吳居業(yè)，盧寶春，祝宇凡，賈 坤*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642； 2.廣東省獸醫(yī)臨床重大疾病綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642； 3.廣東省寵物工程技術(shù)研究中心，廣州 510642)

犬乳腺腫瘤是犬最常見(jiàn)的腫瘤之一，嚴(yán)重影響犬的生命健康，在獸醫(yī)臨床上備受關(guān)注[1]。犬乳腺腫瘤是一種具有復(fù)雜背景的異質(zhì)性疾病，該疾病主要發(fā)生在未絕育的中小型雌犬上，其中，41%～53%的病例惡性程度較高，并且腫瘤有轉(zhuǎn)移傾向，引起腫瘤的發(fā)生與多種因素的相互作用有關(guān)[2-3]。犬乳腺腫瘤的早期癥狀不明顯，并且犬乳腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚未清楚，往往確診的犬已經(jīng)處于腫瘤發(fā)生的晚期，因此從分子機(jī)制上深入探討犬乳腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。THBS1是血小板凝血酶蛋白家族(thrombospondin，THBS)中第一個(gè)被確定的成員，最初發(fā)現(xiàn)于血小板中，是可以由許多細(xì)胞合成和分泌的糖蛋白[4]。THBS1不僅能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)功能、血管形成、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-黏多糖的相互作用，還參與了復(fù)雜的細(xì)胞凋亡過(guò)程，在各類(lèi)腫瘤的凋亡機(jī)制方面起重要作用[5-7]。在前期的研究中，作者發(fā)現(xiàn)THBS1 mRNA在犬乳腺腫瘤中高表達(dá)，并且犬乳腺腫瘤組織的THBS1 mRNA表達(dá)水平與患犬的純雜品種具有顯著性相關(guān)[8]。目前，THBS1在犬臨床上少有報(bào)道，研究THBS1對(duì)犬乳腺腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制，可以為后續(xù)犬乳腺腫瘤的分子機(jī)制的深入研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 細(xì)胞及質(zhì)粒 人胚胎腎上皮細(xì)胞HEK293T、犬乳腺腫瘤細(xì)胞CHMp、慢病毒三質(zhì)粒(pCDH-CMV-MCS-3flag-TST-EF1-CopGFP-T2A-Puro、PsPaX2、PMD2.G)以及逆病毒基因沉默質(zhì)粒pSuper.Retro.Neo+GFP均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院外科教研室保存。

1.1.2 主要試劑產(chǎn)品及耗材 同源重組試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；胎牛血清FBS、高糖培養(yǎng)基DMEM和磷酸鹽緩沖液PBS購(gòu)自以色列Biological Industries公司；LipofectamineTM3000 reagent轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；通用RNA提取試劑盒購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司；PAGE凝膠快速制備試劑盒購(gòu)自上海雅酶生物科技有限公司；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自翌圣生物科技股份有限公司；鼠源單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)優(yōu)寧維生物有限公司等。

1.1.3 主要儀器 QuantStudio 5熒光定量PCR儀、NanoDropTM微量分光光度計(jì)、細(xì)胞培養(yǎng)箱、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(賽默飛世爾科技有限公司)；凝膠電泳成像系統(tǒng)、紅外雙色激光成像系統(tǒng)(香港基因有限公司)；倒置熒光顯微鏡(德國(guó)徠卡微系統(tǒng)有限公司)；恒溫培養(yǎng)箱(上海智城儀器有限公司)；核酸膠電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；流式細(xì)胞儀(貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)有限公司)等。

1.2 方 法

1.2.1 THBS1慢病毒過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)NCBI發(fā)布的犬THBS1(GenBank登錄號(hào)：XM_038441944.1)的序列及慢病毒質(zhì)粒的序列，采用同源重組方法，設(shè)計(jì)THBS1基因全長(zhǎng)CDS區(qū)的擴(kuò)增引物，CDH-THBS1-F:5′-gacaagggtaccccgctcgag-ATGGGGCTGGCCTGGGCA-3′，pCDH-THBS1-R:5′-gatccttgcggccgcggatccTTAGGAATCTCTGCATTCGTATTTCA-3′，序列小寫(xiě)部分是5′端添加的質(zhì)粒重組序列，下劃線部分分別是XhoⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)，引物由天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司合成。以犬乳腺腫瘤細(xì)胞CHMp提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以獲得THBS1基因。使用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和BamHⅠ對(duì)慢病毒質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后，根據(jù)同源重組試劑盒將目的片段與慢病毒載體連接。將同源重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在氨芐抗性瓊脂培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)后進(jìn)行菌液PCR鑒定，選取結(jié)果為陽(yáng)性的菌液樣品送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒命名為pCDH-THBS1。

