基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討七味白術(shù)散治療脾虛泄瀉的潛在機(jī)制

張慧婷 楊文波 沈丹平 馬 聰

腹瀉是我國(guó)嬰幼兒最常見(jiàn)的疾病之一，臨床多表現(xiàn)為大便次數(shù)增多和大便性狀改變，按照病程長(zhǎng)短可分為急性腹瀉、遷延性腹瀉和慢性腹瀉[1-3]。該病歸屬于中醫(yī)學(xué)泄瀉范疇，其中脾胃虛弱是泄瀉發(fā)生的重要病因病機(jī)，臨床常以病程較長(zhǎng)、大便稀溏為辨證要點(diǎn)[4]，代表方為七味白術(shù)散[5]。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，構(gòu)建七味白術(shù)散成分-靶點(diǎn)及網(wǎng)絡(luò)，分析其治療脾虛泄瀉的潛在機(jī)制，為實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其具體機(jī)制提供參考。

1 資料與方法

1.1 七味白術(shù)散藥物成分及靶點(diǎn)篩選 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP，https://tcmspw.com/index.php）、中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMID，http://119.3.41.228:8000/tcmid/）查找七味白術(shù)散各藥物組成的具體成分，對(duì)所搜集到的化學(xué)成分進(jìn)行整合，以口服生物利用度（OB）≥30%[6]，類藥性（DL）≥0.18[7]為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，整理出具有活性成分的中藥化合物。隨后在上兩種數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)各成分的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行查找。

1.2 脾虛泄瀉相關(guān)靶點(diǎn)構(gòu)建 在人類基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（GeneCards，https://www.genecards.org/）、人類孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)（OMIM，https://omim.org/）中，以“Diarrhea”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，查找脾虛泄瀉相關(guān)靶點(diǎn)信息，構(gòu)建七味白術(shù)散-脾虛泄瀉-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 七味白術(shù)散潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 取七味白術(shù)散各藥物的潛在靶點(diǎn)和脾虛泄瀉相關(guān)靶點(diǎn)相交集的部分，作為七味白術(shù)散治療脾虛泄瀉的活性化合物和潛在治療靶點(diǎn)，再利用網(wǎng)絡(luò)圖編輯軟件（Cytoscape）進(jìn)一步構(gòu)建七味白術(shù)散藥物-脾虛泄瀉-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 蛋白質(zhì)互作分析網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用臨近基因重復(fù)實(shí)例的搜索工具（STRING，https://string-db.org/）對(duì)七味白術(shù)散治療脾虛泄瀉潛在靶點(diǎn)進(jìn)蛋白質(zhì)互作分析，為了獲得更高的準(zhǔn)確性，選取了最高置信度0.9進(jìn)行評(píng)分。利用Cytoscape 找出相關(guān)度較高的基因，并構(gòu)建靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 七味白術(shù)散-脾虛泄瀉-靶點(diǎn)圖構(gòu)建 在得到七味白術(shù)散與脾虛泄瀉的共同靶點(diǎn)后，我們篩選出七味白術(shù)散治療脾虛泄瀉的有效活性成分，并使用Cytoscape 構(gòu)建了七味白術(shù)散-脾虛泄瀉-關(guān)鍵基因靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 關(guān)鍵靶點(diǎn)功能注釋 利用基因注釋與分析數(shù)據(jù)庫(kù)（Metascape，https://metascape.org/）對(duì)潛在治療靶點(diǎn)進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集及基因本體論（GO）功能分析，并使用微生信數(shù)據(jù)庫(kù)（Bioinformatics，http://www.bioinformatics.com.cn/）對(duì)主要KEGG 通路和GO 功能進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 七味白術(shù)散活性成分篩選結(jié)果 從TCMSP、TCMID 中檢索七味白術(shù)散各組成的化學(xué)成分，其中人參190 種，茯苓34 種，白術(shù)55 種，甘草280 種，藿香94 種，木香106 種，葛根18 種，共檢索出化合物777 種。以O(shè)B≥30%，DL≥0.18 為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，并去除重復(fù)成分后共計(jì)157 種，其中人參22 種，茯苓15 種，白術(shù)7 種，甘草92 種，藿香11 種，木香6 種，葛根4 種。

