張濤 譯自，Vol.287(2020)，10月

王祎汀 校 李 紅 審

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是一種病毒性、出血性疾病，對家豬和歐亞野豬具有極高的致死率。盡管引發(fā)該病的病毒——非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV) 的宿主范圍有限，也不可能會引發(fā)人畜共患病，但其對社會、經(jīng)濟(jì)的影響非常大，許多利益相關(guān)者都被牽涉其中。出于這個原因，一旦豬群暴發(fā)該病，發(fā)病地的相關(guān)行業(yè)管理部門應(yīng)向世界動物衛(wèi)生組織通報。目前，對非洲豬瘟的控制仍依賴于嚴(yán)格的衛(wèi)生措施，因為現(xiàn)今既沒有獲得許可的疫苗，也沒有任何有效的治療方法。

1 非洲豬瘟的診斷

1.1 目前的技術(shù)水平和障礙

在實際生產(chǎn)中，當(dāng)對ASF 執(zhí)行早期預(yù)警、及時干預(yù)和監(jiān)測時，采用快速和可靠的診斷方法極為重要。好的檢測方法應(yīng)能夠檢測ASFV的所有基因型和突變體，具有高靈敏度和特異性，應(yīng)根據(jù)世界動物衛(wèi)生組織的指南驗證，且易于操作，能夠快速解釋檢測結(jié)果。另外，應(yīng)始終以合理的價格提供，能適應(yīng)于高通量的應(yīng)用。這種檢測需要伴隨潛在的能夠區(qū)分野毒株感染動物和疫苗接種動物(differentiating infected from vaccinated animal，DIVA)。顯然，并非所有的特性都能同時滿足，為此，應(yīng)建立診斷工作流程，考慮所用檢測方法的優(yōu)點和缺點。這可能包括使用欄邊檢測法(pen-side approaches)，也包括替代性或非侵入性的采樣策略。后者對診斷野豬群是否感染ASF 具有特殊意義。最近研究人員探討了通過豬的唾液、拭子樣本或誘餌來檢測病原體，并證明這些方法可用于豬瘟的檢測。

由于需要向世界動物衛(wèi)生組織通報，相關(guān)建議和法律都對實驗室診斷進(jìn)行了規(guī)定。診斷方法和準(zhǔn)則可在《世界動物衛(wèi)生組織陸生動物診斷試驗和疫苗手冊》(OIE，2019)，或歐盟ASF參考實驗室官網(wǎng)(https://asf-referencelab.info/asf/en/procedures-diagnosis/sops) 上找到。鑒于ASF 在一些歐盟成員國，特別是在西班牙和葡萄牙的歷史意義，針對非洲豬瘟的診斷指南和法律條文已經(jīng)相當(dāng)成熟，歐洲以外的國家可以直接借鑒這些指南和法律條文。

總的來說，現(xiàn)有針對ASF 的可靠的直接和間接診斷方法對家豬和野豬的特定樣本都能發(fā)揮作用。當(dāng)檢測來自家豬或野豬的高質(zhì)量樣本時，檢測的準(zhǔn)確性沒有差別(它們實際上是同一物種)。這些檢測方法包括從豬巨噬細(xì)胞分離病毒、(實時)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzymelinked immunosorbent assays，ELISA)、免疫印跡和間接免疫染色標(biāo)記技術(shù)。然而，直到最近，這些測試方法中的大部分都是建立在“內(nèi)部”準(zhǔn)則基礎(chǔ)上的，只有通過使用實驗室間的對比測試才能保證檢測結(jié)果的可比性。對于資源有限的國家而言，經(jīng)過充分驗證和易于使用的測試系統(tǒng)才有利于推廣使用。在這里，定價合理且不需要額外耗材的商用試劑盒是關(guān)鍵。

