橡膠樹硫氧還蛋白基因HbCXXS1的克隆及表達分析

王帥 袁坤 何其光 胡義鈺 馮成天 王真輝 劉進平 劉輝

（1.海南大學熱帶作物學院，海口 570228；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院橡膠研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部橡膠樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室 省部共建國家重點實驗室培育基地-海南省熱帶作物栽培生理學重點實驗室，海口 571101）

橡膠樹（Hevea brasiliensis）是大戟科（Euphorbiaceae）的一種重要熱帶經(jīng)濟作物，其產(chǎn)生的膠乳是重要工業(yè)原料和戰(zhàn)略物資天然橡膠的主要來源。我國橡膠樹種植區(qū)主要分布在熱帶北緣的海南省、云南省和廣東省，處于非傳統(tǒng)植膠區(qū)，易受低溫寒害及干旱等非生物逆境危害。此外，橡膠樹死皮的發(fā)生率也比較高。橡膠樹死皮（或稱割面干涸，tapping panel dryness）是一種復雜的生理綜合癥，主要癥狀表現(xiàn)為割膠后割線局部或全部不排膠。橡膠樹死皮導致嚴重的產(chǎn)量和經(jīng)濟損失，是制約天然橡膠持續(xù)健康發(fā)展最主要的因素。分離鑒定調控橡膠樹非生物脅迫抗性和死皮的關鍵基因，不僅有助于解析橡膠樹逆境響應和死皮發(fā)生機制，還可為其遺傳改良提供基因資源。

硫氧還蛋白是廣泛存在于幾乎所有生物體中的一種低分子量可溶性蛋白，分子量一般為12 kD 左右［1-3］。絕大多數(shù)硫氧還蛋白具有保守的WC（G/P）PC 活性中心，極少數(shù)硫氧還蛋白活性中心的第二個半胱氨酸變成了絲氨酸，為CXXS［4-5］。植物硫氧還蛋白家族成員眾多，根據(jù)氨基酸序列及蛋白在細胞內(nèi)的定位，植物硫氧還蛋白被分為f、m、x、y、z、h 和o 等不同類型。其中，f、m、x、y 和z 型主要定位于葉綠體；o 型主要定位于線粒體和細胞核；h型主要定位于細胞質，但有的也定位于細胞核、線粒體或內(nèi)質網(wǎng)等［6-7］。h 型硫氧還蛋白是由多基因家族編碼的［8］，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、高粱（Sorghum bicolor）、毛果楊（Populus trichocarpa）和葡萄（Vitis vinifera）中分別有11、7、6、10 和6 個h 型硫氧還蛋白基因［9］。系統(tǒng)進化分析表明，h 型硫氧還蛋白可分為3 個亞組，亞組1 成員的活性中心為WC（G/P）PC，亞組2 成員的活性中心為WCGPC，亞組3 成員的活性中心為WCGPC 或非典型的CXXS［8］。擬南芥中有2 個CXXS 硫氧還蛋白，AtCXXS1和AtCXXS2［10-11］。此外，在毛果楊［12］、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）［13］等中也存在CXXS 硫氧還蛋白。

硫氧還蛋白通過巰基-二硫鍵的相互轉變調節(jié)細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，從而參與許多生物學進程，包括光合作用［14］、葉綠素生物合成［15］、植物再生［16］、種子萌發(fā)［13］、磷動態(tài)平衡［17］、激素合成及信號轉導［18］、非生物脅迫應答［19-20］、植物免疫反應［21］等。在各類植物硫氧還蛋白中，h 型硫氧還蛋白成員是最多的，功能也是最廣泛的。目前，已從多種植物中克隆并鑒定了h 型硫氧還蛋白基因，如擬南芥AtTRXh5［22］、水稻OsTRXh1［20］、花煙草（Nicotiana alata）NaTrxh［23］、甘蔗（Saccharumcomplex）Sc-TRXh1［24］、花生（Arachis hypogaea）AhTRXh［25］和小麥（Triticum aestivum）TaTrxh9［26］等。

2011年，Li 等［27］克隆并分析了橡膠樹h 型硫氧還蛋白基因HbTRX1的組織表達特性，但尚未見h型硫氧還蛋白基因在橡膠樹非生物脅迫應答和死皮中發(fā)揮功能的報道。Montoro 等［28］鑒定了與乙烯利誘導橡膠樹死皮相關的基因，發(fā)現(xiàn)一硫氧還蛋白編碼基因scaffold0616_558335（HbCXXS1）在死皮植株膠乳中表達顯著下調。

