覃紅菊，吳心雨，肖 強*

(1.湖北民族大學 林學園藝學院，湖北 恩施 445000；2.生物資源保護與利用湖北省重點實驗室，湖北 恩施 445000)

尖葉四照花(Cornuselliptica)是山茱萸科(Cornaceae)四照花屬(Cornus)常綠喬木，又稱為山荔枝、野荔枝、石棗等.當前，學者對尖葉四照花植物的開發(fā)利用大多聚焦于觀賞價值、果實食用性、藥用價值等方面.對尖葉四照花化學成分的研究，主要圍繞多酚類、環(huán)烯醚萜苷、三萜、甾醇及有機酸類化合物進行[1-2]；但對于尖葉四照花葉片中具有重要生物活性的多糖物質(zhì)的研究則未見報道.

多糖即多聚糖(polysaccharide)，廣泛分布在動、植物細胞中，由聚合度超過10個單糖以上的聚糖組成.多糖來源廣泛，是高等植物和動物細胞膜、微生物細胞壁中的重要組成物質(zhì)[3].研究表明，多糖具有免疫調(diào)節(jié)[4]、抗氧化[5]、抗腫瘤[6]及其他多種生物活性[7].目前香菇多糖、靈芝多糖、云芝多糖已在國內(nèi)外臨床上廣泛應(yīng)用，其他多糖也正在深入研究與開發(fā)中[8].在多糖研究中，快速測定樣品的多糖含量，對于高效優(yōu)化多糖提取、純化工藝具有重要應(yīng)用價值；目前常用苯酚-濃硫酸法測定多糖含量,但該法存在耗時長、試劑腐蝕性高等缺陷.

近年來熒光光譜法作為一種新的光譜分析方法[9-10]，在生物大分子以及離子締合物的分析中應(yīng)用越來越廣泛，可以用于多糖[11]、核酸[12]、蛋白質(zhì)[13]、無機離子[14]等的測定.熒光光譜法能檢測出許多分光光度法無法檢測的物質(zhì)，并且所需試劑易得、操作簡單易行、靈敏度高、選擇性強、用樣量少，有利于對微量樣品的測定[15].因此本實驗采用熒光光譜法測定尖葉四照花葉片多糖含量，為后續(xù)對該多糖的分離純化提供高效的多糖檢測手段；并在此基礎(chǔ)上，開展該多糖的體外抗氧化測定，為實現(xiàn)尖葉四照花葉片多糖的有效開發(fā)提供初步依據(jù).

1 材料與儀器

1.1 實驗材料與試劑

尖葉四照花葉片采自湖北省恩施市湖北民族大學，葉片鮮綠成熟無病害.清洗后，烘干、粉碎、過80目篩后貯存在干燥器中密封備用.

試劑包括石油醚、無水乙醇、葡萄糖標準品、濃硫酸、氫氧化鈉(NaOH)、葡聚糖凝膠G-100、十二烷基苯磺酸鈉(SDBS)、氯化十六烷基吡啶(CPC)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、抗壞血酸(Vc).

1.2 實驗儀器

儀器包括熒光分光光度計(日本日立公司，F(xiàn)-4600)、紫外-可見光分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司，TU-1901)、低速臺式離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司，H2050R)、冷凍干燥機(德國Christ公司，ALPHA1-2LD)、數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海力辰邦西儀器科技有限公司,HH-2).

2 實驗方法

2.1 尖葉四照花葉片多糖的制備

稱取10 g經(jīng)脫脂、脫單糖的尖葉四照花葉片粉末，按1∶20(g/mL)的料液比加入超純水，提取溫度為70 ℃，提取時間為3 h，冷卻后離心，離心溫度為4 ℃，轉(zhuǎn)速為10 000 r/min，時間為20 min.取上清液，加入4倍體積的無水乙醇，醇沉過夜，離心后取沉淀，加10 mL蒸餾水溶解得到尖葉四照花葉片粗多糖，然后使用木瓜蛋白酶[10]和TCA溶液[16-17]進行脫蛋白處理得所需樣品液.使用葡聚糖凝膠柱純化樣品液，得到純化后的多糖用于后續(xù)實驗.

