唾液蛋白作為低齡兒童齲預測標志物的研究進展

朱錦怡 樊琪 周媛 鄒靜 黃睿潔

口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心四川大學華西口腔醫(yī)院兒童口腔科 成都 610041

齲病是嬰幼兒最常見的牙齒問題之一。6歲以下兒童的任何一顆乳牙中存在一個或多個齲（無論是否形成齲洞）、失（因齲所致牙齒缺失）、補（牙齒充填），即可稱為低齡兒童齲（early childhood caries，ECC）[1]。該年齡段兒童的嚴重齲齒又稱為重度低齡兒童齲（severe early childhood caries，S-ECC），滿足以下3個條件之一即可診斷：3歲以下兒童出現(xiàn)光滑面齲，3～5歲兒童上頜前牙出現(xiàn)光滑面齲，或是齲失補指數(shù)≥4（3歲）、≥5（4歲）、≥6（5歲）[2]。ECC不僅降低咀嚼功能，當感染波及根尖周組織后，還會對恒牙的發(fā)育及萌出造成影響，更有甚者會引發(fā)全身感染，影響兒童的生長發(fā)育和心理健康。我國第4次全國口腔健康流行病學調查結果顯示：我國兒童患齲情況呈現(xiàn)上升態(tài)勢，5歲兒童乳牙患齲率為70.9%，比10年前上升了5.8個百分點[3]。

由于監(jiān)護人對兒童口腔衛(wèi)生及乳牙齲缺乏重視，加之ECC進展十分迅速，因此很多患兒就診時已患有S-ECC。如何有效預測兒童齲的發(fā)生，做到未病先防，是現(xiàn)階段兒童口腔工作的重點和難點。臨床上常通過綜合評估患齲風險預測齲病的發(fā)生，但由于齲病病因復雜且多，各模型判斷標準存在差異，目前尚無統(tǒng)一的齲風險預測模型[4]。有研究[5]發(fā)現(xiàn)：唾液蛋白可通過直接抗菌及阻礙致齲菌黏附定植等多種防御機制在ECC中發(fā)揮重要作用，并且唾液蛋白水平與宿主齲病易感性之間存在關聯(lián)，因而有學者[6]提出，可以利用唾液蛋白作為生物標志物評估齲風險。本文對唾液蛋白在ECC中的作用機制及不同的唾液蛋白可否作為預測ECC的生物標志物進行綜述。

1 抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）

AMPs是生物體內經誘導產生的具有抗菌活性的小分子多肽，主要以防御素（defensin）家族和cathelicidin家族為代表，在ECC的進展過程中發(fā)揮重要作用。

1.1 防御素

防御素是一種低相對分子質量的陽離子抗菌肽，可分為α-防御素（human neutrophil peptide，hNP） 和β-防御素（human beta defensin，hBD）兩種。目前在人體中已發(fā)現(xiàn)6種hNP和4種hBD，其中hNP來源于中性粒細胞，而hBD則由上皮細胞產生，口腔中僅表達hNP-1、hNP-2、hNP-3、hNP-4、hBD-1、hBD-2、hBD-3[7]。

防御素具有直接抗菌和調節(jié)宿主免疫反應的雙重作用[8-10]，是口腔天然防御系統(tǒng)的一部分。防御素可通過靜電力作用引起微生物細胞膜裂解，發(fā)揮其抗菌作用[9]。目前已有研究[9-10]證實：防御素，尤其是hBD，對變異鏈球菌等致齲菌具有直接抗菌作用。另外還有研究[11-12]顯示：防御素的各個成分之間，以及防御素和其他抗菌肽之間存在協(xié)同作用，可共同抵抗變異鏈球菌。此外，防御素還可通過促進樹突狀細胞的抗原呈遞作用引發(fā)宿主免疫反應，發(fā)揮間接抗菌作用[9]，但目前尚無研究證明ECC中也存在此機制。一些學者[10,12]提出ECC中防御素可能通過影響牙菌斑生物膜中的優(yōu)勢菌群，從而發(fā)揮抗齲作用。Jurczak等[10]認為防御素可能影響包括鏈球菌在內的多種細菌在牙菌斑生物膜中的定植。Phattarataratip等[12]則發(fā)現(xiàn)：分離自齲齒兒童的變異鏈球菌臨床株對唾液hNP-1、hNP-2和hBD-2、hBD-3的抵抗力較無齲兒童更高，并認為此類抵抗力高的菌株在ECC患兒牙菌斑中更具生態(tài)優(yōu)勢。