本研究克隆HbCXXS1，并對其進行系統(tǒng)生物信息學分析，重點分析該基因在橡膠樹各組織以及激素和非生物脅迫處理下的表達，為后續(xù)研究該基因的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

選取中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院試驗農(nóng)場六隊于2003年種植的橡膠樹品種熱研7-33-97 健康植株的嫩梢、成熟葉、衰老葉、雄花、雌花、樹皮和膠乳樣品，死皮植株膠乳取自割線死皮率在70%左右的死皮橡膠樹，根組織樣品取自移栽培養(yǎng)8 個月的熱研7-33-97 組培苗。各組織樣品采集后液氮速凍并磨碎，用于RNA提取。熱研7-33-97組培苗移栽培養(yǎng)8個月后，挑選長勢較好且一致的植株用于激素和非生物脅迫處理。

1.2 方法

1.2.1 激素和非生物脅迫處理 參考李雙江等［29］方法進行植株激素和非生物脅迫處理。脫落酸（ABA）、乙烯利（ETH）、茉莉酸甲酯（MeJA）、水楊酸（SA）和過氧化氫（H2O2）的處理濃度分別為200 μmol/L、10 mmol/L、200 μmol/L、5 mmol/L 和20 mmol/L。低溫處理溫度為4℃，采用400 mmol/L 的NaCl 溶液進行鹽脅迫處理，采用20%的PEG6000 溶液進行模擬干旱處理。分別在處理0、3、6、12、24 和48 h 時采集植株的第2、3 片葉，將3 株植株的葉片混為1個生物學樣品，每時間點取3 次生物學重復。樣品采集后液氮速凍并磨碎，用于RNA 提取。

1.2.2 總RNA 提取和反轉錄 采用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取膠乳總RNA，采用通用植物總RNA提取試劑盒（北京百泰克生物技術有限公司）提取嫩梢、成熟葉、衰老葉、雄花、雌花、樹皮和根的總RNA，具體提取方法參照試劑盒說明書。采用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000 超微量分光光度計（ThermoFisher 公司）檢測提取RNA 的質量和濃度。參 照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（TaKaRa）試劑盒說明書將RNA反轉錄合成第一鏈cDNA。

1.2.3HbCXXS1的克隆 從橡膠樹HeveaDB 數(shù)據(jù)庫（http://hevea.catas.cn/home/index）獲取scaffold0616_558335 的核苷酸序列，并在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行BLASTn 序列搜索，獲得該基因全長序列。利用Primer Premier 5.0 軟件設計擴增該基因完整開放閱讀框的引物（F：5′- AAAGTTGGCAAGCAGCATCT-3′和R：5′-CAAGCAACTCAAAACCCAGA-3′）。以膠乳cDNA 為模板，PCR 擴增目標基因，反應體系為cDNA 2 μL、5×TransStart?FastPfu Buffer 5 μL、Trans-Start?FastPfu DNA Polymerase（2.5 U/μL）0.5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、F 和R 引物（10 μmol/L）各0.5 μL 和ddH2O 14.5 μL。PCR 擴增程序為95℃ 3 min；95℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 45 s，38 個循環(huán)；72℃10 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測、回收，與pEASY?-Blunt Simple Cloning Vector（北京全式金生物技術有限公司）連接，轉化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞，挑取陽性單克隆送鉑尚生物技術（上海）有限公司測序。

1.2.4 生物信息學分析 使用在線數(shù)據(jù)庫SoftBerry（http://linux1.softberry.com/）中的FGENESH 程序預測基因開放閱讀框及編碼的氨基酸序列，通過在線程序Compute pI/Mw（http://web.expasy.org/compute_pi/）分析蛋白的分子量和等電點，使用CDD（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）、TMHMM 2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）和ProtScale（http://web.expasy.org/protscale）預測蛋白的保守結構域、跨膜結構域和親/疏水性，從NCBI 數(shù)據(jù)庫獲取其他植物h 型硫氧還蛋白序列，采用MEGA-X 軟件中Neighbor-joining算法構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.5 實時熒光定量PCR（qPCR）分析 采用Primer Premier 5.0 軟件設計用于qPCR 檢測HbCXXS1的特異引物（F：5′-AGGCTGATAAGCTTGTGGGT-3′，R：5′-GCTAGGTTTTGGAAGCACGA-3′）。以HbUBC4為內(nèi)參基因（F：5′-TCACCCTGAACCTGATAGCC-3′，R：5′-TTTCTTTGGTGACGCTGCAA-3′）。反應體系和反應條件參照TB Green?Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）（TaKaRa）說明書。采用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。使用Excel 2010 處理數(shù)據(jù)，并制作圖表。使用SAS 8.1 軟件進行差異顯著性分析，顯著性檢驗水平為P＜0.05。

