼠。該團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)采用相同劑量的STZ進(jìn)行造模時(shí),Wistar大鼠的死亡率可以達(dá)到50%以上，其原因可能是建模后Wistar大鼠的免疫力下降，因此對(duì)用于建立糖尿病模型的大鼠等級(jí)和飼養(yǎng)環(huán)境要求更高。為了研發(fā)新的DN大鼠模型，包括美國(guó)糖尿病并發(fā)癥動(dòng)物模型協(xié)會(huì)成員在內(nèi)的一些研究人員一直在利用遺傳育種等手段加重DN大鼠的病情，使DN大鼠模型的主要特征變得更加明顯，如聯(lián)合采用基因模型與高熱量飲食獲得的Zucker脂肪型/自發(fā)性高血壓心力衰竭F1雜交(Zucker fatty/spontaneously hypertensive heart failure F1 hybrid，ZSF1)大鼠，是一種常見(jiàn)的糖尿病合并高血壓和肥胖大鼠模型，該大鼠模型可出現(xiàn)高血壓、高血糖、高脂血癥和腎功能不全等表現(xiàn)，且ZSF1大鼠模型與其他DN嚙齒動(dòng)物模型相比，尤其是與DN小鼠模型相比，最大的區(qū)別是其出現(xiàn)顯著的管間質(zhì)纖維化[5]，這是人類DN的一個(gè)關(guān)鍵病理特征。

1.1.3 其他動(dòng)物：鼠類、嚙齒類動(dòng)物模型并不能完全地反映DN患者的代謝背景與所有的病理改變，疾病的生理機(jī)制也不完全相同。因此，新西蘭兔、斑馬魚(yú)、小型豬、斑馬魚(yú)等亦可作為研究DN的模型動(dòng)物，且各自有其不可替代的優(yōu)勢(shì)。

DN新西蘭兔模型較DN鼠類模型具有模型穩(wěn)定、重復(fù)性好、抗病性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，且方便進(jìn)行反復(fù)采血、灌胃、靜脈注射藥物等操作，以及進(jìn)行組織器官影像學(xué)檢查[11]。與DN鼠類模型的造模方法不同，DN新西蘭兔模型需禁食水12 h后,經(jīng)耳緣靜脈注射50 mg/kg四氧嘧啶,隔天禁食水12 h后再次經(jīng)耳緣靜脈注射100 mg/kg四氧嘧啶(均以注射用水配成5%濃度)，注藥后48 h內(nèi)給予自由攝取10%葡萄糖水[12],干預(yù)后12周，如新西蘭兔腎小球毛細(xì)血管袢呈分葉狀,基底膜及系膜基質(zhì)增生，腎小管部分基底膜增厚,上皮細(xì)胞腫脹、顆粒變性，則提示DN模型成立[13]。但相較于DN鼠類模型，DN兔類模型成模率較低，造模過(guò)程中死亡率較高[14]，其腎臟形態(tài)學(xué)變化與DN患者對(duì)比未見(jiàn)典型腎小球結(jié)節(jié)，系膜基質(zhì)增加及外周毛細(xì)血管滲出亦不明顯[15]。

小型豬也是制備2型糖尿病模型的理想動(dòng)物之一。不論在生理解剖結(jié)構(gòu)、疾病發(fā)生機(jī)制，還是在糖脂代謝和血液生化指標(biāo)上，小型豬與人類都有較高的相似度[16]。廣西巴馬小型豬是采用純繁閉鎖繁育及半同胞為主的近交方式進(jìn)行選育而成的遺傳純和很高的近交群體的小型豬品系，蔣子健等[17]給予廣西巴馬小型豬高脂高糖飼料喂養(yǎng)，并多次經(jīng)耳緣靜脈注射小劑量(50 mg/kg)STZ，建立了較為理想的DN模型。相較于鼠類模型，小型豬模型在生理結(jié)構(gòu)和代謝機(jī)制上更接近于人類，并且有足夠的血液、尿液及腎臟等組織標(biāo)本供實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，應(yīng)用活檢和內(nèi)窺鏡技術(shù)還可以監(jiān)測(cè)腎臟組織的時(shí)序性改變，但其造模時(shí)間長(zhǎng)，造模成本高，僅能模擬DN早期腎臟病變,尚未觀察到腎小管間質(zhì)纖維化和/或腎功能下降等進(jìn)展期DN病變。

