薛林濤 王世凱 覃 捷

(廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)與遺傳中心，南寧市 530021，電子郵箱：ltxgxh@163.com)

【提要】 卵質(zhì)內(nèi)單精子注射(ICSI)技術(shù)是治療男性不育的有效手段，但是ICSI周期完全受精失敗的發(fā)生率為2%～3%，同時(shí)男性精子嚴(yán)重畸形僅采用ICSI治療仍無(wú)法正常受精。卵子激活障礙是導(dǎo)致受精失敗的最主要因素，而卵子輔助激活可以人工誘發(fā)鈣振蕩激活卵子，促進(jìn)正常受精。近年來(lái)卵母細(xì)胞人工激活在臨床中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，成為治療ICSI受精失敗的主要輔助技術(shù)，但該技術(shù)臨床應(yīng)用的安全性仍存爭(zhēng)議。本文就人卵子輔助激活技術(shù)在ICSI受精失敗中的臨床應(yīng)用現(xiàn)狀及其研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

卵質(zhì)內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)技術(shù)是通過(guò)顯微操作將單個(gè)精子注入卵胞質(zhì)內(nèi)以完成受精，該技術(shù)的出現(xiàn)解決了男方及受精障礙等因素導(dǎo)致不育疾病的問(wèn)題，是目前治療男性不育最有效的技術(shù)手段。但I(xiàn)CSI周期中仍然有2%～3%的患者發(fā)生完全受精失敗，ICSI后卵子的受精率約為70～80%，還有20%～30%的成熟卵子即使注射精子后仍無(wú)法受精，同時(shí)男性精子形態(tài)嚴(yán)重畸形(如圓頭精子癥)僅采用ICSI治療仍無(wú)法正常受精。有研究發(fā)現(xiàn)，卵子激活障礙是導(dǎo)致ICSI受精失敗的最主要因素[1]，而卵母細(xì)胞人工激活(artificial oocyte activation,AOA)技術(shù)能夠成功誘發(fā)卵子鈣振蕩，激活卵子恢復(fù)第二次減數(shù)分裂促進(jìn)受精完成，在圓頭精子癥[2]、反復(fù)ICSI受精失敗[3]等患者中應(yīng)用可以顯著提高受精率，改善臨床結(jié)局。目前AOA在輔助生殖助孕周期中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。本文就AOA的技術(shù)原理、臨床應(yīng)用及其研究進(jìn)展做一綜述。

1 ICSI受精失敗的原因及機(jī)制

ICSI受精失敗的原因主要分為卵源性和精源性兩方面因素：(1)卵子質(zhì)量是保證受精成功的前提，只有當(dāng)卵母細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核同步成熟，才能對(duì)精子進(jìn)入卵子后釋放的因子發(fā)生充分應(yīng)答，引發(fā)鈣振蕩，激活卵母細(xì)胞。有學(xué)者對(duì)受精失敗的卵母細(xì)胞進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞染色體分布、紡錘體結(jié)構(gòu)及其他細(xì)胞器分布異常，這提示卵母細(xì)胞核質(zhì)不成熟或成熟不同步會(huì)導(dǎo)致受精失敗[4]。另外，卵母細(xì)胞的基因功能缺陷也會(huì)導(dǎo)致受精失敗，有研究發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞特異表達(dá)的蛋白激酶Wee發(fā)生純合突變可導(dǎo)致受精失敗[5]。(2)即使成熟的卵細(xì)胞在精子注射后也會(huì)發(fā)生受精失敗，這種現(xiàn)象主要是由于精子未能成功誘發(fā)鈣振蕩激活卵細(xì)胞所致，目前認(rèn)為精子磷脂酶C ζ(phospholipase C zeta，PLCζ)是誘發(fā)鈣震蕩的特異性因子[6]。精子中的PLCζ處于一種失活狀態(tài)，精子與卵子融合時(shí)開始活化，PLCζ通過(guò)分解磷脂酰肌醇4,5-雙磷酸(phosphatidylinositol-4,5-biphosphate,PIP2)產(chǎn)生肌醇1,4,5-三磷酸肌醇(inositol 1,4,5-trisphosphate,IP3)，IP3結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的特異性受體，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ca2+釋放，而Ca2+濃度的增加使PLCζ活性增強(qiáng)，進(jìn)一步正反饋調(diào)節(jié)IP3及Ca2+的釋放，使Ca2+濃度進(jìn)一步升高，當(dāng)Ca2+達(dá)到臨界濃度時(shí)，通過(guò)Ca2+通道的調(diào)節(jié)，使胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+恢復(fù)至基礎(chǔ)水平，至此鈣振蕩的單個(gè)波峰形成。PLCζ的表達(dá)異常包括表型異常和功能異常，均會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞激活失敗，同時(shí)，PLCζ的活性位點(diǎn)殘基相對(duì)保守，其突變也可能導(dǎo)致PLCζ誘導(dǎo)Ca2+能力喪失[7]。但是有研究發(fā)現(xiàn)，PLCζ基因敲除雄鼠的生育力只是降低，并非完全喪失，這提示卵子中也可能存在其他替代信號(hào)通路在PLCζ缺失的情況下起部分激活卵子的作用[8]，這有待于進(jìn)一步研究。

