線粒體功能調(diào)控機(jī)制進(jìn)展及研究方法

肖 昊 蔣宗勇 王 麗 葉秀峰

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)部華南動(dòng)物營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，畜禽育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室茂名分中心，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510640)

線粒體作為細(xì)胞代謝的中樞，是細(xì)胞能量供應(yīng)、新陳代謝以及凋亡的重要場所，通過氧化磷酸化產(chǎn)生ATP，同時(shí)也是脂肪酸、激素和氨基酸生物合成的關(guān)鍵中間體，也參與細(xì)胞凋亡和免疫等機(jī)體功能[1]。因此，線粒體功能穩(wěn)定對于細(xì)胞存活和機(jī)體的正常生理功能具有重要意義。線粒體是細(xì)胞在各種壓力下的第1道防線。功能失調(diào)的線粒體可以通過一系列復(fù)雜的適應(yīng)性反應(yīng)修復(fù)，如線粒體生物發(fā)生、線粒體裂變/融合、線粒體未折疊蛋白反應(yīng)(mitochondrial unfolded protein reaction，UPRmt)和線粒體自噬[2]。本文綜述了線粒體功能損傷的調(diào)控機(jī)制(主要闡述線粒體自噬和UPRmt)的研究進(jìn)展和線粒體功能研究方法，旨在為進(jìn)一步促進(jìn)以線粒體為靶標(biāo)的營養(yǎng)調(diào)控劑在動(dòng)物生產(chǎn)上的應(yīng)用提供參考。

1 線粒體功能損傷調(diào)控機(jī)制

生物體已經(jīng)進(jìn)化出多種機(jī)制來識別和感知線粒體的功能障礙，用于恢復(fù)可搶救的細(xì)胞器，并降解無法修復(fù)的細(xì)胞器，用以維持健康的線粒體網(wǎng)絡(luò)[3]。線粒體應(yīng)激反應(yīng)途徑主要分為3種：1)介導(dǎo)受損線粒體的識別和選擇性降解的線粒體自噬通路；2)轉(zhuǎn)錄翻譯衰減，線粒體功能障礙后真核翻譯起始因子2α激酶4(EIF2AK4)/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶2(GCN2)被激活，通過磷酸化真核類起始因子2(eukaryotic initiation factor 2，eIF2α)介導(dǎo)翻譯衰減，這有助于減少蛋白質(zhì)流入線粒體[4]；3)損傷初期能限制有缺陷的線粒體損傷并促進(jìn)回收可用的線粒體恢復(fù)的調(diào)控手段——UPRmt[5-6]。

1.1 線粒體自噬

線粒體自噬是維持線粒體質(zhì)量所必需的關(guān)鍵機(jī)制之一，是調(diào)控線粒體數(shù)量和質(zhì)量的核心機(jī)制。缺陷線粒體可產(chǎn)生過量活性氧(reactive oxygen species，ROS)，通過逆轉(zhuǎn)三磷酸腺苷合酶(adenosine triphosphate synthase，ATPase)活性消耗ATP，損害線粒體代謝功能，觸發(fā)細(xì)胞凋亡[7-8]。因此，線粒體自噬旨在迅速清除這些功能失調(diào)的線粒體，以保護(hù)細(xì)胞完整性。線粒體自噬是一種選擇性自噬過程，將多余或者損傷的線粒體運(yùn)送到溶酶體進(jìn)行降解。含有損傷線粒體的自噬小體可直接或通過內(nèi)體融合與溶酶體融合，形成中間的雙裂體，形成自溶酶體，降解和回收線粒體[9]。調(diào)控線粒體自噬的通路主要包括泛素化依賴的磷酸酯酶與張力蛋白同源物誘導(dǎo)激酶1(PTEN-induced kinase 1，PINK1)/帕金蛋白(Parkin)通路以及受體介導(dǎo)線粒體自噬[B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)/腺病毒E1B19kDa互作蛋白3(E1B19kDa-interacting protein，BINP3)、NIP3樣蛋白X(NIP3-like protein X，NIX)和FUN14含結(jié)構(gòu)域蛋白1(FUN14 domain-containing protein 1，F(xiàn)UNDC1)][10]。