成年斑馬魚(yú)的葡萄糖代謝及在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育中的葡萄糖代謝情況與人類及其他哺乳動(dòng)物非常相似，因此，成年斑馬魚(yú)是觀察生理和糖尿病條件下器官發(fā)育、形態(tài)和功能的理想模型。研究表明，生理?xiàng)l件下斑馬魚(yú)的血糖水平在3.3 mmol/L左右，可以通過(guò)飼喂和空腹進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)[18]。鼠類的高血糖誘導(dǎo)通常是通過(guò)單次注射高劑量或連續(xù)注射低劑量的STZ來(lái)實(shí)現(xiàn)的，可在數(shù)天或數(shù)周內(nèi)引起高血糖，而在斑馬魚(yú)中，注射胰十二指腸同源異型基因1嗎啡利諾誘導(dǎo)高血糖只需要2 d，并且在研究葡萄糖記憶效應(yīng)機(jī)制及支持高吞吐量分析和篩選上，因其繁殖速度快、操作簡(jiǎn)便而具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[18]。

1.2 造模方法 誘發(fā)性DN動(dòng)物模型的建立原理是通過(guò)損傷動(dòng)物的胰島細(xì)胞,導(dǎo)致胰島素缺乏從而引起實(shí)驗(yàn)性糖尿病或高血糖，進(jìn)而引發(fā)DN。STZ對(duì)肝腎損害較小，可通過(guò)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白定向破壞胰島β細(xì)胞，是近年來(lái)建立糖尿病動(dòng)物模型的首選藥物。

1.2.1 一次性注射大劑量STZ：一次性大劑量注射STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型的機(jī)制是STZ直接造成胰島β細(xì)胞的損傷，因此通常認(rèn)為該方法所建立的模型為1型糖尿病模型，然而不同種糖尿病動(dòng)物模型所給予的STZ劑量各有不同，甚至對(duì)于同種動(dòng)物一次性大劑量注射不同劑量的STZ所構(gòu)建的模型也存在差異。一次性大劑量注射STZ建立DN 大鼠模型所需要STZ的劑量，目前國(guó)內(nèi)外尚未統(tǒng)一，國(guó)內(nèi)研究一般選取45～65 mg/kg[19-21]，而國(guó)外則采用70～100 mg/kg[22-24]。葉桐江等[25]研究發(fā)現(xiàn)，禁食20 h后一次性腹腔注射STZ 50 mg/kg為建立1型糖尿病大鼠模型的最佳禁食時(shí)間和最優(yōu)劑量。但農(nóng)慧等[10]使用55mg/kg的大劑量STZ一次性注射SD大鼠進(jìn)行造模，并將非空腹血糖水平≥13.8 mmol/L作為建模成功的標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)使用一次性注射55 mg/kg STZ的造模周期相對(duì)縮短。還有研究表明，單純一次性大劑量注射STZ所建立的模型更接近1型糖尿病患者的代謝狀態(tài)，而在大劑量注射STZ基礎(chǔ)上聯(lián)合煙酰胺腹腔注射，可以部分保護(hù)胰島β細(xì)胞免受STZ誘導(dǎo)的損害，能更好地模擬2型糖尿病患者的代謝狀態(tài)[26]。

1.2.2 高糖高脂飲食聯(lián)合STZ注射：研究顯示，高糖高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠表現(xiàn)出與肥胖并前驅(qū)糖尿病具有相同的代謝表型，即葡萄糖耐量和胰島素敏感性受損，以及高三酰甘油血癥和脂質(zhì)過(guò)氧化作用；盡管肌酐水平?jīng)]有變化，但前驅(qū)糖尿病動(dòng)物仍表現(xiàn)出腎小球月牙樣病變，并伴有腎臟組織油紅-O染色脂質(zhì)沉積率增加，三酰甘油、白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)mRNA表達(dá)升高[27]。研究發(fā)現(xiàn)，高脂高糖飼料(10%豬油+ 20%蔗糖+ 2.5%膽固醇+ 1%膽酸鹽+ 66.5%常規(guī)飼料)聯(lián)合STZ腹腔注射建立2型糖尿病大鼠模型的STZ最佳劑量為35 mg/kg，建模成功率高且死亡率低，模型穩(wěn)定；多次注射STZ可激活大鼠免疫系統(tǒng),誘導(dǎo)胰島的免疫反應(yīng),引發(fā)胰島炎,該方法所建立的模型被認(rèn)為是更接近于2型糖尿病患者的動(dòng)物模型[1，28-29]。有研究顯示，高熱量飲食聯(lián)合一次性腹腔注射高劑量(60 mg/kg)STZ誘導(dǎo)4周齡雄性大鼠可建立1型糖尿病和晚期2型糖尿病模型，而高熱量飲食聯(lián)合一次性腹腔注射低劑量(30 mg/kg)STZ 誘導(dǎo)4周齡雄性大鼠能更快地形成具有胰島素抵抗的早中期2型糖尿病模型，并能提高成模率[30]。