2.2 熒光光譜法測定葉片多糖

2.2.2 標準曲線的繪制 將尖葉四照花葉片純化多糖按梯度配置成不同質(zhì)量濃度的標準品溶液.按照“2.2.1測定方法”，做3次平行實驗，橫軸為多糖標準品濃度(c，μg/mL)，縱軸為共振光散射強度(ΔIRLS)，得出多糖的線性方程:ΔIRLS=84.472c+23.24，R2=0.997 1，線性范圍為3～18 μg/mL.

2.2.3 波長與表面活性劑的選擇 本實驗將從CPC、CTAB、SDBS 3種表面活性劑中比較選擇.比較200～800 nm波長范圍內(nèi)，不同表面活性劑與多糖結(jié)合后在NaOH溶液中的共振光散射強度及其單獨在NaOH溶液中的共振光散射強度，選用共振光散射強度差值最大的物質(zhì)作為最佳表面活性劑，選用最佳表面活性劑下的最大散射波長作為測定波長.

2.3 單因素實驗

2.3.1 NaOH溶液濃度對ΔIRLS的影響 按照“2.2.1測定方法”，分別選取0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mol/L不同濃度梯度的NaOH溶液，其他條件均相同，進行單因素實驗.當NaOH溶液濃度為0.9 mol/L時，ΔIRLS最大，故NaOH溶液最佳濃度為0.9 mol/L.

2.3.2 CTAB溶液濃度對ΔIRLS的影響 按照“2.2.1測定方法”，分別選取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mmol/L不同濃度梯度的CTAB溶液，其他條件均相同，進行單因素實驗.當CTAB溶液濃度為3.0 mmol/L時，ΔIRLS最大，故CTAB溶液最佳濃度為3.0 mmol/L.

2.3.3 反應(yīng)時間對ΔIRLS的影響 按照“2.2.1測定方法”，分別選取10、20、30、40、50、60 min的反應(yīng)時間，其他條件均相同，進行單因素實驗.當反應(yīng)時間為30 min時，ΔIRLS最大.故最優(yōu)反應(yīng)時間為30 min.

表1 正交實驗水平Tab.1 Orthogonal experiment level

2.4 正交實驗

基于最佳波長及表面活性劑的選擇，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以 NaOH溶液濃度(A)、CTAB溶液濃度(B)和反應(yīng)時間(C)為自變量，以ΔIRLS為因變量.確定熒光光譜法測定尖葉四照花葉片多糖含量的最優(yōu)反應(yīng)條件，如表1所示.

2.5 苯酚-濃硫酸法測定多糖含量

將葡萄糖標準品分別配制成質(zhì)量濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/mL的標準葡萄糖溶液，分別取1 mL置于具塞試管中，再分別加入1 mL 6% 苯酚溶液，搖勻后再加濃硫酸5.0 mL，混合均勻后置于90 ℃恒溫水浴鍋中水浴加熱15 min，冷卻至室溫，在490 nm波長處測吸光度[18].得到標準曲線為y=0.008 3x+0.015 7，R2=0.998 7.

2.6 抗氧化活性分析

2.6.1 DPPH自由基清除實驗 分別取2 mL多糖溶液、2 mL DPPH溶液，混合均勻，室溫放置30 min 后，5 000 r/min 離心10 min，測定其上清液在517 nm波長處的吸光度A1，同時測定樣品溶液在517 nm處的吸光度Ax及DPPH溶液在517 nm處的吸光度A2[19]；以同等濃度Vc作為陽性對照組，平行測定3次.清除率計算公式為：ADPPH?=[1-(A1-Ax)/A2]×100%.式中：ADPPH?表示DPPH自由基清除率.

圖1 CPC體系IRLS光譜Fig.1 CPC system IRLS spectroscopy

3 結(jié)果與分析

3.1 波長及表面活性劑的選擇

本研究對CPC、CTAB、SDBS 3種表面活性劑進行比較，如圖1～3所示.由于尖葉四照花葉片多糖為酸性多糖，帶有陰離子，CTAB和CPC表面活性劑為陽離子，在靜電作用下他們會互相結(jié)合形成體積較大的粒子，而SDBS為陰離子表面活性劑，尖葉四照花葉片多糖與其結(jié)合較難或無法結(jié)合.由瑞利散射公式[21]可知，粒子體積越大，共振光散射越強.所以CTAB體系下的共振光散射強度大于CPC體系且遠大于SDBS體系.因此選擇CTAB為表面活性劑，選用CTAB體系下的最大散射波長370 nm作為熒光光譜法的測定波長.