1.2.2 慢病毒包裝、感染及藥物篩選穩(wěn)定細(xì)胞系 將pCDH-THBS1質(zhì)粒、pMD2.G質(zhì)粒、PsPaX2質(zhì)粒按3∶2∶2的比例用LipofectamineTM3000試劑共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中進(jìn)行慢病毒包裝。轉(zhuǎn)染48 h后收集慢病毒液感染CHMp細(xì)胞。用不同終濃度(1、2、4、6、8、10、12 μg·mL-1)嘌呤霉素篩選CHMp細(xì)胞的嘌呤霉素最適殺滅濃度，培養(yǎng)48 h后細(xì)胞基本死光的最低濃度即為嘌呤霉素最適篩選濃度。向感染慢病毒的CHMp細(xì)胞中加入篩選好濃度的嘌呤霉素，進(jìn)行篩選直至CHMp細(xì)胞基本不死亡，篩選得到的THBS1慢病毒過(guò)表達(dá)細(xì)胞系命名為T(mén)HBS1-CHMp、慢病毒空載細(xì)胞系命名為pCDH-CHMp。

1.2.3 靶向THBS1的沉默載體構(gòu)建 根據(jù)犬的THBS1基因序列，設(shè)計(jì)靶向THBS1基因的特異寡肽核苷酸序列引物，同時(shí)設(shè)計(jì)了一條非特異的對(duì)照序列，具體序列如表1。將合成的寡核苷酸序列通過(guò)PCR反應(yīng)生成雙鏈核苷酸延伸物：配制正反義鏈核苷酸各2 μL、10xDNA連接酶buffer 5 μL和ddH2O 41 μL的體系，在PCR儀中設(shè)置相應(yīng)程序進(jìn)行連接反應(yīng)，反應(yīng)程序：1)95 ℃反應(yīng)10 min；2)從95 ℃開(kāi)始每8 s下降0.1 ℃，進(jìn)行700個(gè)循環(huán)；3)得到核苷酸延伸物。使用內(nèi)切酶BglⅡ和HindⅢ對(duì)沉默質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后與核苷酸延伸物進(jìn)行連接，得到沉默重組質(zhì)粒。

表1 靶向THBS1基因的寡核苷酸序列

1.2.4 沉默重組質(zhì)粒的鑒定及轉(zhuǎn)染 得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞，在氨芐抗性培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，取陽(yáng)性單菌落進(jìn)行增殖培養(yǎng)后，提取重組質(zhì)粒。使用EcoRI和XhoI內(nèi)切酶對(duì)沉默重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，將酶切鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，將序列正確的重組質(zhì)粒用LipofectamineTM3000試劑共轉(zhuǎn)染到CHMp細(xì)胞中，得到shRNA-THBS1-CHMp和shRNA-NC-CHMp細(xì)胞系。

1.2.5 CCK-8試驗(yàn)檢測(cè)THBS1對(duì)CHMp細(xì)胞增殖能力的影響 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，將細(xì)胞密度稀釋至1×103·100 μL-1，接種于 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，設(shè)置3個(gè)重復(fù)組，以接種細(xì)胞的時(shí)間定位為0 h，向細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入10 μL的CCK Solution，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)OD值。每隔24 h，重復(fù)上述操作，直至72 h，以時(shí)間(h)為橫坐標(biāo)，細(xì)胞OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，并根據(jù)公式：[(試驗(yàn)孔—空白孔)/(對(duì)照孔—空白孔)]×100%，計(jì)算各個(gè)細(xì)胞的存活率。

1.2.6 劃痕試驗(yàn)檢測(cè)THBS1對(duì)CHMp細(xì)胞遷移能力的影響 將細(xì)胞密度稀釋成1×106·孔-1，接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，用10 μL槍頭垂直于背面所畫(huà)的橫線，對(duì)貼壁細(xì)胞進(jìn)行劃痕，然后用PBS將劃痕劃下的細(xì)胞洗滌干凈，在顯微鏡下拍照。加入無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，分別在12和24 h后再次拍照，結(jié)果用Image J軟件分析細(xì)胞遷移的面積，通過(guò)細(xì)胞遷移面積的變化判斷THBS1對(duì)CHMp細(xì)胞遷移能力的影響。