1.2.3 手術(shù)聯(lián)合一次性注射STZ：有學(xué)者在大鼠耳朵尾巴連線與右肋弓的交界點(diǎn)做一長(zhǎng)約1 cm的橫行切口，逐層分離皮膚、黏膜、肌肉，充分暴露右腎后再將其切除，檢查無(wú)出血后逐層縫合；術(shù)后1周，大鼠禁食不禁水12 h，按40 mg/kg一次性腹腔注射10 mg/mL STZ，建立DN模型，這種方法相對(duì)于單純注射STZ，可以顯著縮短造模周期，而相較于三聯(lián)法(手術(shù)+高糖高脂飲食+小劑量STZ)則操作較簡(jiǎn)單，成本較低， DN大鼠模型穩(wěn)定，且無(wú)自愈現(xiàn)象[6,31-32]。

1.2.4 手術(shù)+高糖高脂飲食+小劑量注射STZ：?jiǎn)蝹?cè)腎動(dòng)脈結(jié)扎+高糖高脂飼料喂養(yǎng)+小劑量STZ(30～45 mg/kg)腹腔注射的三聯(lián)法是目前應(yīng)用最廣泛的誘發(fā)性DN動(dòng)物模型的制備方法，一般只需要干預(yù)3 d即可造模成功，此時(shí)可觀察到DN早期的臨床特征及病理表現(xiàn)，建模9周后進(jìn)入DN中期，建模22 周后進(jìn)入DN晚期[33]。此三聯(lián)法雖然造模時(shí)間較短，具有顯著的生化和病理改變，但是存在操作復(fù)雜、易感染、死亡率高等缺點(diǎn)，對(duì)研究者的實(shí)驗(yàn)操作水平要求較高。

2 病證結(jié)合DN模型

DN在中醫(yī)中并無(wú)特定的名稱，一般多將其歸于“消渴”“水腫”“脹滿”等的范疇，其作為糖尿病的后期并發(fā)癥，病程長(zhǎng)，多屬本虛標(biāo)實(shí)證?！端貑?wèn)·通評(píng)虛實(shí)論》中提出消癉、仆擊、偏枯、痿厥等類似糖尿病并發(fā)癥的描述，并指出上述疾病發(fā)生的病機(jī)為“隔塞閉絕，上下不通”?！澳I消”一詞首見(jiàn)于《古今錄驗(yàn)方》，《三因極一病證方論》提及消腎的病位在腎，病機(jī)為縱欲過(guò)度，腎精不足，又多食丹藥，內(nèi)熱從生，石氣孤立，導(dǎo)致精溢自泄、唇口干焦、不飲自利，認(rèn)為消腎的病機(jī)為熱伏于下，腎精虧虛?！毒霸廊珪?shū)》提到“下消者，……為淋為濁，如膏如脂，……其病在腎，故又名腎消也”，提出腎消的病機(jī)為火熱內(nèi)生、消灼腎陰或陰虛火旺，同時(shí)也提出陽(yáng)虛亦可致消的觀點(diǎn)。由此可知，氣陰兩虛證是糖尿病并發(fā)癥證型中最常見(jiàn)的證型，而血瘀證始終貫穿糖尿病的整個(gè)病程。病證結(jié)合DN模型的建立主要是在建立DN模型的基礎(chǔ)上模擬中醫(yī)證型的造模方法。

2.1 氣虛證 樊少儀等[34]根據(jù)臨床上部分糖尿病患者由于疲勞和飲食失節(jié)導(dǎo)致DN的發(fā)生或進(jìn)一步加重的原理，采用疲勞聯(lián)合饑飽失常法建立氣虛證DN模型，將DN成模的大鼠連續(xù)14 d放入水溫為(43.0±0.5) ℃ 、水深為35 cm的恒溫水槽中游泳，每天以每只大鼠出現(xiàn)自然沉降的時(shí)間為其游泳耐疲勞的時(shí)間，當(dāng)50%的大鼠出現(xiàn)自然沉降時(shí)停止游泳。DN氣虛證大鼠模型建模成功的標(biāo)準(zhǔn)：疲勞游泳后測(cè)量游泳持續(xù)時(shí)間及懸掛時(shí)間，游泳持續(xù)時(shí)間及懸掛時(shí)間縮短30%以上，大鼠出現(xiàn)明顯精神倦怠，懶動(dòng)，自發(fā)活動(dòng)減少，皮毛蓬亂無(wú)光澤、眼瞇成線和縮肩拱背，糞便稀溏，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，上述癥狀逐漸加重。