1.1.1 泛素化依賴的線粒體自噬通路

泛素依賴性線粒體自噬主要指PINK1/Parkin途徑。該途徑需要線粒體相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸激酶PINK1和Parkin。PINK1-Parkin激活的線粒體自噬通路是目前機(jī)制研究最為透徹的通路。PINK1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白酶，位于Parkin的上游，是線粒體的運(yùn)營及傳感器，其功能依賴于線粒體膜電位。PINK1與線粒體自噬的選擇性啟動(dòng)密切相關(guān)，通過引起線粒體分裂和降解來調(diào)控線粒體質(zhì)量和數(shù)量[11]。線粒體損傷后膜電位快速降低，PINK1蛋白在損傷的線粒體外膜上積聚，招募Parkin對損傷線粒體進(jìn)行泛素化修飾，受體蛋白p62等識別線粒體泛素化信號，并通過與自噬微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(autophagy microtubule-associated protein-1 light chain 3，LC3)[12]啟動(dòng)自噬形成。Parkin可泛素化線粒體外膜上的多種蛋白，目前發(fā)現(xiàn)Parkin的下游蛋白有線粒體融合蛋白1/2(mitochondrial fusion protein 1/2，Mfn1/2)、線粒體Rho鳥苷三磷酸酶(mitochondrial Rho GTPase，Miro)、線粒體電壓依賴性陰離子通道1(mitochondrial voltage dependent anionic channel 1，VADC1)和線粒體移位酶復(fù)合體(mitochondrial translocation enzyme complex，包括TOM70、TOM40和TOM20)[13-14]。PINK1-Parkin通路能通過靶向Mfn和Miro進(jìn)行蛋白酶體降解來調(diào)節(jié)線粒體動(dòng)力學(xué)。

其他E3-泛素連接酶也參與線粒體表面蛋白的泛素化，如線粒體錨定蛋白連接酶1(mitochondrial-anchored protein ligase 1，MUL1)、Ariadne-1同源體(Ariadne-1 homolog，ARIH1)、7個(gè)缺席同源體1(seven in absentia homologs 1，SIAH1)、Smad特異性E3泛素蛋白連接酶1(Smad specific E3 ubiquitin protein ligase 1，SMURF1)等。這些泛素連接酶可單獨(dú)作用，也可以與Parkin相互作用，通過泛素結(jié)合域和LC3相互作用區(qū)域(LIR)基序?qū)⒎核鼗牡鞍着c形成自噬小體連接起來[15]。p62也被發(fā)現(xiàn)可作用于泛素化級聯(lián)的上游，介導(dǎo)基底肝細(xì)胞線粒體自噬，而不依賴于Parkin。在DRP1敲除的肝細(xì)胞中，p62在線粒體中積累，通過與Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)相互作用和招募E3連接酶環(huán)狀盒1(ring-box 1，RBX1)促進(jìn)線粒體泛素化[16]。去泛素化酶(deubiquitinating enzymes，DUBs)如泛素蛋白特異性蛋白酶(ubiquitin-specific protease，USP)30、USP35和USP15能抑制線粒體自噬。研究表明，USP30是唯一與線粒體表面構(gòu)成相關(guān)的DUB，它在線粒體表面去泛素化Parkin底物以抑制Parkin依賴的線粒體自噬[17]。

1.1.2 非泛素化依賴的線粒體自噬通路

BINP3、NIX和FUNDC1是線粒體外膜定位蛋白。BINP3和NIX是LC3互作位點(diǎn)(LC3-interacting region，LIR)的啟動(dòng)器，LIR位點(diǎn)朝向胞質(zhì)側(cè)，具有調(diào)節(jié)線粒體自噬的作用[18]。這些蛋白介導(dǎo)線粒體自噬的主要模式被認(rèn)為是介導(dǎo)線粒體與新生自噬小體的直接相互作用。這一過程在2個(gè)不同的水平上被調(diào)控：1)蛋白豐度。BNIP3和NIX受到上游線粒體自噬信號通路的轉(zhuǎn)錄控制。線粒體自噬觸發(fā)這些受體的表達(dá)，并提高它們在線粒體外膜(outer mitochondrial membrane，OMM)中的含量。目前還不清楚在這些情況下，線粒體靶向受體的選擇性是如何發(fā)生的[19]。2)翻譯后修飾。線粒體受體功能主要通過磷酸化調(diào)節(jié)，促進(jìn)或增強(qiáng)受體與LC3/LC3/GABAA型受體相關(guān)蛋白(GABA type A receptor-associated protein，GABARAP)相互作用以驅(qū)動(dòng)線粒體自噬的能力。例如，自噬相關(guān)基因(autophagy-related gene，ATG)32在LIR基序附近被磷酸化，可能是被CK2磷酸化，以促進(jìn)與適配器蛋白ATG11的相互作用[20-21]。同樣，NIX也被一種未知激酶磷酸化，以加強(qiáng)與ABARAP蛋白的相互作用[22]。相反，在正常生理?xiàng)l件下，LIR基序的酪蛋白激酶2(casein kinase 2，CK2)/Src磷酸化可抑制FUNDC1。在這種情況下，PGAM5磷酸酶的活性促進(jìn)了線粒體自噬活性，而ULK1磷酸化加強(qiáng)了FUNDC1與ATG8的相互作用。FUNDC1也可以被泛素化和蛋白酶體降解，以限制線粒體自噬反應(yīng)[23]。雖然磷酸化目前是調(diào)節(jié)的主要機(jī)制，其他仍然沒有特征的翻譯后修飾可能是重要的微調(diào)受體的活性[24]?？偟膩碚f，線粒體自噬受體的上游調(diào)控和標(biāo)記線粒體的內(nèi)在選擇性仍然知之甚少。