2 結果

2.1 HbCXXS1的克隆及序列分析

通過NCBI 在線數(shù)據(jù)庫BLASTn 搜索，獲得scaffold0616_558335 完整序列，GenBank 登錄號為XM_021781025.1。根據(jù)該序列設計引物進行擴增，獲得一條與目的片段一致的條帶（圖1）。測序結果顯示，該片段長度為622 bp。預測其開放閱讀框為372 bp，編碼123 個氨基酸。蛋白序列比對結果表明，該基因與其他植物thioredoxin-like 蛋白CXXS1 具有較高的同源性，故將該基因命名為HbCXXS1。

圖1 HbCXXS1 的PCR 擴增Fig.1 PCR amplification of HbCXXS1 gene

預測HbCXXS1 蛋白的分子量為13.84 kD，理論等電點為5.67。保守結構域分析表明，HbCXXS1 含有硫氧還蛋白家族（TRX family）特有的保守結構域（位于第21-112 位氨基酸），其活性中心為CXXS，位于第42-45 位氨基酸，屬于h 型硫氧還蛋白（圖2-A）。跨膜結構域分析表明，HbCXXS1 蛋白不含跨膜結構域，為非跨膜蛋白（圖2-B）。蛋白質親/疏水性的預測結果（圖2-C）顯示，HbCXXS1 氨基酸序列第66 位蘇氨酸分值最大，為1.733，是疏水性最強的氨基酸；第106 位谷氨酸分值最小，為-2.078，是親水性最強的氨基酸。HbCXXS1 的親水性平均系數(shù)為-0.016，屬于親水性蛋白。

圖2 HbCXXS1 蛋白保守結構域（A）、跨膜結構域（B）和親/疏水性（C）分析Fig.2 Conserved domain（A），transmembrane domain（B）and hydrophilicity/hydrophobicity（C）analysis of HbCXXS1 protein

2.2 HbCXXS1蛋白的系統(tǒng)進化樹分析

對HbCXXS1 蛋白序列進行BLASTp 同源性比對發(fā)現(xiàn)，HbCXXS1 與木薯（Manihot esculenta）MeCXXS1（XP_021595727.1）、橡膠樹HbTRXh（AA D33596.1）和擬南芥AtCXXS1（NP_172620.1）的同源性分別為80.31%、72.50% 和63.72%，而與水稻OsTRX18 的同源性僅為38.14%。為進一步探究HbCXXS1 與其他植物h 型硫氧還蛋白的進化關系，構建HbCXXS1 與其他植物h 型硫氧還蛋白的系統(tǒng)進化樹（圖3），21 個h 型硫氧還蛋白被分為3組。擬南芥AtTRX1、AtTRX3 和AtTRX4、麻瘋樹（Jatropha carcas）JcTRXh、陸地棉（Gossypium hirsutum）GhTRXh、水稻OsTRXh1、玉米（Zea mays）ZmTRXh 聚為第I 組；擬南芥AtTRXh7 和AtTRXh8、水稻OsTRX10、歐美雜種山楊（Populus tremula×P.tremuloides）PpTRXh2、橡膠樹HbTRXh7 和木薯MeTRXh7 聚類在第II 組；橡膠樹HbCXXS1與擬南芥AtCXXS1、AtCXXS2 和AtTRXh10、木薯MeCXXS1、水稻OsTRX18、葡萄VvTRXh 聚為第III組。其中，HbCXXS1 與MeCXXS1 處于同一進化分支，親緣關系最近。

圖3 HbCXXS1 和其他植物h 型硫氧還蛋白的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of HbCXXS1 and thioredoxin h proteins in other plants