3.2 單因素實驗

1) NaOH溶液濃度對ΔIRLS的影響如圖4所示.當NaOH溶液濃度逐漸升高時，ΔIRLS先升后降，最適濃度為0.9 mol/L.這是由于適當?shù)膲A性條件可以誘導尖葉四照花葉片多糖產(chǎn)生更多的負電荷，增強其與CTAB表面活性劑之間的靜電作用.當NaOH濃度大于最適濃度后，堿性強度超過尖葉四照花葉片多糖可承受范圍就會使尖葉四照花葉片多糖降解，導致ΔIRLS下降.此結(jié)果與成芳等[22]得出的熒光光譜法測紅豆杉葉片的最佳NaOH溶液濃度為1 mol/L相近，證明這一實驗結(jié)果具有可行性.

圖2 CTAB體系IRLS光譜圖3 SDBS體系IRLS光譜 Fig.2 CTAB system IRLS spectroscopy Fig.3 SDBS system IRLS spectroscopy

2) CTAB溶液濃度對ΔIRLS的影響如圖5所示.CTAB最適濃度為3.0 mmol/L，當CTAB溶液濃度升高時，ΔIRLS先升高后下降.這是由于隨著CTAB濃度的升高，其與尖葉四照花葉片多糖結(jié)合形成的粒子締合物也就越多，而CTAB溶液濃度超過最適濃度時分子可能發(fā)生自聚合作用，與多糖的締合作用減弱，就會導致共振光散射強度差值(ΔIRLS)下降.此結(jié)果與郭宗寧等[23]通過共振光散射法測定核酸的實驗中CTAB溶液濃度的最佳條件0.1 mmol/L有較大差距，可能是由于多糖、核酸與CTAB結(jié)合程度不同導致的.

圖4 NaOH溶液濃度對共振光散射強度的影響圖5 CTAB溶液濃度對共振光散射強度的影響

圖6 反應(yīng)時間對共振光散射強度的影響Fig.6 Effect of reaction time on the intensity of resonance light scattering

3) 反應(yīng)時間對ΔIRLS的影響如圖6所示.當反應(yīng)時間逐漸增加時，ΔIRLS先升高后下降，但在10～60 min的反應(yīng)時間里，共振光散射強度基本穩(wěn)定，最適反應(yīng)時間為30 min.朱夢等[24]通過熒光光譜法測異煙肼多糖的實驗中最佳反應(yīng)時間為25 min，與本實驗基本相同.當反應(yīng)時間超過30 min時，ΔIRLS有所下降可能是由于空氣中的氧氣長時間接觸尖葉四照花葉片多糖發(fā)生氧化.

3.3 正交實驗

基于單因素實驗結(jié)果，進行正交實驗(3因素3水平)(L33)，如表2所示.由表2可知，對ΔIRLS的影響主次順序為：NaOH溶液濃度>CTAB溶液濃度>反應(yīng)時間，對ΔIRLS的各影響因素3個水平間優(yōu)勢為：A2>A3>A1，B2>B1>B3，C2>C1>C3.所以最優(yōu)反應(yīng)條件為：0.9 mol/L NaOH溶液，3.0 mmol/L CTAB溶液，30 min反應(yīng)時間.以上述條件進行3組平行實驗.測得ΔIRLS分別為1 396.3、1 413.7、1 409.5,平均值為1 406.5，相對標準偏差為0.53%，小于5.0%，說明正交實驗結(jié)果具有科學性.

表2 L33正交實驗結(jié)果Tab.2 L33 orthogonal test results

表3 ΔIRLS法與苯酚-濃硫酸法測定結(jié)果比較Tab.3 Comparison of ΔIRLS method and phenol sulfuric acid method

3.4 不同測定方法結(jié)果比較

ΔIRLS法與苯酚-濃硫酸法含量測定結(jié)果比較如表3所示.由表3可知，采用熒光光譜法測定尖葉四照花葉片多糖平均含量為28.13±0.15 mg/g，苯酚-硫酸法測定尖葉四照花葉片多糖平均含量為31.27±0.46 mg/g，結(jié)果差距不大，證明熒光光譜法測定尖葉四照花葉片多糖含量的方法具有可行性.

3.5 多糖抗氧化活性

圖7 尖葉四照花葉片多糖對DPPH自由基的清除作用 圖8 尖葉四照花葉片多糖對自由基的清除作用

4 結(jié)論