有研究表明，某些線粒體蛋白有不同的基礎(chǔ)自噬轉(zhuǎn)換率，線粒體蛋白是如何在線粒體自噬消除的網(wǎng)絡(luò)中被選擇性地分類和調(diào)節(jié)的，目前尚不十分清楚，同時(shí)也缺乏對線粒體自噬如何在線粒體生物發(fā)生、功能和最終細(xì)胞反應(yīng)與功能的動(dòng)力學(xué)在更大范圍內(nèi)協(xié)調(diào)的理解。線粒體網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)態(tài)也可能涉及蛋白酶體依賴的線粒體蛋白、線粒體蛋白酶和伴侶的降解或線粒體未折疊蛋白反應(yīng)。然而，線粒體自噬和所有其他線粒體質(zhì)量控制途徑之間的分子和生理相互作用仍然知之甚少。

1.2 UPRmt

UPRmt是在應(yīng)激條件下響應(yīng)線粒體未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，誘導(dǎo)核基因編碼的線粒體分子伴侶熱休克蛋白(heat shock proteins，HSP)60、HSP70及蛋白酶等的表達(dá)量，促進(jìn)線粒體蛋白穩(wěn)態(tài)的信號傳導(dǎo)過程[5-6]。應(yīng)激狀態(tài)下激活的UPRmt通過上調(diào)基因轉(zhuǎn)錄或促進(jìn)泛素蛋白酶體系統(tǒng)降解蛋白質(zhì)來優(yōu)化線粒體蛋白的進(jìn)出口質(zhì)量控制。如果UPRmt不能完全修復(fù)線粒體損傷，則誘導(dǎo)線粒體裂變將受損區(qū)域從健康線粒體網(wǎng)絡(luò)中分離出來，然后通過線粒體吞噬作用清除結(jié)構(gòu)受損的線粒體[25]?？梢哉J(rèn)為，UPRmt和線粒體自噬是不同的線粒體修復(fù)途徑。與UPRmt相比，線粒體自噬減少了線粒體數(shù)量，這種改變有時(shí)與ATP缺乏和細(xì)胞死亡有關(guān)。過度誘導(dǎo)線粒體自噬是致命的，由于多數(shù)線粒體被降解，ATP產(chǎn)生被抑制，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。與線粒體自噬不同，UPRmt動(dòng)態(tài)地控制線粒體蛋白的輸入或輸出，并微調(diào)線粒體行為。