2.3 HbCXXS1的組織表達模式

HbCXXS1在橡膠樹嫩梢、成熟葉、衰老葉、雄花、雌花、樹皮、膠乳和根中表達如圖4-A 所示。HbCXXS1在各組織中均有表達，但表達水平存在顯著差異。HbCXXS1在膠乳中的表達量最高，顯著高于其他組織；其次是雄花，但表達量僅為膠乳中的1/5；表達量最低的組織是衰老葉，其表達量不足膠乳的1%。由此可見，HbCXXS1主要在膠乳中表達。并且HbCXXS1在死皮植株膠乳中的表達顯著低于健康植株（圖4-B）。

圖4 HbCXXS1 在橡膠樹各組織（A）以及健康與死皮植株膠乳（B）中的表達Fig.4 Expressions of HbCXXS1 in various tissues（A）and latex from healthy and TPD rubber tree（B）

2.4 激素處理對HbCXXS1表達的影響

HbCXXS1在ABA、ETH、MeJA 和SA 處理后不同時間點的表達變化如圖5所示。ABA 處理顯著抑制了HbCXXS1的表達，在處理6 和12 h 時，表達量約為處理前的1/2。此后，HbCXXS1的表達逐步回升，在處理24 h 后基本恢復到正常水平。ETH 處理使HbCXXS1表達上調，在處理前24 h，HbCXXS1的表達無顯著變化，在處理48 h 時，其表達顯著上調，為處理前表達量的2.4 倍。MeJA 處理也顯著抑制了HbCXXS1的表達，在處理3 和12 h 時，HbCXXS1的表達顯著降低。其中，處理12 h 時，HbCXXS1的表達量最低，約為處理前的1/2。SA 處理也會影響HbCXXS1的表達，在處理6 和24 h 時，HbCXXS1的表達顯著降低，而在處理12 h 時，其表達量顯著上調。以上結果表明，HbCXXS1的表達受ABA、ETH、MeJA 和SA 等激素調控。

圖5 激素處理后HbCXXS1 的表達變化Fig.5 Expression change of HbCXXS1 after hormone treatment

2.5 非生物脅迫下HbCXXS1的表達分析

HbCXXS1在低溫、PEG 誘導干旱、鹽和H2O2誘導的氧化脅迫下的表達變化如圖6所示。低溫處理誘導HbCXXS1表達，與對照相比，在處理3 h 時，HbCXXS1的表達顯著上調，之后，其表達回歸正常水平。干旱和鹽脅迫下，HbCXXS1的表達變化趨勢基本一致，整體呈逐步降低趨勢，二者均在處理48 h 時表達量最低，分別為處理前的20%和2%。氧化脅迫下，HbCXXS1的表達先降低后升高，在處理6 h 時，HbCXXS1的表達降至最低（約為處理前的1/2），此后逐步回升，在處理12 和24 h 時，其表達量仍顯著低于處理前，但在處理48 h 時則顯著高于處理前。以上結果表明，HbCXXS1的表達受低溫、干旱、鹽和氧化等非生物逆境脅迫調控。

圖6 非生物脅迫下HbCXXS1 的表達變化Fig.6 Expression change of HbCXXS1 under abiotic stress

3 討論

本研究從橡膠樹中克隆了硫氧還蛋白基因HbCXXS1，蛋白保守結構域分析表明，HbCXXS1 含有硫氧還蛋白保守結構域。與大多數(shù)硫氧還蛋白具有典型的WC（G/P）PC 活性中心不同，HbCXXS1的活性中心為非典型的CXXS，屬于h 型硫氧還蛋白。Gelhaye 等［8］和Renard 等［13］研究結果表明，h型硫氧還蛋白可分為3 組。本研究對HbCXXS1 及其他植物h 型硫氧還蛋白進行了系統(tǒng)進化分析，結果表明，這些h 型硫氧還蛋白分為3 組，HbCXXS1與其他植物CXXS 硫氧還蛋白均屬于第III 組，這與Gelhaye 等［8］和Renard 等［13］結果一致。