1.2.7 Transwell試驗(yàn)檢測(cè)THBS1對(duì)CHMp細(xì)胞侵襲能力的影響 往Transwell小室中央加入60 μL稀釋好的基質(zhì)膠，將Transwell小室置于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行風(fēng)干，待Matrigel基質(zhì)膠凝固后，將小室中的殘余液體吸出，往小室中加入200 μL稀釋好的細(xì)胞懸液(5×105·mL-1)。在24孔板中加入500 μL完全培養(yǎng)基，然后將 Transwell小室放入24孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。經(jīng)過(guò)漂洗、固定、染色液后。用棉簽輕輕擦去小室內(nèi)膜上未侵襲成功的細(xì)胞，在顯微鏡下觀察濾膜底附著的細(xì)胞數(shù)并拍照，選取5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.8 THBS1對(duì)CHMp細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響 將細(xì)胞密度稀釋成1×106·孔-1，接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，參照細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒收集細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞固定、碘化丙啶染色液的配制及染色，最后通過(guò)流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)紅色熒光，采用FlowJo軟件分析細(xì)胞DNA含量情況。

1.2.9 THBS1對(duì)CHMp細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的影響 參照Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，使用原位熒光檢測(cè)方法，將細(xì)胞懸液的密度稀釋成5×105·mL-1，接種于48孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液和5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻。再加入10 μL碘化丙啶染色液，輕輕晃動(dòng)混勻，室溫避光孵育20 min，置于冰浴中，隨即在熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.10 qRT-PCR檢測(cè)THBS1對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的mRNA表達(dá)量的影響 提取各個(gè)細(xì)胞的總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，qRT-PCR檢測(cè)Bcl-2、Bax和p53 3種因子的mRNA，以ACTB基因作為內(nèi)參基因，各因子的引物序列如表2，反應(yīng)條件：1)95 ℃預(yù)變性30 s；2)循環(huán)反應(yīng)：95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；3)熔解曲線：95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s。每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)，使用2-ΔΔCt方法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表2 qRT-PCR所用的引物

1.2.11 Western blot檢測(cè)THBS1對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響 提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，加入 SDS上樣緩沖液，用沸水煮樣10 min，冷卻至室溫后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，經(jīng)過(guò)洗膜、封閉、孵育鼠源單克隆抗體、回收抗體、洗膜、孵育抗鼠二抗等操作后，進(jìn)行Western blot分析Bcl-2、Bax、和P53蛋白的表達(dá)量。Western blot的結(jié)果通過(guò)Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值，根據(jù)目的蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參蛋白條帶的灰度值的比值算出相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 THBS1過(guò)表達(dá)細(xì)胞系及沉默表達(dá)細(xì)胞系的構(gòu)建

對(duì)CHMp細(xì)胞的嘌呤霉素最適殺滅濃度進(jìn)行篩選得出最適篩選濃度為4 μg·mL-1。慢病毒液感染CHMp細(xì)胞后，用最適濃度的嘌呤霉素進(jìn)行篩選得到慢病毒穩(wěn)定過(guò)表達(dá)細(xì)胞系。將靶向THBS1基因的核苷酸延伸物與沉默質(zhì)粒進(jìn)行連接，使用雙酶切方法對(duì)沉默重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖1，陽(yáng)性重組質(zhì)粒雙酶切后，在約281 bp大小處有條帶，符合陽(yáng)性重組沉默質(zhì)粒雙酶切后的目的條帶；而沉默空載質(zhì)粒雙酶切后大約在1 200 bp有條帶，在約281 bp大小處的沒(méi)有條帶。將沉默重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)CHMp細(xì)胞得到THBS1沉默表達(dá)細(xì)胞系。

M. DS 2000 DNA Marker；1. shRNA-THBS1；2. shRNA-NC；3. pSuper.Retro.Neo+GFP質(zhì)粒M. DS 2000 DNA Marker; 1. shRNA-THBS1; 2. shRNA-NC; 3. pSuper.Retro.Neo+GFP plasmid圖1 雙酶切法鑒定沉默重組質(zhì)粒Fig.1 Identification of silent recombinant plasmids by double-enzyme digestion