UPRmt的調(diào)節(jié)信號研究的最清楚的是在線蟲中。通過遺傳方法發(fā)現(xiàn)了許多UPRmt調(diào)控因子，包括線粒體基質(zhì)蛋白酶酪蛋白水解肽酶P(caseinolytic peptidase P，ClpP)、泛素樣蛋白Ub-5、轉(zhuǎn)錄因子DVE-1、線粒體ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Haf-1和應(yīng)激激活轉(zhuǎn)錄因子-1(stress-activated transcription factor-1，ATFS-1)。ClpP通過蛋白質(zhì)水解方式降解折疊不當(dāng)?shù)木€粒體蛋白，隨后通過HAF-1釋放線粒體產(chǎn)生的多肽，從而激活UPRmt。在生理?xiàng)l件下，線粒體靶向序列引導(dǎo)ATFS-1定位到線粒體，而后被蛋白酶Lon降解[5]。通常，ATFS-1被輸入線粒體并被降解。然而，在線粒體應(yīng)激期間，我們發(fā)現(xiàn)輸入效率降低，允許一定比例的ATFS-1在細(xì)胞質(zhì)中積累并運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核[26-27]。ATFS-1調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以恢復(fù)線粒體功能，包括誘導(dǎo)線粒體蛋白酶和分子伴侶基因(HSP60、HSP70等基因)及ROS解毒基因(如谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶、超氧化物歧化酶或過氧化氫酶基因等)等[5]。在哺乳動(dòng)物中，UPRmt受堿性亮氨酸拉鏈(basic leucine zipper，bZIP)轉(zhuǎn)錄因子ATF4、ATF5和CCAAT/增強(qiáng)子綁定的同源蛋白質(zhì)(CCAAT/enhancer-binding homologous protein，CHOP)的調(diào)控。受ATFS-1發(fā)現(xiàn)的啟發(fā)，F(xiàn)iorese等[28]也發(fā)現(xiàn)，ATF5是哺乳動(dòng)物UPRmt應(yīng)答的調(diào)節(jié)因子。線粒體輸入效率似乎以一種類似于ATFS-1的方式調(diào)節(jié)ATF5，ATF5也包含線粒體定位序列。正常生理狀態(tài)下，ATF5定位于線粒體。而當(dāng)線粒體受到應(yīng)激時(shí)，ATF5通過調(diào)節(jié)UPRmt保護(hù)線粒體功能。與ATFS-1類似，ATF5在轉(zhuǎn)錄上調(diào)節(jié)線粒體保護(hù)基因的表達(dá)，這是線粒體應(yīng)激期間細(xì)胞生長所必需的[29]。因此，在應(yīng)激狀態(tài)下ATF5/UPRmt會(huì)激活由核DNA編碼的線粒體伴侶蛋白和蛋白酶的轉(zhuǎn)錄激活程序，同時(shí)通過誘導(dǎo)和激活泛素化-蛋白酶體系統(tǒng)以最大限度地清除損傷的線粒體蛋白，維持細(xì)胞蛋白穩(wěn)態(tài)[30]。氧化應(yīng)激可通過UPRmt緩解線粒體蛋白損傷改善線粒體功能。百草枯產(chǎn)生的過量ROS增加受損蛋白質(zhì)的含量，最終激活UPRmt，UPRmt下調(diào)線粒體伴侶基因HSP6和HSP60，轉(zhuǎn)錄因子SKN-1和低氧相關(guān)因子1(hypoxia-associated factor 1，HAF1)[31-32]。

目前的研究表明，哺乳動(dòng)物由4種不同的被線粒體蛋白錯(cuò)誤折疊/聚集激活的UPRmt軸[33](圖1)：1)典型的UPRmt。導(dǎo)致CHOP、ATF4和ATF5從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，導(dǎo)致誘導(dǎo)伴侶素和蛋白酶基因表達(dá)，以增加線粒體內(nèi)部的折疊能力[34-36]；2)UPRmt-組蛋白去乙?；?sirtuin，SIRT)軸。SIRT1/SIRT3作為UPRmt-Sirtuin軸的一部分被激活，導(dǎo)致叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子3A(forkhead box O3A, FOXO3A)去乙?；⒅匦露ㄎ坏郊?xì)胞核，誘導(dǎo)超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2，SOD2)和過氧化氫酶等抗氧化酶表達(dá)緩解氧化應(yīng)激[37-38]；3)UPRIMS/雌激素受體α(estrogen receptor alpha，ERα)軸。被蛋白質(zhì)在膜間空間的錯(cuò)誤折疊激活，該軸通過蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)-AKT和ROS依賴的ERα磷酸化作用，導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子1(nuclear transcription factor 1，NRF1)的誘導(dǎo)，增加蛋白酶水平和蛋白酶體活性，調(diào)節(jié)呼吸水平，以增加蛋白質(zhì)質(zhì)量控制能力[39]；4)UPRmt翻譯軸。

這是一種局部反應(yīng)，基質(zhì)中的蛋白質(zhì)展開導(dǎo)致RNA前加工機(jī)制的組分快速降解，并關(guān)閉線粒體翻譯，以降低線粒體折疊負(fù)荷[33]。