2 AOA治療的技術(shù)原理及臨床應(yīng)用

自然受精時(shí)精子中的PLCζ等釋放入卵子觸發(fā)鈣振蕩，而AOA技術(shù)是通過(guò)電刺激或化學(xué)制劑等方式處理卵子，激發(fā)胞外Ca2+內(nèi)流從而模擬自然受精激活卵子誘發(fā)鈣振蕩[9]，這可以在一定程度上彌補(bǔ)精卵激活障礙導(dǎo)致的缺陷，人工誘導(dǎo)卵子恢復(fù)第二次減數(shù)分裂，完成正常受精過(guò)程，從而提高受精成功率。

目前AOA技術(shù)在因男性不育因素如圓頭精子癥等所致的ICSI受精失敗患者中應(yīng)用廣泛，Taylor等[2]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于圓頭精子癥患者采用AOA技術(shù)可以克服精子頂體缺失無(wú)法激活卵子的缺陷，成功受精并獲得活產(chǎn)胎兒。Sfontouris等[10]對(duì)ICSI受精失敗的患者進(jìn)行AOA治療，發(fā)現(xiàn)其可以顯著提高受精率，同時(shí)對(duì)于通過(guò)睪丸手術(shù)取精的精子來(lái)源的ICSI周期，應(yīng)用AOA技術(shù)有助于改善受精結(jié)局[11]。Karabulut等[12]研究認(rèn)為解凍的精子經(jīng)ICSI后采用AOA治療能夠改善胚胎質(zhì)量和臨床結(jié)局，避免精子凍融導(dǎo)致的不利影響。另外還有研究采用胚胎延時(shí)攝影技術(shù)監(jiān)測(cè)ICSI卵子第二極體的排出情況，以此作為早期受精成敗的判斷標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)不能正常排出第二極體的卵子進(jìn)行AOA治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該干預(yù)措施能夠獲得正常受精并獲得理想的胚胎發(fā)育結(jié)局，并提高卵子利用率[13]。

近年來(lái)也有研究發(fā)現(xiàn)，AOA不僅能夠改善激活障礙導(dǎo)致的受精失敗，對(duì)于胚胎發(fā)育阻滯、反復(fù)周期胚胎質(zhì)量差的患者可能也有一定的治療作用。Darwish等[14]對(duì)ICSI受精后原核期發(fā)育阻滯的患者，在下一個(gè)治療周期使用鈣離子激活劑處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)受精卵可以突破阻滯進(jìn)而正常分裂；Kashir等[8]認(rèn)為對(duì)于胚胎發(fā)育阻滯、反復(fù)周期胚胎質(zhì)量差或者反復(fù)植入失敗的患者應(yīng)用AOA可以改善臨床治療結(jié)局。

3 AOA治療的研究進(jìn)展

目前臨床上常用的AOA方法包括電刺激激活法、機(jī)械激活法和化學(xué)激活法。電刺激激活法主要原理是通過(guò)電脈沖作用于卵母細(xì)胞質(zhì)膜上使其形成小孔，促進(jìn)Ca2+內(nèi)流從而激活卵母細(xì)胞[15]。機(jī)械激活法則通過(guò)在顯微鏡下反復(fù)抽吸胞漿等機(jī)械方式達(dá)到激活卵子的目的[16]?；瘜W(xué)激活法主要通過(guò)鈣離子載體等化學(xué)試劑對(duì)ICSI受精卵子進(jìn)行孵育處理，通過(guò)增加細(xì)胞膜的Ca2+通道通透性使胞外Ca2+內(nèi)流激活卵母細(xì)胞，該方法也是目前臨床應(yīng)用最為廣泛的激活方式。