2.2 CCK-8試驗(yàn)檢測(cè)THBS1對(duì)CHMp細(xì)胞增殖能力的影響

通過(guò)連續(xù)4 d的檢測(cè)，用測(cè)量的OD值變化以及細(xì)胞存活率反映細(xì)胞的增殖情況，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線如圖2A所示，細(xì)胞存活率如圖2B所示：在第3天檢測(cè)的細(xì)胞OD值中，過(guò)表達(dá)組THBS1-CHMp細(xì)胞的OD值和存活率極顯著(P<0.01)高于CHMp和pCDH-CHMp細(xì)胞，表明在THBS1過(guò)表達(dá)的CHMp細(xì)胞中，細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)；而沉默組shRNA-THBS1-CHMp細(xì)胞的OD值和存活率明顯低于CHMp和shRNA-NC-CHMp細(xì)胞(P<0.01)，表明在沉默THBS1表達(dá)的CHMp細(xì)胞中，細(xì)胞的增殖能力明顯減弱。

2.3 劃痕試驗(yàn)檢測(cè)THBS1對(duì)CHMp細(xì)胞遷移能力的影響

各個(gè)細(xì)胞劃痕后的橫向遷移結(jié)果如圖3A和3B所示。通過(guò)Image J軟件分析各個(gè)細(xì)胞劃痕后的橫向遷移面積的變化，結(jié)果如圖3C所示：在THBS1過(guò)表達(dá)組中，劃痕間隔12 h后，THBS1-CHMp細(xì)胞的橫向遷移面積與CHMp和pCDH-CHMp細(xì)胞相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，在劃痕間隔24 h后，THBS1-CHMp細(xì)胞的橫向遷移面積明顯大于CHMp和pCDH-CHMp細(xì)胞(P<0.01)；在THBS1沉默表達(dá)組中(3D圖)，劃痕間隔12和24 h后測(cè)量shRNA-THBS1-CHMp細(xì)胞的橫向遷移面積均顯著小于CHMp和shRNA-NC-CHMp細(xì)胞的橫向遷移面積(P<0.05,P<0.01)。

A.5種細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；B.5種細(xì)胞的細(xì)胞存活率。*.P<0.05, **.P<0.01,***.P<0.01,下同A.Cell growth curves of five types of cells; B.Cell surviving rate of five types of cell. *.P<0.05, **.P<0.01,***.P<0.01, the same as below圖2 THBS1對(duì)CHMp細(xì)胞增殖能力的影響Fig.2 The effect of THBS1 on the proliferation ability of CHMp cells

A.過(guò)表達(dá)組細(xì)胞劃痕后鏡下圖(100×)；B.沉默表達(dá)組細(xì)胞劃痕后鏡下圖(200×)；C.過(guò)表達(dá)組細(xì)胞劃痕后的遷移面積；D.沉默表達(dá)組細(xì)胞劃痕后的遷移面積A.The micrograph of the cells in the overexpression group after scratching (100×); B. The micrograph of the cells in the silenced expression group after scratching (200×); C. The migration area of cells in overexpression group after scratching; D. The migration area of cells in the silenced expression group after scratching圖3 細(xì)胞劃痕試驗(yàn)的結(jié)果Fig.3 Results of cell scratch test