目前的情況和以方法論為導(dǎo)向的研究項目已經(jīng)促使這種情況有所改善，一些ELISA、實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)以及側(cè)流檢測(lateral flow assay，LFA)試劑盒已經(jīng)進(jìn)入市場。事實上，用于診斷ASF 的商用PCR 方法和ELISA 方法的種類越來越多，制造商分布在全球各地。雖然大多數(shù)檢測都能正常工作，但并不總是存在可比較的數(shù)據(jù)。由于德國對該國用于法定動物傳染病和須報告動物傳染病的任何檢測試劑盒都有官方許可程序，因此此類試劑盒有基本的數(shù)據(jù)，并且可以在德國官方收集的法定動物傳染病的檢測方法(https://www.fli.de/en/publications/amtliche-methodensammlung/) 中總是可以找到最新的清單。到目前為止，德國已經(jīng)批準(zhǔn)了8 種商用實時PCR 方法，并在地區(qū)實驗室中用于排除性診斷和監(jiān)測。所有這些檢測方法都已在德國國家參考實驗室(national reference laboratory，NRL)用一組確定的實驗樣本進(jìn)行了測試，這些樣本代表ASFV 的不同基因型(主要是ASFV 基因Ⅰ型和Ⅱ型)、宿主物種、基質(zhì)和感染狀態(tài)。Schlottau 已經(jīng)在德國國家實驗室對其中一些商用PCR 方法和三種日常使用的自動提取方法進(jìn)行了更詳細(xì)的比較。根據(jù)制造商提供的使用說明書，在KingFisher 提取平臺(Thermo Fisher Scientific) 上使用NucleoMag? VET(Macherey-Nagel)、MagAttract Virus M48(Qiagen) 和MagMAXTMCORE(Thermo Fisher Scientific，workflow C)試劑盒提取核酸?？偟膩碚f，所有的試劑盒都是合適的，在下游應(yīng)用中可以給出可靠的結(jié)果。在PCR 試劑盒方面，King 等對virotype ASFV PCR 試劑盒、INgene q PPA 試劑盒、RealPCR ASFV DNA和ID GeneTM非洲豬瘟Duplex 進(jìn)行了相互之間的比較同時與世界動物衛(wèi)生組織推薦的檢測法進(jìn)行比較。所有的試劑盒都能給出可靠的結(jié)果，但在使用不能令人信服的樣本時有略微的差異。最近，Schoder 等發(fā)表了用7 種市售PCR 試劑盒和3 種PCR 組合試劑盒檢測樣本中ASFV 的比較數(shù)據(jù)，這些試劑盒分別為：virotype ASFV 2.0 PCR 試劑盒，Adiavet ASFV Fast Time，Bio-T kit ASFV，VetMax ASFV 檢測試劑盒，RT-PCR ASFV DNA Test，VetAlert ASF PCR 檢測試劑盒，以及ID GeneTMASF Duplex。簡而言之，研究人員在2018—2019 年ASF 疫情暴發(fā)期間，對比利時收集的300 份特征明顯的野豬樣本進(jìn)行了敏感性和特異性測試。這項研究證實，所有商用試劑盒和三分之二的Taq 聚合酶適用于診斷實驗室進(jìn)行ASFV 檢測。這與上述經(jīng)驗相符，并證實了商用試劑盒適用于快速和用戶友好型診斷。

對于抗體檢測，德國目前有三種商用ELISA方法被批準(zhǔn)用于ASF 的血清學(xué)診斷。這些檢測方法使用不同的抗原，因此可以并行使用。除了基于p72 蛋白的阻斷ELISA，還有一個間接檢測方法，使用p72 蛋白、p62 蛋白和p32 蛋白的抗原混合物(ID Screen? ASF間接ELISA)。此外，一種基于p32 蛋白的競爭性ELISA 最近已被批準(zhǔn)。至于國際上的許多檢測方法，它們的性能不容易評估。