2.2 氣陰兩虛證 李詩(shī)[35]采用高糖高脂飼料+腹腔注射STZ的方法建立DN大鼠模型，然后采用具有耗氣破氣功效的中藥顆粒劑(附子10 g、青皮15 g)藥液，根據(jù)大鼠體重按15.75 g/(kg·d)連續(xù)灌胃給藥4周，4周后大鼠出現(xiàn)明顯的倦怠乏力懶動(dòng)、嗜蜷臥、善驚恐打斗、被毛色黃晦暗無(wú)光、舌胖大少津、舌面光滑無(wú)苔等表現(xiàn)，視為氣陰兩虛型DN大鼠模型建模成功。胡正遠(yuǎn)[36]采用三聯(lián)法(手術(shù)+高糖高脂飲食+小劑量STZ腹腔注射)制備DN大鼠模型，成模后以中藥干姜、肉桂、青皮依照1 ∶1 ∶1的質(zhì)量比例，煎劑濃度為1 g/mL，按體重15 g/(kg·d)連續(xù)灌胃4周后DN大鼠出現(xiàn)倦怠乏力懶動(dòng)、毛發(fā)枯黃刺立、舌質(zhì)紫紅少津等癥狀。李進(jìn)[37]采用高糖高脂飼料+一次性腹腔注射STZ的方法建立DN大鼠模型后，連續(xù)灌胃耗氣傷陰顆粒中藥煎劑的同時(shí)附加睡眠剝奪導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)緊張、焦慮、勞累、驚恐等表現(xiàn)，共干預(yù)4周，成功建立氣陰兩虛證DN大鼠模型。陳群等[38]采用高脂喂養(yǎng)+小劑量STZ建立DN模型大鼠，采用低溫調(diào)控手段誘導(dǎo)血瘀證模型大鼠后，再?gòu)闹泻Y選出同時(shí)具有氣陰兩虛證的大鼠，并予糖脈康顆粒(臨床治療氣陰兩虛夾瘀證糖尿病的經(jīng)典方藥)反證動(dòng)物模型，以此得到較為滿意的氣陰兩虛夾瘀證的DN大鼠模型。

2.3 血瘀證 龐欣欣等[39]采用一次性大劑量腹腔注射STZ建立DN大鼠模型8周后，篩選24 h尿蛋白含量≥40 mg的DN大鼠給予尾靜脈注射 10%大分子右旋糖酐，共3次，第 1 次尾靜脈注射后間隔 5 h 后進(jìn)行第 2 次注射，然后禁食，次日尾靜脈注射第 3 次，2周后大鼠均有皮毛和唇色澤暗淡，眼球暗紅，耳郭及舌下脈絡(luò)顏色紫紅、紫暗明顯，爪掌水腫，顏色偏暗等血瘀證表現(xiàn)。還有學(xué)者將成模的糖尿病大鼠在16 ℃下飼養(yǎng)4周，以此得到氣陰兩虛夾瘀證DN大鼠模型[36]。

2.4 陽(yáng)虛型 孫紅旭等[40]采用高糖高脂飼料+2次小劑量腹腔注射STZ建立DN大鼠模型后，選取造模成功的大鼠并給予腺嘌呤及苦寒中藥(龍膽草、梔子、番瀉葉)混合灌胃，得到腎陽(yáng)虛型DN大鼠模型。李海霖等[41]結(jié)合高原地區(qū)的地理因素，讓大鼠每日在氣壓減至相當(dāng)于海拔5 000 m的真空艙內(nèi)活動(dòng)3.5 h，隨后放入冰箱冷藏室中，對(duì)大鼠進(jìn)行寒冷刺激3.5 h，共干預(yù)35 d，同時(shí)按50 mg/kg給予一次性腹腔注射STZ，以此來(lái)建立高原陽(yáng)虛血瘀型DN大鼠模型。

3 DN動(dòng)物模型成模的標(biāo)準(zhǔn)

既往研究表明，糖尿病大鼠于第8周開(kāi)始出現(xiàn)腎病蛋白表達(dá)異常并逐漸加重， 而腎病蛋白被認(rèn)為是糖尿病腎損傷早期的標(biāo)記物[42]。周淑紅等[43]研究發(fā)現(xiàn)，在成模后第16周時(shí)糖尿病大鼠模型才出現(xiàn)腎臟肥大、高濾過(guò)和腎小球基質(zhì)增生，且尿素氮、血肌酐和腎小球?yàn)V過(guò)率與DN發(fā)生均無(wú)相關(guān)性，這提示在DN早期檢測(cè)尿白蛋白水平并不能完全反映腎臟病理?yè)p害變化。