2.2 七味白術(shù)散藥物潛在靶點(diǎn)和脾虛泄瀉疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選藥物各活性組分的治療靶點(diǎn)。我們共獲得了七味白術(shù)散66 個(gè)治療脾虛泄瀉的有效活性成分，通過(guò)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（Uniprot）對(duì)篩選出來(lái)的靶點(diǎn)進(jìn)行分析和注釋，轉(zhuǎn)換成基因名并刪除重復(fù)值后，獲得潛在治療靶點(diǎn)共261個(gè)。在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中以關(guān)鍵詞“Diarrhea”檢索疾病靶點(diǎn)，以相關(guān)性得分（Relevance score）≥10 為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，同時(shí)在OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，兩組數(shù)據(jù)合并，去除重復(fù)值后共獲得疾病靶點(diǎn)348 個(gè)。將七味白術(shù)散靶點(diǎn)與脾虛泄瀉靶點(diǎn)合并做圖，最終構(gòu)建出七味白術(shù)散-脾虛泄瀉-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖1。

圖1 七味白術(shù)散-脾虛泄瀉-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 七味白術(shù)散治療脾虛泄瀉靶點(diǎn)構(gòu)建 運(yùn)用Bioinformatics 數(shù)據(jù)庫(kù)繪制維恩圖（見(jiàn)圖2），得出七味白術(shù)散潛在作用靶點(diǎn)與脾虛泄瀉疾病靶點(diǎn)的共同靶點(diǎn)共47 個(gè)，這47 個(gè)共同靶點(diǎn)可能是七味白術(shù)散治療脾虛泄瀉的潛在靶點(diǎn)。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步篩選，最終構(gòu)建出七味白術(shù)散-脾虛泄瀉的靶點(diǎn)圖，見(jiàn)圖3。

圖2 七味白術(shù)散治療脾虛泄瀉潛在共同靶點(diǎn)維恩圖

圖3 七味白術(shù)散-脾虛泄瀉-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果 將七味白術(shù)散與脾虛泄瀉映射到的47 個(gè)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行分析，利用String數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（見(jiàn)圖4）。其中節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)蛋白，邊表示蛋白之間相互關(guān)系。使用Cytoscape3.7.2 軟件cytoHubba 插件，然后以相關(guān)度（Degree）≥兩倍的中位數(shù)，并且相似度（Closeness）和中間性（Betweenness）＞中位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行分析和篩選，獲得了12 個(gè)關(guān)鍵基因。繪制這12 個(gè)核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)如下（見(jiàn)圖5）。這12 個(gè)靶點(diǎn)主要涉及到凋亡、趨化、炎癥、細(xì)胞周期、增殖等方面，并且可能為七味白術(shù)散治療脾虛泄瀉的核心靶點(diǎn)。

圖4 七味白術(shù)散治療脾虛泄瀉治療靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 七味白術(shù)散治療脾虛泄瀉核心靶點(diǎn)互作關(guān)系圖

2.5 七味白術(shù)散治療脾虛泄瀉核心靶點(diǎn)構(gòu)建 在得到12 個(gè)核心靶點(diǎn)之后，進(jìn)一步篩選七味白術(shù)散各藥物中的活性成分，可以得出共有8 個(gè)活性成分映射到這12 個(gè)核心靶點(diǎn)上面。通過(guò)整理可以構(gòu)建出七味白術(shù)散-脾虛泄瀉-核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖6。