差距和進(jìn)一步研究的方向：

○必須改進(jìn)病毒分離技術(shù)，并進(jìn)一步優(yōu)化細(xì)胞系，以便能夠檢測和充分復(fù)制田間毒株。

○應(yīng)對ASFV 幸存者以及持續(xù)感染的家豬和野豬的抗體和病毒生長動力學(xué)進(jìn)行更詳細(xì)的調(diào)查研究。

○應(yīng)進(jìn)一步分析ASFV 在環(huán)境中的存活時間。

○需要統(tǒng)一ASFV 的遺傳標(biāo)記，并進(jìn)一步協(xié)商用于協(xié)調(diào)分析的基因組區(qū)域。

○為優(yōu)化疾病控制，應(yīng)改進(jìn)無創(chuàng)(noninvasive)采樣技術(shù)和即時/現(xiàn)場診斷法。

○一般來說，應(yīng)對診斷方法、流程和技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的協(xié)調(diào)、標(biāo)準(zhǔn)化和普及。ASFV診斷的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(standard operating procedures，SOP)應(yīng)作為全球標(biāo)準(zhǔn)來提供。

在過去幾年診斷檢測方法已經(jīng)得到了很大程度的改進(jìn)，但仍然需要進(jìn)行協(xié)調(diào)，制定適應(yīng)新形勢的診斷工作流程以及疾病生物學(xué)常識，以助于人們進(jìn)一步校準(zhǔn)檢測方法(另見GARA差距分析報告，https://www.ars.usda.gov/GARA/)。

2 非洲豬瘟的防控

2.1 控制策略

大多數(shù)生豬產(chǎn)量巨大的國家都會對重大豬病的監(jiān)測和控制制定一個具有約束力的法律概要?？刂拼胧┲胁豢苫蛉钡牟糠质羌皶r且可靠的診斷，撲殺感染豬群，劃出限制區(qū)，限制豬群的流動，追蹤可能的接觸者。目前尚無可用的預(yù)防性疫苗和其他有效的治療方法，但歐盟和其他國家將會嚴(yán)格禁止使用。法律概要的一個例子是歐盟層面的立法，它是基于20 世紀(jì)60 年代到90 年代ASF 暴發(fā)期間積累的經(jīng)驗，雖然該法律可能不適用于資源有限的國家，但其基本原則可以在全球范圍內(nèi)應(yīng)用。因此，本文概述了一些總體要點。目前，歐盟理事會第2002/60/EC 指令規(guī)定了控制ASF 的最低共同體措施。有些章節(jié)專門介紹了在疫情可疑情況下、疫情確診情況下、疫情曾暴發(fā)過情況下的措施，接觸豬群和流行病學(xué)調(diào)查中的措施，保護(hù)區(qū)和監(jiān)測區(qū)的建立，清潔和消毒，解除限制和重新組群所采取的措施，并詳細(xì)說明了特殊情況，如對屠宰場的懷疑。歐盟委員會第2003/422/EC 號指令詳細(xì)說明了控制措施，并就診斷程序、采樣方法、檢測結(jié)果的評估標(biāo)準(zhǔn)、生物安全要求以及實驗室檢測的原則和應(yīng)用提供了指南和最低要求。歐盟層面的法律框架經(jīng)修改，在2021 年被新的動物衛(wèi)生法取代?；驹瓌t保持不變。

控制措施的實施取決于獸醫(yī)服務(wù)部門的資源和對這些措施的遵守情況。遵守措施的一個關(guān)鍵點是及時和適當(dāng)?shù)难a償方案。正如在非洲和亞洲所看到的情況那樣，由于缺乏補償，病豬會出售給屠宰場和市場，從而造成ASF 大規(guī)模地暴發(fā)。