NUCLEUS：細(xì)胞核；CYTOSOL:細(xì)胞質(zhì)；MITOCHONDRIA:線粒體；UPRmt：線粒體未折疊蛋白反應(yīng) mitochondrial unfolded protein reaction；canonical UPRmt：典型的UPRmt; UPRmt sirtuin axis：UPRmt-組蛋白去乙酰化酶軸 UPRmt-histone deacetylase axis；IMS：膜間隙 intermembrane space；UPRIMS/ERα axis：UPRIMS/雌激素受體α軸UPRIMS/estrogen receptor α axis；UPRmt translation axis：UPRmt翻譯軸；chaperonins：伴侶蛋白；proteoases：蛋白酶；unknown factor：未知因子；CHOP：CCAAT/增強(qiáng)子綁定的同源蛋白質(zhì) CCAAT/enhancer-binding homologous protein；ATF:轉(zhuǎn)錄激活因子4 activating transcription factor 4；Increased folding capacity：提高折疊能力；FOXO3：叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子3A forkhead box O3；SIRT3：去乙?；? sirtuin 3；SOD2：超氧化物歧化酶2 superoxide dismutase 2；catalase：過氧化氫酶；Increased antioxidant capacity：增加抗氧化能力；AKT：蛋白激酶 B protein kinase B；ERα：雌激素受體α estrogen receptor alpha；NRF1：核轉(zhuǎn)錄因子1 nuclear transcription factor 1；OMI：線粒體膜間隙酶 mitochondrial intermembrane enzyme；proteasome：蛋白酶體；respiration：呼吸代謝；Increased protein quality control：提高蛋白質(zhì)量控制；Pre-RNA processing& translation：前體-RNA處理&轉(zhuǎn)錄翻譯；Decreased folding load：減少折疊負(fù)載。

2 線粒體功能研究的方法

2.1 線粒體損傷模型構(gòu)建

2.1.1 利用化學(xué)物質(zhì)構(gòu)建損傷模型

研究極端線粒體損傷是通常使用化學(xué)物質(zhì)，如質(zhì)子載體-羰基氰化物間氯苯基腙(phenylhydrazones carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone，CCCP)、菜籽油氰化物4-(三氟甲氧基)苯腙[carbonyl cyanide-p-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone，F(xiàn)CCP]和2,4-二硝基酚，或選擇性電子傳遞鏈抑制劑(如魚藤酮、抗霉素A或寡霉素A)，它們會(huì)損害線粒體呼吸或使線粒體去極化[40-41]，用來研究線粒體損傷和激活線粒體自噬的具體機(jī)制，并探索其與動(dòng)物生理功能損傷的相關(guān)性。引起帕金森表型的毒素如百草枯或6-羥多巴胺，也可以去極化并損傷線粒體[40]。迄今為止發(fā)現(xiàn)的絕大多數(shù)線粒體自噬誘導(dǎo)劑本質(zhì)上是通過抑制線粒體呼吸來啟動(dòng)線粒體自噬反應(yīng)的相關(guān)毒素。

2.1.2 外加壓力構(gòu)建損傷模型

壓力增加細(xì)胞水平的能量需求，并激活系統(tǒng)的線粒體和內(nèi)分泌過程來維持這種增加的需求。線粒體生物發(fā)生需要將核編碼的線粒體蛋白(NEMP)遞送至線粒體，并由內(nèi)源性(例如ROS、氮氧化物、一氧化碳和硫化氫)和外部信號(例如雌激素)誘導(dǎo)，這些信號通過核呼吸因子1(nuclear respiratory factor 1，NRF1)增加過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1α (PGC-1α)和雌激素受體。因此，能量限制、運(yùn)動(dòng)、一氧化氮、一氧化碳、硫化氫和ROS等都有影響線粒體生物發(fā)生的功能，也可以用作模型[42]。線粒體功能與氧的可利用性密切相關(guān)，特別是氧化磷酸化代謝。在缺氧條件下，細(xì)胞激活缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia-induced factor 1，HIF1)信號通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)來驅(qū)動(dòng)應(yīng)激和代謝適應(yīng)程序。缺氧會(huì)導(dǎo)致線粒體呼吸效率低下、線粒體應(yīng)激和能量危機(jī)。因此，HIF1信號通路控制一個(gè)代謝開關(guān)，上調(diào)糖酵解基因，減弱線粒體呼吸，觸發(fā)線粒體自噬[19]。溫度應(yīng)激也被證明會(huì)影響線粒體自噬。小鼠受到慢性冷應(yīng)激刺激β-3腎上腺素能信號通路，依賴FUNDC1通過翻譯后修飾和PGC-1α基因表達(dá)的增加激活PGC-1α，誘導(dǎo)形成富含線粒體的褐色脂肪細(xì)胞[43]。最近也有研究表明，低溫應(yīng)激在恢復(fù)到正常生理溫度后也會(huì)觸發(fā)人成纖維細(xì)胞的線粒體自噬[44]。