圖6 七味白術(shù)散-脾虛泄瀉-核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 KEGG 分析及GO 分析結(jié)果 使用Metascape將47 個(gè)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路分析及GO 功能富集分析，KEGG 分子中有14 條顯著意義的通路，利用Bioinformatics 繪制成氣泡圖可以看出，Pathways in cancer 是富集數(shù)目最多、最顯著的通路（見(jiàn)圖7）。GO 分析分別從分子功能、生物進(jìn)程、細(xì)胞組分三個(gè)方面進(jìn)行。以P＜0.01、最小計(jì)數(shù)為3、富集因子＞1.5 為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選并做圖（見(jiàn)圖8）。在分子功能方面，一共富集到17 條顯著條目，排名靠前的主要有細(xì)胞因子受體結(jié)合、脂質(zhì)結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合等；在生物進(jìn)程方面富集到20 條顯著條目，顯著性較大的主要有對(duì)有細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控、對(duì)有毒物質(zhì)的反應(yīng)、對(duì)傷害的反應(yīng)等；在細(xì)胞組分方面富集到10 條顯著條目，主要有膜筏、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)等。

圖7 七味白術(shù)散治療脾虛泄瀉靶點(diǎn)KEGG 圖

圖8 七味白術(shù)散治療脾虛泄瀉GO 富集BP、CC、MF 三合一圖

3 討論

根據(jù)蛋白互作分析圖可以看出，七味白術(shù)散治療脾虛泄瀉的潛在靶點(diǎn)有47 個(gè)，進(jìn)一步篩選出的核心靶點(diǎn)有12 個(gè)。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）能夠調(diào)節(jié)人體免疫，過(guò)度激活或失活均會(huì)使人體產(chǎn)生疾病[8]，同時(shí)STAT3 在自噬、炎癥反應(yīng)等方面也有作用[9]。白介素1β（IL-1β）是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)，對(duì)宿主反應(yīng)和病原體的抵抗起到了至關(guān)重要的作用[10]，在炎癥發(fā)生時(shí)，IL-1β 會(huì)通過(guò)白介素6（IL-6）介導(dǎo)鐵調(diào)素的表達(dá)來(lái)參與炎癥反應(yīng)[11]。白介素4（IL-4）在人體中有免疫調(diào)節(jié)和抗炎的作用，目前對(duì)IL-4 靶點(diǎn)的研究主要用于治療變應(yīng)性疾病方面[12]。研究表明，IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、趨化因子8（CXCL8）與腹瀉的關(guān)系非常密切。腹瀉發(fā)生時(shí)，患者體內(nèi)炎癥因子IL-6 會(huì)大量釋放[13]，在診斷腹瀉時(shí)，血液中IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）的水平亦可提供依據(jù)[14]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，腹瀉減輕時(shí)，小鼠體內(nèi)IL-6 水平會(huì)降低，IL-2、IL-4 水平會(huì)升高[15]，腹瀉在有效治療后，IL-1β 和TNF 的水平會(huì)明顯降低[16]，CXCL8 的釋放會(huì)導(dǎo)致腸上皮屏障功能的喪失而發(fā)生腹瀉[17]。

研究表明，表皮生長(zhǎng)因子（EGF）和表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）能夠保護(hù)胃腸道黏膜，釋放營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)胃腸道黏膜修復(fù)[18]。相反，EGF 的受體抑制劑也是引起腹瀉的重要原因[19]。內(nèi)整流K+通道（AKT1）和腫瘤蛋白P53（TP53）是研究較多的癌基因，在大多數(shù)癌癥中均有表達(dá)[20-21]，目前尚未檢索到兩者與腹瀉的直接關(guān)系，但在癌癥患者的腹瀉治療中仍起著作用[22]。綜上所述，這些核心靶點(diǎn)主要在抗炎、細(xì)胞增殖、凋亡、自噬和細(xì)胞周期等方面起作用，并與脾虛泄瀉存在密切的相關(guān)性。