對于野豬的傳染周期，在制定控制措施時必須考慮當(dāng)?shù)氐那闆r。目前，人們經(jīng)常使用捷克共和國控制ASF 的案例，因為這是(到目前為止)唯一一個將ASF 完全從野豬種群中凈化的國家。根據(jù)這些成功的案例，控制策略可以包括以下內(nèi)容：分區(qū)確定感染區(qū)、周圍緩沖區(qū)和控制區(qū)。這些區(qū)域應(yīng)盡快建立，并應(yīng)足夠大。應(yīng)搜索病死豬的尸體，并進(jìn)行無害化處理。獎勵發(fā)現(xiàn)病死豬尸體的人可以提高控制措施的遵守率和成功率。在感染區(qū)，應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行禁獵期(strict hunting rest)。如果已經(jīng)確定并且合適，可以允許誘捕。設(shè)置隔離柵欄已被證明能夠有效控制ASFV 的傳播，可以根據(jù)當(dāng)?shù)氐那闆r加以應(yīng)用。柵欄不能防豬，但可以將病毒傳播速度降到最低。在可能的情況下，可以實施禁止進(jìn)入的措施。該措施可以用來減少周圍地區(qū)的野豬，但必須針對每個案例單獨做出決定。

一旦ASF 進(jìn)入了比較流行的階段，應(yīng)調(diào)整劃分的區(qū)域，如果可行的話，可以討論撲殺剩余的野豬。但該策略必須考慮適用的動物福利和風(fēng)險因素。應(yīng)減少疫區(qū)外的野豬數(shù)量。比利時當(dāng)局采取了極為類似的措施，取得了明顯的效 果(https://www.wallonie.be/fr/pesteporcine-africaine)。

2.2 差距和進(jìn)一步研究的方向

○事實證明，控制農(nóng)村和庭院式飼養(yǎng)環(huán)境中豬的ASF 是非常困難的，應(yīng)制定和應(yīng)用適應(yīng)性強(qiáng)——即在各地區(qū)有較高接受度——的策略。

○對感染野豬群的控制措施需要進(jìn)一步優(yōu)化，必須考慮不同區(qū)域的條件。

○應(yīng)分析從捷克共和國和比利時等國家對ASF 的成功根除和控制計劃中學(xué)到的經(jīng)驗，并將其用于今后控制ASF 疫情暴發(fā)的方案。

3 免疫預(yù)防

3.1 非洲豬瘟疫苗

到目前為止，仍然缺乏安全有效的抗ASF疫苗，同時缺乏對ASFV 足夠敏感且不會在ASFV 基因組內(nèi)進(jìn)一步進(jìn)行遺傳適應(yīng)的永久性細(xì)胞系，這嚴(yán)重阻礙了大多數(shù)候選疫苗的生產(chǎn)。疫苗的開發(fā)似乎仍然是可行的，因為暴發(fā)急性ASF 后康復(fù)的豬對密切相關(guān)的ASFV 毒株的挑戰(zhàn)性感染具有免疫力。影響疫苗開發(fā)的原因部分是由于感染豬產(chǎn)生的抗體不能真正使病毒失去活力(未能完全中和)。此外，許多對建立良好免疫應(yīng)答很重要的成分在定位和功能上尚未完全被確定，因此，根據(jù)個別成分或通過載體表達(dá)的抗原生產(chǎn)疫苗具有挑戰(zhàn)性。滅活的病毒制劑沒有產(chǎn)生實質(zhì)性的保護(hù)作用，不過接種的豬產(chǎn)生了針對ASFV 的抗體。最后，還應(yīng)指出的是，ASFV 能夠建立復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)和有效的免疫逃避機(jī)制，也就是說，它會產(chǎn)生許多能夠影響宿主免疫系統(tǒng)的物質(zhì)，從而使病毒有效地復(fù)制。

隨著ASFV 大范圍傳播，相關(guān)研究機(jī)構(gòu)加強(qiáng)了疫苗的研究與開發(fā)，并取得了一些非常有希望的結(jié)果。ASFV 疫苗可能比其表面上的研究進(jìn)展更接近成品。

鑒于最近幾篇綜述總結(jié)了設(shè)計安全高效的ASF 疫苗的方法，以下將重點介紹ASF 疫苗開發(fā)的總體情況、最近發(fā)表的論文和進(jìn)展，以及一些被忽視的問題。