然而，目前的研究尚未明確唾液中防御素的濃度與ECC嚴重程度之間的關系。部分學者[11,13]報道兩者之間并無明確關聯(lián)。如Toomarian等[13]發(fā)現(xiàn)：S-ECC、ECC患兒和無齲兒童之間的唾液hNP（hNP-1、hNP-2、hNP-3）水平缺乏明顯差異。Colombo等[11]也發(fā)現(xiàn)：hBD（hBD-2、hBD-3）的含量在上述3組之間無明顯變化。還有部分學者[14-15]發(fā)現(xiàn)ECC患兒唾液內部分防御素成分呈現(xiàn)明顯的下降趨勢。如一項開展于巴西兒童的試驗[14]顯示：hBD-1在患有ECC的兒童體內水平更低；hNP-3和hBD-3也被發(fā)現(xiàn)在ECC患兒唾液中具有較低的濃度[15]。此外，也有學者[10]發(fā)現(xiàn)一些防御素成分在ECC患兒中增多，如Jurczak等[10]發(fā)現(xiàn)ECC患兒唾液內hBD-2水平升高。上述研究表明，防御素與ECC之間目前仍缺乏明確的關聯(lián)，這可能是由于不同個體間防御素水平存在差異[12]，進而對實驗結果造成了影響。

綜上，目前尚無充分的證據(jù)表明防御素可作為ECC預測的生物標志物，其與ECC風險的相關性仍需要進一步的研究。

1.2 人源抗菌肽LL-37（human cathelicidin LL-37）

人源抗菌肽LL-37由中性粒細胞和上皮細胞產生，屬于抗菌肽cathelicidin家族。LL-37對致齲菌中的變異鏈球菌有很強的抗菌活性，帶有正電荷的LL-37作用于帶有負電荷的細菌細胞壁，在細胞壁上形成孔狀結構，引起細菌裂解；此外，LL-37還參與調控機體的天然免疫[16]。

目前有關LL-37在ECC中作用具體機制的研究還很少。Colombo等[11]對36名60個月大兒童的唾液成分進行分析，發(fā)現(xiàn)LL-37水平與患齲經歷間僅存在弱相關性，但與其他抗菌肽如hBD-2、hBD-3之間呈現(xiàn)明顯的正相關關系。該結果提示抗菌肽的不同成分之間可能存在相互促進的機制，各成分協(xié)同在ECC中發(fā)揮作用[12]。此外，Davidopoulou等[17]發(fā)現(xiàn)：與無齲兒童相比，低中度齲患兒唾液LL-37增高，而LL-37在S-ECC患兒中的水平卻較前兩者明顯降低，作者由此推測LL-37可能具有保護作用。另外還有研究[18]表明LL-37可以抑制齲病相關厭氧菌形成生物膜，并且這種抑制作用的發(fā)揮受其濃度影響，這為Davidopoulou等[17]的推測提供了依據(jù)。

LL-37可能是口腔中重要的先天免疫因子，在ECC的進展過程中起保護作用，但其水平高低與ECC易感性之間的關系尚不明晰，仍需進一步研究。

2 糖蛋白（glycoproteins）

唾液糖蛋白是一類含有寡糖鏈的蛋白質，參與牙菌斑生物膜的形成，影響致齲菌的黏附和定植，其中的許多成分在ECC中扮演著重要的角色。

2.1 富脯蛋白（proline-rich proteins，PRPs）

PRPs主要由腮腺分泌，是一類富含甘氨酸、谷氨酰胺和脯氨酸的蛋白質，可分為酸性和堿性兩類。酸性PRPs通過其N-端黏附在羥磷灰石上，并通過C-端與細菌結合，參與致齲菌黏附牙面的過程。堿性PRPs則可以與細菌或多酚結合，降低食物的澀味，減少飲食中糖的攝入，具有預防齲病發(fā)生的作用[19]。