2.4 Transwell試驗(yàn)檢測(cè)THBS1對(duì)CHMp細(xì)胞侵襲能力的影響

在顯微鏡下觀察各個(gè)細(xì)胞系侵襲的細(xì)胞數(shù)，結(jié)果如圖4A、4B所示。選取5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果如圖4C所示：過(guò)表達(dá)組THBS1-CHMp細(xì)胞的侵襲數(shù)量均明顯多于CHMp細(xì)胞和pCDH-CHMp細(xì)胞(P<0.01)；而沉默組shRNA-THBS1-CHMp細(xì)胞的侵襲數(shù)量均明顯少于CHMp和shRNA-NC-CHMp細(xì)胞(P<0.05)。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)THBS1對(duì)CHMp細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞周期分布情況結(jié)果如圖5A～F所示。將每種細(xì)胞的3個(gè)重復(fù)按G0/G1期、S期、G2/M期進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果如圖5G所示：在THBS1過(guò)表達(dá)組中，THBS1-CHMp細(xì)胞在G0/G1期的細(xì)胞數(shù)量的占比百分量均顯著少于CHMp細(xì)胞和pCDH-CHMp細(xì)胞在G0/G1期的細(xì)胞數(shù)量的占比百分量(P<0.01)，而THBS1-CHMp細(xì)胞的S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)量的占比百分量卻明顯多于對(duì)照組和空載對(duì)照組(P<0.01)；在沉默THBS1表達(dá)組中，shRNA-THBS1-CHMp細(xì)胞在G0/G1期細(xì)胞數(shù)量的占比百分量均顯著多于對(duì)照組CHMp細(xì)胞和空載組shRNA-NC-CHMp細(xì)胞(P<0.01)，而shRNA-THBS1-CHMp細(xì)胞的S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)量的占比百分量均顯著少于對(duì)照組和空載對(duì)照組(P<0.01)。

A.過(guò)表達(dá)組細(xì)胞侵襲鏡下圖(200×)；B.沉默表達(dá)組細(xì)胞侵襲鏡下圖(200×)；C.各細(xì)胞侵襲能力的比較A. Invasion microscope of cells in overexpression group (200×); B. Invasion microscope of cells in the silenced expression group (200×); C. Comparison of the invasive ability of each cell圖4 Transwell試驗(yàn)檢測(cè)THBS1對(duì)CHMp細(xì)胞侵襲能力的影響Fig.4 Transwell assay detects the effect of THBS1 on the invasive ability of CHMp cells

A～C.過(guò)表達(dá)組細(xì)胞周期分布情況；D～F.沉默表達(dá)組細(xì)胞周期分布情況；G.5種細(xì)胞的周期分布情況比較A-C. Cell cycle distribution in overexpression group; D-F. Cell cycle distribution of silent expression group; G. Comparison of cycle distribution of five types of cells圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)THBS1對(duì)CHMp細(xì)胞周期的影響Fig.5 The effect of THBS1 on the cell cycle of CHMp detected by flow cytometry

2.6 THBS1對(duì)CHMp細(xì)胞凋亡的影響

通過(guò)Annexin V-FITC和碘化丙啶雙染處理細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況如圖6A所示，綠色熒光：Annexin V-FITC染色陽(yáng)性細(xì)胞；紅色熒光：PI染色陽(yáng)性細(xì)胞。進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的結(jié)果如圖6B所示：過(guò)表達(dá)組THBS1-CHMp細(xì)胞的細(xì)胞凋亡數(shù)量均明顯少于對(duì)照組CHMp細(xì)胞和空載組pCDH-CHMp細(xì)胞(P<0.01)；而沉默試驗(yàn)組shRNA-THBS1-CHMp細(xì)胞的細(xì)胞凋亡數(shù)量均明顯多于CHMp和shRNA-NC-CHMp細(xì)胞(P<0.01)。

2.7 qRT-PCR檢測(cè)與細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的mRNA表達(dá)量

為了進(jìn)一步探討THBS1在細(xì)胞凋亡方面的調(diào)控作用，采用qRT-PCR方法檢測(cè)了p53、Bcl-2和Bax的mRNA表達(dá)量，結(jié)果如圖7所示：過(guò)表達(dá)試驗(yàn)組THBS1-CHMp細(xì)胞的p53和Bcl-2 mRNA表達(dá)量均明顯增高，結(jié)果均具有顯著性差異(P<0.01)，而B(niǎo)ax mRNA的表達(dá)量明顯減少(P<0.01)；在沉默試驗(yàn)組shRNA-THBS1-CHMp細(xì)胞中，p53 mRNA和Bcl-2 mRNA的表達(dá)量均明顯減少(P<0.01)，而B(niǎo)ax mRNA的表達(dá)量明顯增加(P<0.01)。