在KEGG 通路富集分析中，Pathways in cancer是七味白術(shù)散治療脾虛泄瀉的潛在核心通路。Pathways in cancer 是癌癥治療中重要的信號(hào)通路[23]，包括了血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、TP53、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活蛋白（Jak-STAT）等信號(hào)通路，本研究所富集到 的 核 心 靶 點(diǎn)IL-6、STAT1、STAT3、EGF、VEGF、TP53 等均包含于其中，因此Pathways in cancer 成為富集分?jǐn)?shù)最高的通路。

在GO 功能分析中，細(xì)胞因子活性是富集到的主要細(xì)胞功能活動(dòng)，而細(xì)胞因子與炎癥性疾病的發(fā)生有著密切的關(guān)系[24]。在蛋白互作分析中，分析到的核心靶點(diǎn)如TNF、STAT3、IL4、IL-6 等均與炎癥反應(yīng)相關(guān)。細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控是GO 功能富集到的主要生物進(jìn)程，研究表明大腸桿菌在胃腸道感染中能夠抑制腸細(xì)胞的增殖，VEGF 對(duì)增殖的負(fù)調(diào)控是動(dòng)物胃腸炎的發(fā)生機(jī)制之一[24]，目前暫未發(fā)現(xiàn)有文獻(xiàn)提出這些生物進(jìn)程在脾虛泄瀉方面具有作用，但為實(shí)驗(yàn)研究這些功能在脾虛泄瀉方面的作用提供了思路。膜筏是GO 富集到的主要細(xì)胞組分之一，研究表明，在結(jié)腸炎和細(xì)菌相關(guān)性腹瀉中，膜筏對(duì)于細(xì)菌的粘附和信號(hào)傳導(dǎo)起重要的作用[25]。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，對(duì)七味白術(shù)散的成分、藥物作用靶點(diǎn)和治療脾虛泄瀉的潛在靶點(diǎn)及作用機(jī)制進(jìn)行了研究和總結(jié)，發(fā)現(xiàn)七味白術(shù)散治療脾虛泄瀉的潛在機(jī)制可能是STAT3、TNF、IL6、AKT1、EGFR、CXCL8、IL1B、TP53、STAT1、IL4、EGF、IL2 等核心靶點(diǎn)通過(guò)Pathways in cancer 等通路，發(fā)揮了細(xì)胞因子受體結(jié)合、脂質(zhì)結(jié)合、蛋白激酶活性結(jié)合的作用。

4 不足與展望

本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法初步探索了七味白術(shù)散的主要成分和治療作用，為下一步實(shí)驗(yàn)論證七味白術(shù)散治療脾虛泄瀉提供了研究基礎(chǔ)和研究思路。一般認(rèn)為中藥復(fù)方通過(guò)多靶點(diǎn)、多途徑參與疾病的治療，本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)也初步論證了這一說(shuō)法，但仍有許多不足之處。

從研究可以看出，核心靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的成分主要存在于人參、葛根、藿香、甘草4 味中藥中，而在茯苓、木香、白術(shù)中并未發(fā)現(xiàn)。這可能有以下幾種原因：（1）數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)并不完善。本研究中的數(shù)據(jù)均來(lái)源于在線數(shù)據(jù)庫(kù)，數(shù)據(jù)庫(kù)的完善與否對(duì)研究結(jié)果的完整性起著至關(guān)重要的作用。（2）未體現(xiàn)出方劑學(xué)君臣佐使思想。在七味白術(shù)散中，人參為君，白術(shù)為臣，茯苓、葛根、藿香、木香為佐，甘草為使。在成分和靶點(diǎn)篩選后，人參和甘草成分出現(xiàn)頻率最高，且每味藥的權(quán)重相同，并不能看出君藥人參和使藥甘草在權(quán)重上的區(qū)別。（3）網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的篩選為中藥機(jī)制的挖掘提供了一個(gè)良好的思路，但仍需要實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，這也是本研究的不足之處。