2.2 線粒體功能研究方法

評估線粒體功能的方法主要包括線粒體活力及膜電位檢測、線粒體生化分析、線粒體能量學(xué)功能(呼吸代謝檢測和呼吸鏈復(fù)合體活性檢測)以及線粒體抗氧化功能檢測等(圖2)。評估線粒體代謝功能主要通過代謝組學(xué)利用質(zhì)譜等方法對三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle，TCA)、糖酵解以及谷氨酰胺分解等通路的代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測分析，并通過酶學(xué)方法對這些通路的代謝酶活性進(jìn)行分析。評估細(xì)胞自噬及線粒體自噬主要包括3種：1)利用電子顯微鏡觀察線粒體自噬體結(jié)構(gòu)或者利用熒光染色LC3II等蛋白因子或線粒體特異性熒光探針TMRM，Mito Tracker和溶酶體特異性熒光探針LysoTracker進(jìn)行成像分析追蹤線粒體自噬的動(dòng)態(tài)過程[45-46]；2)流式細(xì)胞術(shù)檢測線粒體膜電位JC-1等強(qiáng)度變化，線粒體總量以及蛋白印跡分析線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)量的變化；3)利用LC3和Mitodsred等質(zhì)粒轉(zhuǎn)染構(gòu)建可視化模型觀察[47]。線粒體質(zhì)量分析主要是線粒體蛋白及mtDNA含量分析，同時(shí)檢測線粒體蛋白和DNA的損傷。評估線粒體能量學(xué)功能主要是通過Seahorse XF對線粒體呼吸代謝進(jìn)行定量分析，并結(jié)合線粒體呼吸鏈(ETC)中蛋白活力及含量等進(jìn)行具體分析(圖2)[48]。ATP酶和ATP含量的變化也可檢測線粒體能量代謝變化。線粒體氧化反應(yīng)檢測主要包括測定ROS含量、線粒體內(nèi)丙二醛以及抗氧化酶如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶等活性[49]。

ETC：呼吸代謝鏈 respiratory metabolic chain；ATP：三磷酸腺苷 adenosine triphosphate；LC3：自噬微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 autophagy microtubule-associated protein-1 light chain 3。

針對機(jī)體內(nèi)模型，研究開發(fā)了mito-Timer、mt-Keima和mito-QC小鼠模型，為研究生理應(yīng)激如何在體內(nèi)影響哺乳動(dòng)物的線粒體自噬開辟了一條新的途徑[50]。例如，經(jīng)過力竭運(yùn)動(dòng)的小鼠骨骼肌和心肌線粒體自噬增加。Sun等[51]利用mt-Keima報(bào)告對幾種應(yīng)激對肝臟線粒體噬的影響發(fā)現(xiàn)，在遭受長時(shí)間缺氧或損傷的線粒體聚合酶G的應(yīng)激小鼠中，線粒體自噬增加。

3 小結(jié)和展望

線粒體作為細(xì)胞中損傷的第1道防線以及代謝中樞，維持線粒體蛋白平衡和功能穩(wěn)定對緩解各種應(yīng)激，促進(jìn)細(xì)胞正常運(yùn)轉(zhuǎn)十分重要。近年來，通過刺激線粒體能量的產(chǎn)生、促進(jìn)線粒體代謝以及減輕氧化應(yīng)激等改善線粒體功能的手段，研究對繁殖期母豬及仔豬進(jìn)行營養(yǎng)干預(yù)提高其生產(chǎn)性能。靶向線粒體調(diào)控的營養(yǎng)物質(zhì)，既可以通過積極參與特定的線粒體生物化學(xué)途徑直接發(fā)揮其功能，也可以通過提高編碼線粒體蛋白的基因表達(dá)來間接發(fā)揮其功能。對于線粒體的蛋白平衡和功能調(diào)控的研究還需要深入，如何通過營養(yǎng)物質(zhì)調(diào)控線粒體蛋白平衡和功能完整也將逐漸成為緩解畜禽繁殖期機(jī)體應(yīng)激損傷的重點(diǎn)方向。