2.8 Western blot檢測(cè)與細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)量

Western blot方法檢測(cè)p53、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)量的結(jié)果如圖8A所示。通過(guò)Image J軟件對(duì)Western blot的結(jié)果進(jìn)行灰度值分析，以GAPDH作為內(nèi)參蛋白，對(duì)p53、Bcl-2和Bax蛋白進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量的分析，結(jié)果如圖8B所示：過(guò)表達(dá)試驗(yàn)組THBS1-CHMp細(xì)胞的p53 和Bcl-2 蛋白表達(dá)量均明顯增高(P<0.01)，而B(niǎo)ax 蛋白的表達(dá)量明顯減少(P<0.01)；在沉默試驗(yàn)組shRNA-THBS1-CHMp細(xì)胞中，p53 和Bcl-2 蛋白的表達(dá)量均明顯減少(P<0.01)，而B(niǎo)ax蛋白的表達(dá)量明顯增加，結(jié)果具有顯著性差異(P<0.01)。

A. Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)染色效果圖(100×)；B. 凋亡情況的比較A. The staining effect of Annexin V-FITC and propidium iodide (PI)(100×); B. Comparison of apoptosis of various cells圖6 THBS1對(duì)CHMp細(xì)胞凋亡的影響Fig.6 The effect of THBS1 on apoptosis of CHMp cells

圖7 qRT-PCR檢測(cè)與細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的mRNA表達(dá)量Fig.7 mRNA expression of apoptosis-related factors detected by qRT-PCR

3 討 論

近年來(lái)，隨著犬?dāng)?shù)量的增多，犬乳腺腫瘤病例中出現(xiàn)的頻率越來(lái)越高，該病也得到了寵物主人和寵物醫(yī)生的密切關(guān)注。目前，獸醫(yī)技術(shù)水平發(fā)展有限，也反映出相關(guān)科學(xué)巨大的研究空間[9]。THBS1作為一種細(xì)胞膜表面的黏附蛋白，通過(guò)影響腫瘤微環(huán)境從而影響多種癌癥的發(fā)生發(fā)展[10]。基于THBS1與犬乳腺腫瘤的關(guān)系未知，研究THBS1對(duì)犬乳腺腫瘤的影響具有重要意義，為研究THBS1對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞CHMp的影響提供了材料和平臺(tái)，同時(shí)為犬乳腺腫瘤的其他分子機(jī)制研究提供了參考。

3.1 THBS1對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響

犬乳腺腫瘤發(fā)展的過(guò)程表現(xiàn)出細(xì)胞無(wú)序地增殖，即細(xì)胞的增殖能力變強(qiáng)，細(xì)胞瘋狂地增殖以滿足腫瘤塊的生長(zhǎng)和腫瘤微環(huán)境的形成。研究表明，犬乳腺腫瘤往往會(huì)表現(xiàn)出遷移性，根據(jù)腫瘤的分級(jí)，惡性腫瘤還表現(xiàn)出明顯的侵襲性，利于腫瘤在機(jī)體內(nèi)的發(fā)展[11-13]。據(jù)報(bào)道，THBS1可以促進(jìn)癌細(xì)胞遷移，參與腫瘤的血管形成，與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[14-15]。本研究在細(xì)胞水平上探討了THBS1對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。通過(guò)CCK-8試驗(yàn)和平板克隆形成試驗(yàn)、劃痕試驗(yàn)、Transwell試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)THBS1能有效促進(jìn)犬乳腺腫瘤細(xì)胞CHMp的增殖、遷移、侵襲，而沉默THBS1表達(dá)能有效抑制CHMp細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲。本研究結(jié)果與其他人報(bào)道THBS1在其他腫瘤上的作用相一致，也證明了THBS1在犬乳腺腫瘤上的潛在作用[6,16]。綜上表明，THBS1能夠影響犬乳腺腫瘤細(xì)胞CHMp的增殖、遷移、侵襲生物學(xué)功能，進(jìn)而表明THBS1潛在參與影響犬乳腺腫瘤進(jìn)展。

A.Western blot檢測(cè)與細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)量(1.THBS1-CHMp；2.pCDH-CHMp；3.CHMp；4.shRNA-NC-CHMp；5.shRNA-THBS1-CHMp)；B.各細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)量比較A. Western blot detects the expression of apoptosis-related proteins (1. THBS1-CHMp; 2. pCDH-CHMp; 3. CHMp; 4. shRNA-NC-CHMp; 5. shRNA-THBS1-CHMp)； B. Comparison of the expression levels of apoptosis-related proteins in various cells圖8 THBS1對(duì)CHMp細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響Fig.8 The effect of THBS1 on the expression of apoptosis-related proteins in CHMp cells