Nuruzzaman 等［30］對水稻硫氧還蛋白家族基因的研究表明，不同硫氧還蛋白基因具有不同的組織表達模式，一些硫氧還蛋白基因的表達具有組織特異性。本研究分析了HbCXXS1在橡膠樹各組織中的表達，發(fā)現(xiàn)該基因在橡膠樹各組織中均有表達，但在膠乳中的表達顯著高于其他組織。Li 等［27］研究也發(fā)現(xiàn)，該基因在膠乳和愈傷組織中的表達明顯高于其他組織。此外，本研究和Montoro 等［28］研究均發(fā)現(xiàn)，HbCXXS1在死皮植株膠乳中的表達顯著低于健康植株。橡膠樹死皮后，膠乳產(chǎn)量明顯降低。HbCXXS1在膠乳中高表達，而在產(chǎn)排膠障礙的死皮植株膠乳中的表達顯著下調，暗示HbCXXS1可能在橡膠樹產(chǎn)排膠過程中發(fā)揮重要作用。

植物激素作為信號分子在基因表達調控中起著重要作用。郭晉隆等［24］研究發(fā)現(xiàn)，甘蔗ScTRXh1的表達受ABA 的抑制而受SA 的誘導。小麥葉片中TaTrxh9的表達也受ABA 的抑制［26］。為明確植物激素對HbCXXS1表達的調控作用，本研究分析了ABA、ETH、MeJA 和SA 處理對HbCXXS1表達的影響。ABA 和MeJA 處理均抑制了HbCXXS1的表達，但兩處理下HbCXXS1的表達模式略有不同。ABA 處理后，HbCXXS1表達量的顯著降低發(fā)生在6 h 和12 h，而MeJA 處理后，HbCXXS1表達量的顯著降低發(fā)生在3 h 和12 h。與SA 處理上調ScTRXh1的表達不同，SA 處理后不同時間點HbCXXS1的表達有上調也有下調，處理6 h 和24 h 時，HbCXXS1的表達顯著下調，而處理12 h 時，HbCXXS1的表達顯著上調。ETH 處理也上調了HbCXXS1的表達，但上調發(fā)生在處理48 h 時。由此可見，HbCXXS1的表達受植物激素調控，但其對不同激素的響應模式存在差異。由于本研究未檢測HbCXXS1在正常條件下不同時間點的表達，也不排除其表達受生物鐘的影響。激素處理后，HbCXXS1的表達模式各不相同或許是激素和生物鐘共同調控的結果。后續(xù)應檢測HbCXXS1在正常條件下不同時間點的表達，以確定其表達是否受生物鐘調控。

植物在非生物逆境脅迫下，活性氧會過量積累，導致氧化還原狀態(tài)的失衡，對細胞造成損害。調節(jié)和維持細胞氧化還原平衡是植物抵御非生物逆境脅迫的重要生化調控途徑［26］。研究表明，硫氧還蛋白是一類調控植物生長發(fā)育和非生物脅迫應答的重要氧化還原蛋白［31］。目前，已從許多植物中鑒定了參與非生物脅迫應答的硫氧還蛋白基因，如水稻OsTRXh1［20］、甘蔗ScTRXh1［24］和小麥TaTrxh9［26］等。本研究發(fā)現(xiàn)，HbCXXS1的表達受低溫、干旱、鹽和氧化脅迫調節(jié)。其中，干旱和鹽脅迫以及氧化脅迫的早期顯著抑制了HbCXXS1的表達。此外，HbCXXS1在死皮植株膠乳中的表達也被顯著抑制，而橡膠樹死皮的發(fā)生與氧化還原平衡失衡密切相關［32］。由此推測，HbCXXS1可能通過調節(jié)氧化還原平衡參與橡膠樹死皮及非生物脅迫應答。HbCXXS1表達的下調可能會降低植株對非生物脅迫的抗性，并使植株更容易發(fā)生死皮。通過基因工程手段過表達HbCXXS1或許能改良橡膠樹對非生物脅迫的抗性以及降低死皮的發(fā)生。

4 結論

從橡膠樹中克隆了硫氧還蛋白基因HbCXXS1，其開放閱讀框長372 bp，編碼123 個氨基酸。HbCXXS1 蛋白分子量為13.84 kD，等電點為5.67，屬于親水性蛋白，活性中心為CXXS，屬于h 型硫氧還蛋白的第III 組。HbCXXS1在橡膠樹膠乳中的表達顯著高于其他組織，且在死皮植株膠乳中的表達被顯著抑制。HbCXXS1的表達受ABA、ETH、MeJA 和SA 等激素以及低溫、干旱、鹽和氧化脅迫等非生物逆境調節(jié)，可能參與了橡膠樹產(chǎn)排膠和非生物脅迫應答調控。