3.2 減毒活疫苗

減毒活疫苗可以以毒力自然減弱的ASFV毒株或通過敲除毒力因子導(dǎo)致毒力削弱的毒株為疫苗株。有些疫苗制作工藝是對自然產(chǎn)生的毒株進(jìn)行合理的改進(jìn)。

第一批疫苗生產(chǎn)工藝在20 世紀(jì)60 年代就已獲得了許可。這些早期活疫苗是基于減毒的ASFV 毒株，并于20 世紀(jì)60 年代在葡萄牙和西班牙的野外條件下使用了數(shù)千次。不幸的是，許多免疫豬在接種疫苗幾個月后出現(xiàn)了機(jī)體功能衰弱和慢性病變，并導(dǎo)致兩個國家的發(fā)病豬增加。最后，疫苗回收，停止了現(xiàn)場使用。這一經(jīng)驗解釋了為什么今天需要對ASFV 疫苗候選株的安全性進(jìn)行非常仔細(xì)的檢查。ASFV 疫苗設(shè)計不應(yīng)倉促解決。

從20 世紀(jì)70 年代到90 年代，俄羅斯進(jìn)行了通過合理選擇減毒株開發(fā)緊急疫苗(接種屠宰場和安全處理廠的待宰豬) 的研究。根據(jù)紅細(xì)胞吸附抑制(haemadsorption inhibition)和免疫生物學(xué)試驗確定的特性和血清免疫類型，對ASFV 的幾種毒株進(jìn)行了測試和分類?？傊蠖鄶?shù)候選毒株仍會誘發(fā)接種豬出現(xiàn)相當(dāng)長的病毒血癥和輕微的發(fā)熱反應(yīng)。即使在較長的時間之后，疫苗也會產(chǎn)生較高的保護(hù)作用，但免疫作用并不完全，特別是當(dāng)接種豬的免疫力較低時。

另外，ASFV 自然發(fā)生的減毒毒株的變異株也被作為候選疫苗株進(jìn)行了測試。最近，Zani 和Gallardo 等在波羅的海分離到了這種毒株。在Gallardo 等報告初步試驗結(jié)果后，Barasona 等測試了野豬口服接種ASFV Lv17/WB/Rie1 株(在西班牙獲得專利，專利號為PCT/2018/000069) 后的安全性和免疫效果。該毒株為截短的CD2v 蛋白(EP402R基因)，不具有紅細(xì)胞吸附(non-haemadsorbing)性。在對野豬進(jìn)行免疫-攻毒試驗的測試環(huán)境中，可以觀察到，大多數(shù)接種疫苗的野豬和一頭早期感染ASFV 疫苗株的對照組野豬的體溫略有升高，這是唯一觀察到的臨床癥狀。用qPCR方法檢測，發(fā)現(xiàn)部分野豬體內(nèi)含的ASFV 載量很低。在疫苗接種期，大多數(shù)接種疫苗的野豬和所有早期接觸的對照組野豬都產(chǎn)生了抗ASFV 的抗體，證明ASFV 疫苗株具有免疫原性和傳播性。用野毒株攻毒后，在12 頭接種疫苗的野豬中，11 頭豬對致命的攻毒產(chǎn)生了免疫保護(hù)(92%)，發(fā)生急性ASF 的野豬是免疫后沒有產(chǎn)生抗體或接種疫苗后體溫升高的豬。總之，該結(jié)果令人感到前景光明，但仍然缺乏關(guān)于疫苗的保護(hù)作用、安全性和無害性的更精確數(shù)據(jù)。Gallardo 等在早期對同一毒株進(jìn)行的研究中發(fā)現(xiàn)，至少有一頭豬發(fā)生了關(guān)節(jié)腫脹和病變，這表明可能發(fā)生了慢性病。此外，疫苗毒株的傳播可能會對受影響地區(qū)的人群和所在國家產(chǎn)生有利或不利的影響。這種毒株的優(yōu)勢在于它的非轉(zhuǎn)基因特性。