研究[20-21]發(fā)現(xiàn)ECC患兒的總PRPs水平低于無齲患兒。Bhalla等[20]通過凝膠電泳圖譜觀察到ECC患兒PRPs條帶數(shù)量較無齲兒童低；Fonteles等[21]則發(fā)現(xiàn)ECC患兒較無齲兒童唾液內存在更多的游離脯氨酸，并指出是由于微生物分解唾液蛋白導致的。除總PRPs外，還有研究[22]發(fā)現(xiàn)酸性PRPs與ECC的關系十分密切，可能是由于其在變異鏈球菌的黏附過程中發(fā)揮重要作用所致。有學者[23]研究酸性PRPs基因多態(tài)性與ECC之間的聯(lián)系，結果發(fā)現(xiàn)：酸性PRPs 由2 個基因PRH1 和PRH2 編碼，其中PRH1基因座包含Db、Pa和Pif共3個等位基因。Zakhary等[22]通過對比不同人種受試者唾液中上述基因的表達，發(fā)現(xiàn)Db基因可用于解釋不同人種間ECC患病率的差異，即Db基因頻率低的高加索兒童較基因頻率高的非裔美國兒童更易患齲。此外，PRH1和PRH2基因表達的差異也造成了個體對齲病易感性的不同[24]，然而具體機制仍不詳。另有研究發(fā)現(xiàn)ECC可能與缺乏某些PRH基因有關[19]。與酸性PRPs不同，關于堿性PRPs與ECC關系的認識尚不充足，僅有少數(shù)研究[15]表明堿性PRPs水解產物IB-4的升高增加了患ECC的風險，這可能是因為原本具有防齲作用的堿性PRPs水解后失去了其保護功能。

根據(jù)目前的研究結果可以看出，酸性PRPs基因表達可作為預測ECC易感性的潛在指標，但是目前缺乏充足的證據(jù)證明堿性PRPs與ECC之間的聯(lián)系。

2.2 富組蛋白（histidine-rich proteins，HRPs）

HRPs中含有12個組分，其中HRP-1、HRP-3和HRP-5被稱為主要富組蛋白。HRPs不僅具有直接抑菌的作用，而且可以中和細菌產生的酸，阻止齲病進展[25]。此外，也有一些學者[11]將HRPs歸為抗菌肽類別下，并發(fā)現(xiàn)HRP-5與其他抗菌肽如防御素、LL-37之間存在協(xié)同抗齲作用。

HRPs在ECC中顯示出明顯的升高趨勢，以HRP-1和HRP-5為代表。研究[10,26]顯示：HRP-1和HRP-5在ECC患兒唾液內的水平較無齲兒童顯著升高，推測原因是由于ECC的存在刺激了HRPs的分泌。Ao等[27]進行的縱向研究表明：通過質譜分析發(fā)現(xiàn)HRPs的水解肽段含量隨ECC的進展不斷升高，能反映ECC發(fā)展的情況。

目前的研究顯示HRPs具有抗齲能力，但在ECC中卻表現(xiàn)出明顯的升高趨勢。

2.3 富酪蛋白（statherin）

富酪蛋白由腺泡細胞分泌，在結構和功能上與富組蛋白十分相似。研究[28]表明：富酪蛋白作為一種小唾液蛋白，可以競爭性抑制高相對分子質量黏蛋白MG1，進而阻礙變異鏈球菌黏附在牙面上。李遠貴等[29]研究了兒童唾液富酪蛋白與患齲狀況的聯(lián)系，結果發(fā)現(xiàn)：齲病高危組兒童的唾液富酪蛋白濃度低于無齲組，作者認為這可能提示不同齲易感性個體代謝降解富酪蛋白的能力存在差異。

目前關于富酪蛋白在ECC中作用機制的研究較少，是否可作為ECC的預測指標尚不明確。

2.4 黏蛋白（mucin）

黏蛋白主要由下頜下腺、舌下腺和小唾液腺分泌。唾液中的黏蛋白存在兩種類型：由muc5b基因編碼的高相對分子質量黏蛋白MG1和由muc7基因編碼的低相對分子質量黏蛋白MG2。這兩種類型的黏蛋白均與牙菌斑形成和細菌黏附有關。MG1主要參與獲得性膜的形成；而MG2是一種抗菌蛋白，可以促進細菌聚集，使其更易被清除出口腔。

目前的研究顯示：ECC患兒唾液內MG1水平下降，相反MG2水平上升。ECC組受試者唾液內MG1的含量隨ECC的進展逐漸降低[30-31]。鄢國偉等[32]通過電噴霧離子肼-串聯(lián)質譜分析發(fā)現(xiàn)：SECC患兒唾液內MG2水平明顯高于無齲組。Angwaravong等[33]的研究顯示：學齡兒童（9～11歲）患齲后唾液MG1降低、MG2升高；但在更為關注的患齲學齡前兒童（4～6歲）的研究中，學齡前兒童唾液中并未觀察到上述黏蛋白水平的變化。