鈣離子載體A23187及離子霉素是目前AOA相關(guān)研究中使用最廣泛的激活試劑，其可以誘發(fā)單次Ca2+水平波狀升高，已被多項(xiàng)研究證實(shí)可以成功激活卵子。Darwish等[14]對(duì)既往有完全受精失敗史和卵裂失敗史的不孕癥夫婦進(jìn)行ICSI后，再使用鈣離子載體A23187進(jìn)行AOA治療，發(fā)現(xiàn)受精率和卵裂率顯著改善，并有活產(chǎn)胎兒出生。Borges等[17]對(duì)不同類型來(lái)源的精子進(jìn)行ICSI后使用鈣離子載體A23187進(jìn)行AOA治療，發(fā)現(xiàn)該方法可以顯著增加手淫精子和附睪精子的受精率及胚胎發(fā)育結(jié)局。還有研究對(duì)比了行AOA治療時(shí)鈣離子載體A23187和離子霉素的激活效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在小鼠動(dòng)物模型中離子霉素對(duì)卵母細(xì)胞的激活效率優(yōu)于鈣離子載體A23187，但在人體外成熟卵子中兩種激活試劑的激活效率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[18]。但值得注意的是，有研究認(rèn)為鈣離子載體A23187、離子霉素等只能誘發(fā)單次Ca2+水平升高，并不能模擬自然受精發(fā)生的多次鈣振蕩波，而SrCl2、PLCζ理論上可誘發(fā)多重鈣振蕩，更接近自然受精過(guò)程[19]。Vanden Meerschaut等[20]對(duì)小鼠卵子進(jìn)行ICSI后，比較SrCl2、電脈沖和離子霉素的激活效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SrCl2激活效果優(yōu)于離子霉素。Fawzy等[21]比較了SrCl2和鈣離子載體A23187在ICSI后受精率低或完全不受精的男性患者中的治療效果，發(fā)現(xiàn)既往ICSI受精率低的患者使用SrCl2進(jìn)行AOA治療的臨床結(jié)局更好，而前次完全受精失敗的患者使用鈣離子載體A23187治療更有效。PLCζ作為精子特異性的卵子激活因子，也是一種理想的激活劑，Sanusi 等[22]研究證實(shí)重組人PLCζ可以有效激活小鼠卵子；而向ICSI后受精失敗的人卵母細(xì)胞顯微注射重組人PLCζ也可以激活卵子并進(jìn)一步促進(jìn)卵裂[23]。但由于目前重組人PLCζ生產(chǎn)純化的技術(shù)尚不穩(wěn)定，仍未大量生產(chǎn)，在臨床中尚未得到應(yīng)用。如何模擬自然受精狀態(tài)的鈣振蕩波的輔助激活方法，從而提高AOA治療效率是將來(lái)的研究方向。

4 AOA治療的安全性

一直以來(lái)，關(guān)于AOA治療的安全性始終是學(xué)者爭(zhēng)論的焦點(diǎn)。雖然已有研究證實(shí)AOA可以顯著改善受精結(jié)局，且已有活產(chǎn)胎兒分娩，但是化學(xué)激活劑對(duì)胚胎發(fā)育的潛在作用、非生理性卵子激活模式對(duì)胚胎基因表達(dá)以及對(duì)子代表觀遺傳的影響等，都是值得進(jìn)一步研究的問(wèn)題。

Vanden Meerschaut等[20]采用氯化鍶分別結(jié)合電刺激和離子霉素激活小鼠經(jīng)ICSI后的卵子，結(jié)果顯示兩種激活方法均可獲得健康且有生育能力的小鼠，小鼠后代未見明顯畸形。Miller等[24]對(duì)接受AOA治療后出生的新生兒進(jìn)行分析，未發(fā)現(xiàn)新生兒出生缺陷及發(fā)育異常。Vanden Meerschaut等[25]對(duì)經(jīng)AOA治療后出生的21名3～10歲兒童進(jìn)行隨訪，發(fā)現(xiàn)這些兒童的神經(jīng)發(fā)育和行為表現(xiàn)指標(biāo)均與正常兒童無(wú)明顯差異。但由于研究樣本量有限，同時(shí)缺乏針對(duì)子代遠(yuǎn)期影響的研究結(jié)果，AOA治療的安全性仍需進(jìn)一步研究，且需要嚴(yán)格把握臨床治療指征和患者知情同意原則，確保AOA技術(shù)在臨床應(yīng)用的安全性。

5 結(jié) 語(yǔ)

ICSI受精失敗后采用AOA治療可以獲得一定的臨床效果，尤其對(duì)于ICSI完全受精失敗或精子頂體形態(tài)異常患者，可以顯著改善受精結(jié)局，提高臨床治療成功率。有關(guān)AOA技術(shù)的研究正在逐步開展，研發(fā)更貼近自然受精狀態(tài)的激活模式是今后研究的趨勢(shì)，我們?cè)陉P(guān)注AOA技術(shù)帶來(lái)臨床獲益的同時(shí)也應(yīng)關(guān)注其安全性，探討該技術(shù)對(duì)子代遺傳改變及遠(yuǎn)期發(fā)育的影響，從而為AOA技術(shù)在臨床上的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。