目前糖尿病與DN動(dòng)物模型成模的標(biāo)準(zhǔn)尚未統(tǒng)一，不同研究的成模標(biāo)準(zhǔn)均不同。常用的糖尿病動(dòng)物模型成模標(biāo)準(zhǔn)為：注射STZ或者四氧嘧啶等造模藥物72 h后，連續(xù)3 d采集尾靜脈血檢測(cè)血糖,至少連續(xù)3次血糖水平≥16.7 mmol/L，尿糖強(qiáng)陽(yáng)性[25,42，44]，口服葡萄糖耐量試驗(yàn)后血糖水平≥11.1 mmol/L[30,45]，24 h尿量多于空白對(duì)照組的50%[31]。DN早期的典型特征是腎小球肥厚，腎小球系膜基質(zhì)中度擴(kuò)張，腎小球毛細(xì)血管壁增厚；隨著病情的發(fā)展,腎小球硬化癥是DN的主要病理學(xué)特征，表現(xiàn)為腎小球基底膜增厚，系膜細(xì)胞和足細(xì)胞損失擴(kuò)張[3,40]。 基于此，美國(guó)糖尿病并發(fā)癥動(dòng)物模型協(xié)會(huì)制定了DN嚙齒動(dòng)物模型的驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn):(1)DN動(dòng)物模型的整個(gè)生存期腎小球?yàn)V過(guò)率下降50%以上；(2)與相同品系、性別、年齡的對(duì)照組相比，尿蛋白增幅超過(guò)10倍；(3)腎臟系膜基質(zhì)增生伴或不伴結(jié)節(jié)硬化和系膜溶解，基底膜增厚超過(guò)基線水平的50%，小動(dòng)脈透明樣變，小管間質(zhì)纖維化[46]。

4 小結(jié)與展望

目前，鼠類模型仍是大多數(shù)研究者構(gòu)建DN實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的第一選擇，最常使用的是STZ聯(lián)合高糖高脂飼料或三聯(lián)法(高能量飲食+STZ注射+單側(cè)或部分腎切除)構(gòu)建DN鼠類模型，其中db/db小鼠[(30.0±2.5)g]和Wistar大鼠、SD大鼠[(225±25)g]是使用最多的動(dòng)物，通常使用化學(xué)藥物四氧嘧啶或STZ誘導(dǎo)動(dòng)物糖尿病發(fā)病，四氧嘧啶通過(guò)選擇性破壞胰島β細(xì)胞，使胰島素分泌不足引起血糖升高，但其在早期可造成肝、腎組織中毒性損害；而STZ對(duì)肝腎損害較小，可通過(guò)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白定向破壞胰島β細(xì)胞，是目前應(yīng)該最廣的造模藥物。但是，不論是四氧嘧啶還是STZ，都存在小劑量無(wú)效、大劑量致死的問(wèn)題，用藥劑量是影響造模成功的關(guān)鍵因素，而不同的研究者使用的劑量各有不同。同時(shí)，大多數(shù)動(dòng)物模型，尤其是小鼠模型，盡管存在蛋白尿/蛋白尿和腎小球病變，但不表現(xiàn)為小管間質(zhì)纖維化，也不發(fā)展為進(jìn)行性腎功能衰竭。因此，仍然需要進(jìn)一步研究建模的給藥劑量和規(guī)范的DN成模標(biāo)準(zhǔn)。

近年來(lái)，中醫(yī)病證結(jié)合DN動(dòng)物模型的研究報(bào)告仍較少，主要是在DN成模的基礎(chǔ)上，通過(guò)動(dòng)物的皮毛、唇、眼球、耳郭、舌下脈絡(luò)、爪掌、尾根顏色等篩查出目標(biāo)證型，或者予相關(guān)證型特點(diǎn)的中藥湯劑灌胃造模，或者根據(jù)證型的血流動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)注射相關(guān)藥物以模擬證型特點(diǎn)。研究更恰當(dāng)、更準(zhǔn)確的病證結(jié)合DN動(dòng)物模型，尋求構(gòu)建與人類腎臟解剖和生理特征相似特征的動(dòng)物模型，以求能夠攻破DN發(fā)病機(jī)制的難點(diǎn)及尋求更好的防治方法，已經(jīng)成未來(lái)DN動(dòng)物模型研究發(fā)展的必然趨勢(shì)。