綜合上述研究可知：黏蛋白的兩個組分在功能上存在差異，在ECC進展過程中呈現(xiàn)完全不同的變化趨勢，即MG1降低而MG2增高，因此黏蛋白可能是預測ECC風險的潛在指標。

2.5 乳鐵蛋白（lactoferrin，LTF）

LTF是一種特殊的糖蛋白，具有螯合鐵離子的能力，可以利用細菌生長代謝所需的鐵離子，使細菌獲得的鐵離子減少，進而起到抑菌作用；同時LTF也可以通過影響變異鏈球菌的黏附和激活免疫系統(tǒng)來表現(xiàn)抗菌活性[34]。

國內外多項研究[32,35-37]均發(fā)現(xiàn)S-ECC和ECC患兒唾液內的LTF含量顯著高于無齲組，且經過治療后唾液乳鐵蛋白水平降低[38]。上述研究均觀察到ECC患兒唾液LTF水平高于無齲兒童的現(xiàn)象，但目前尚無直接證據(jù)證明LTF具有保護作用。Moslemi等[35]認為：LTF水平的改變屬于一種補償機制，該機制作用的具體條件仍需進一步研究。此外Abbaso?lu等[39]發(fā)現(xiàn)：LTF的基因多態(tài)性與土耳其兒童的齲患率低有關；但目前尚未發(fā)現(xiàn)LTF與我國ECC患兒患齲經歷存在關聯(lián)[40]。

LTF在ECC進展過程中展現(xiàn)出了較為明確的升高趨勢，但關于其基因多態(tài)性與齲易感性之間的聯(lián)系仍需進一步研究，未來可能成為ECC的風險預測指標。

3 酶

酶是唾液中重要的有機成分。不同的酶可通過直接抗菌、調節(jié)唾液pH等多種方式密切參與齲病的進展。唾液酶中，溶菌酶（lysozyme）、碳酸酐酶、基質金屬蛋白酶等均與ECC之間存在關聯(lián)。

3.1 溶菌酶

溶菌酶是唾液先天防御系統(tǒng)的重要組成部分，可以與革蘭陰性細菌的脂多糖發(fā)生結合，除直接殺菌和促進細菌凝集的作用外，還可以破壞細菌細胞壁，進而溶解細菌；此外，溶菌酶還抑制生物膜形成，阻礙變異鏈球菌對牙面的黏附[41]。

多數(shù)研究[36,42]表明溶菌酶含量在ECC患兒唾液中較無齲兒童升高，但仍有少數(shù)研究[43]發(fā)現(xiàn)ECC組患兒唾液溶菌酶水平低于無齲組。一項開展于泰國學齡前兒童的研究[43]顯示：S-ECC組患兒的唾液溶菌酶水平和活性均顯著增加，提示溶菌酶在ECC進展過程中發(fā)揮著重要的免疫防御作用。

由上述研究可以看出：溶菌酶的升高可能具有標記ECC進展情況的潛力，但仍需更多的證據(jù)來證實。

3.2 碳酸酐酶Ⅵ（carbonic anhydrase Ⅵ）

碳酸酐酶Ⅵ深度參與唾液緩沖、離子運輸、pH調節(jié)以及唾液產生和分泌等生理過程[44]。de-Sousa等[45]發(fā)現(xiàn)：ECC患兒唾液和生物膜內的碳酸酐酶Ⅵ水平均增高，認為該酶可與pH值一同作為預測ECC的指標。然而侯雯等[46]的研究得出了相反的結果。他們在一項4～5歲兒童的研究[46]中發(fā)現(xiàn)：相較于無齲兒童，ECC患兒唾液和菌斑中的碳酸酐酶Ⅵ含量均呈現(xiàn)下降趨勢。

由于不同研究對于碳酸酐酶Ⅵ與ECC之間的聯(lián)系尚無定論，尚需進一步研究才能確定碳酸酐酶Ⅵ能否用于預測ECC。

3.3 基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）

MMPs既能促進齲病進展，又參與修復性牙本質形成，但具體機制尚不明確[47]。有研究[48]證明：S-ECC患兒唾液中的MMP-2、MMP-9水平明顯高于無齲兒童，即使經過治療仍高于健康兒童，這提示MMP-2和MMP-9可能在ECC的進程中發(fā)揮作用，但是否可用于ECC預測仍需進一步研究。