3.2 THBS1對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞CHMp細(xì)胞周期的影響

在正常的細(xì)胞周期中，細(xì)胞在G0/G1期會(huì)進(jìn)行大量的物質(zhì)合成，為DNA的合成做準(zhǔn)備，在S期開(kāi)始合成DNA和組蛋白，細(xì)胞在G2/M期DNA復(fù)制結(jié)束并且處于有絲分裂之間的間隙，即根據(jù)細(xì)胞S+M時(shí)期的百分比就可以判斷處理后的細(xì)胞增殖能力。而腫瘤的形成是一種無(wú)序生長(zhǎng)的過(guò)程，其細(xì)胞周期分布受到影響，進(jìn)而影響細(xì)胞的DNA合成，最終導(dǎo)致細(xì)胞增殖特性的改變而影響腫瘤的發(fā)展[17-18]。本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，得出在THBS1過(guò)表達(dá)的CHMp細(xì)胞中G0/G1期的細(xì)胞百分比明顯減少，S期+G2/M期的細(xì)胞百分比增加；而沉默THBS1表達(dá)后CHMp細(xì)胞在G0/G1期的細(xì)胞百分比明顯增多，S期+G2/M期的細(xì)胞百分比減少。細(xì)胞的S期+G2/M期是DNA合成的關(guān)鍵時(shí)期，這個(gè)時(shí)期被阻斷，或者細(xì)胞周期停滯在G0/G1期，表明正常的細(xì)胞周期被破壞，即THBS1能夠影響犬乳腺腫瘤細(xì)胞CHMp的細(xì)胞周期分布，進(jìn)而影響犬乳腺腫瘤細(xì)胞CHMp的增殖特性，最終影響腫瘤的形成。

3.3 THBS1對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞凋亡的影響

在腫瘤進(jìn)展中，細(xì)胞促凋亡基因和抑凋亡基因的表達(dá)往往出現(xiàn)異常，進(jìn)而導(dǎo)致相關(guān)凋亡信號(hào)通路受到抑制。本研究通過(guò)原位熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在THBS1過(guò)表達(dá)的CHMp細(xì)胞中，凋亡細(xì)胞的數(shù)量明顯減少；而在沉默THBS1表達(dá)的CHMp細(xì)胞中，凋亡細(xì)胞的數(shù)量明顯增多。Bcl-2、Bax和p53是與細(xì)胞凋亡相關(guān)的研究熱點(diǎn)分子，在癌細(xì)胞凋亡方面起著重要作用，p53基因還具有幫助細(xì)胞基因修復(fù)缺陷的功能，這點(diǎn)在腫瘤中表現(xiàn)最明顯，是機(jī)體維持自身基因復(fù)制穩(wěn)定的關(guān)鍵[19-20]。本研究通過(guò)qRT-PCR和Western blot試驗(yàn)進(jìn)一步探討THBS1的異常表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)因子表達(dá)影響，發(fā)現(xiàn)THBS1過(guò)表達(dá)后，CHMp細(xì)胞中p53和Bcl-2的表達(dá)量均明顯增高，而B(niǎo)ax的表達(dá)量明顯減少；在沉默THBS1后，CHMp細(xì)胞中p53和Bcl-2的表達(dá)量均明顯減少，而B(niǎo)ax的表達(dá)量明顯增加。表明THBS1的異常表達(dá)會(huì)影響CHMp細(xì)胞中p53、Bcl-2和Bax表達(dá)量，這與前人在相關(guān)癌癥上的報(bào)道相一致。即THBS1通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的表達(dá)進(jìn)而影響凋亡相關(guān)通路，在犬乳腺腫瘤發(fā)揮重要作用，最終導(dǎo)致腫瘤的形成。以上結(jié)果與前面的犬乳腺腫瘤細(xì)胞生物學(xué)功能和細(xì)胞周期的檢測(cè)結(jié)果相符，更加證明了THBS1在參與犬乳腺腫瘤發(fā)生發(fā)展方面的重要作用。

4 結(jié) 論

本研究證實(shí)了THBS1的異常表達(dá)能夠影響犬乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲、細(xì)胞周期以及細(xì)胞凋亡。此外，THBS1異常表達(dá)可以調(diào)控細(xì)胞凋亡關(guān)鍵因子p53、Bcl-2和Bax的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控犬乳腺腫瘤的細(xì)胞凋亡通路，最終影響犬乳腺腫瘤的發(fā)展。