4 免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）

唾液Ig的成分主要是IgA和IgG，另有少量的IgM、IgD和IgE，其中的分泌型免疫球蛋白A（secretory immunoglobulin A，sIgA）在口腔局部免疫中發(fā)揮重要作用，是抵抗病原體的第一道防線。sIgA可通過抑制致齲菌黏附，使細菌酶和毒素失活，以及激活補體通路等多方面的功能發(fā)揮防齲作用，并且可以與口腔內其他防御機制協(xié)同對抗病原體[49]。

已有多項研究來驗證sIgA與ECC之間的關系，結果表明：ECC患兒唾液內sIgA的平均濃度顯著高于無齲兒童[50-51]，而S-ECC組患兒的唾液sIgA水平則低于無齲組[52]。還有研究[53]利用齲齒顆數(shù)、齲失補牙面指數(shù)對ECC患兒患齲情況進行分級，結果發(fā)現(xiàn)隨齲病程度加重，唾液sIgA水平也下降。目前普遍認為造成上述改變的原因有二：一是患齲后致齲菌刺激機體產生大量的sIgA以應對病原體入侵，但隨著sIgA與變異鏈球菌葡糖基轉移酶（glucosyltransferase，GTF）的結合，其濃度下降[52,54]；二是由于變異鏈球菌會同時分泌IgA蛋白酶裂解sIgA[55]。但也有一些學者[56]觀察到sIgA可以通過某種未知機制抵御蛋白酶。此外，也有研究[57]顯示sIgA含量與變異鏈球菌數(shù)量之間存在正相關關系，證實了sIgA的保護作用。

除總sIgA外，也有學者[58]研究了ECC中不同抗原表位誘導的特異性sIgA的水平，結果發(fā)現(xiàn)：針對變異鏈球菌葡聚糖結合蛋白B（glucanbinding protein B，GbpB）的sIgA水平呈現(xiàn)下降趨勢，而針對抗原AgⅠ/Ⅱ和GTF的特異性sIgA水平卻并未呈現(xiàn)明顯變化。推測這可能是因為唾液中特異性sIgA含量較低，所以變化并不明顯[59]。

綜上所述，sIgA含量在ECC患兒唾液內升高，而在S-ECC患兒唾液內則下降，并且隨齲病程度加重，唾液sIgA水平逐漸下降。特異性sIgA因濃度較低，尚未展現(xiàn)出明顯的變化趨勢。由此可以推測：sIgA具有潛在的反映ECC易感性的能力。此外，也有一些針對IgG、IgM與ECC關系的研究[50,53]，但目前尚無充分證據(jù)證實這些蛋白與ECC的聯(lián)系。

5 唾液總蛋白

本文分別描述了不同唾液蛋白成分在ECC中的作用機制及其是否具備作為生物標志物的潛力。因為唾液中的蛋白通過多種方式相互作用，因此有學者[35]建議將不同種唾液蛋白視為同一系統(tǒng)的組成部分，評估唾液總蛋白水平與ECC的關系。盡管部分研究發(fā)現(xiàn)二者之間缺乏明顯關聯(lián)[60]，但大多數(shù)研究均表明ECC組患兒唾液總蛋白水平明顯提高[61-62]，且差異蛋白主要集中在低豐度區(qū)域[32]。

唾液總蛋白水平的變化可能是因為患齲后刺激產生防御性蛋白，后者通過直接抗菌以及抑制致齲菌黏附等機制發(fā)揮作用；但目前尚無證據(jù)表明唾液總蛋白水平可作為ECC齲風險評估的指標。

6 小結

綜上所述，一些唾液蛋白成分如酸性PRPs、富組蛋白、黏蛋白、溶菌酶、sIgA等與ECC關系密切，在ECC中發(fā)揮重要作用。酸性PRPs基因在早期預測個體ECC易感性方面展現(xiàn)出了較高的應用價值；而富組蛋白則是一種可用于反映ECC進展情況的蛋白。然而現(xiàn)有的研究一般每次只研究1～2種蛋白成分，忽視了唾液蛋白各組分間的相互作用。隨著唾液蛋白質組學的不斷發(fā)展，未來或許可實現(xiàn)對唾液蛋白全面且系統(tǒng)的分析，深入研究不同唾液蛋白之間的作用機制，建立起幾種蛋白的綜合評估模型用以預測ECC發(fā)生，進而成為精準高效的ECC預測工具。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。