最有希望成為ASFV 疫苗株的候選者是通過同源重組產(chǎn)生的基因缺失突變體。Bosch-Camós 等利用這種方法，已經(jīng)對ASFV 的幾種毒株合理地敲除了毒力基因和干擾素抑制因子(interferon inhibitors)。敲除的毒力相關(guān)基因包括9GL(B119L)、UK(DP96R)、CD2v(EP402R)、DP148R，以及多基因家族(multigene families，MGF) 的不同成員。沿著這些思路，敲除不同的I 型干擾素抑制因子會產(chǎn)生毒力減弱的ASFV 毒株，且對攻毒產(chǎn)生保護(hù)作用。從ASFV BA71 毒株(基因I 型)中敲除CD2v基因的情況也是如此。然而，在ASFV 基因Ⅷ型毒株上，同樣的敲除并沒有產(chǎn)生同等程度的毒力減弱。另一個常見的靶基因是B119L(9GL)。幾種主要的毒株顯示出毒力衰減和保護(hù)作用，但ASFV 基因Ⅱ型格魯吉亞(Georgia) 分離株存在問題。對于ASFV 格魯吉亞分離株，通過額外敲除DP96R(UK) 基因?qū)崿F(xiàn)了毒力完全減毒。然而，一個重要的教訓(xùn)是，ASFV 的遺傳背景會影響基因缺失突變體的表型。

Reis 等再次證明，合理的基因缺失并不總會產(chǎn)生想要的效果。為了提高ASFV OURT88/3 株的安全性，相關(guān)研究人員敲除了I329L基因——一個以前被證明可以抑制宿主先天性免疫反應(yīng)的基因，并在體外對ASFV OURT88/3ΔI329L 株進(jìn)行了測試，以評估I 型干擾素(interferon，IFN) 的復(fù)制和表達(dá)情況，同時還進(jìn)行了豬體內(nèi)免疫和攻毒試驗。雖然ASFV OURT88/3ΔI329L 株保持著原有的復(fù)制特性，但I(xiàn)FN-β 和IFN-α 的表達(dá)量增加。出乎意料的是，對用ASFV 強(qiáng)毒株URT88/1 株攻毒后產(chǎn)生的保護(hù)作用急劇下降。有趣的是，僅僅敲除I329L基因無法減弱ASFV 格魯吉亞/2007 株的毒力。

最近，Chen 等提出了一種缺失7 個基因的ASFV 減毒活疫苗候選株。該候選株被命名為ASFV HLJ/18-7GD 株，基于中國ASFV 強(qiáng)毒株HLJ/18 株，敲除了編碼MGF505-1R 蛋白、MGF505-2R 蛋白、MGF505-3R 蛋白、MGF360-12L 蛋白、MGF360-13L 蛋白、MGF360-14L 蛋白和CD2v(EP402R) 蛋白的基因。據(jù)報道，這種疫苗候選株的毒力在豬體內(nèi)完全減弱，并能對毒力強(qiáng)的ASFV HLJ/18 株的攻毒(肌內(nèi)注射和口服)提供劑量依賴性免疫保護(hù)作用。更詳細(xì)地說，所有用低劑量(103TCID50) ASFV HLJ/18-7GD 株免疫的豬(n=4)，在攻毒后出現(xiàn)3～9 d 的發(fā)熱癥狀；而高劑量(n=4，105TCID50) 組只有1 頭豬發(fā)燒1 d，所有豬均在21 d 的觀察期中存活下來。給6 頭豬肌內(nèi)注射107TCID50，連續(xù)傳代后，沒有產(chǎn)生陽性樣本，盲傳代也沒有出現(xiàn)傳播。接種107.7TCID50，并依次撲殺后，僅在一些豬的淋巴結(jié)中檢測到ASFV 的DNA。此外，候選疫苗株對妊娠母豬安全。免疫力的持續(xù)時間呈高度劑量依賴性。雖然高劑量能夠提供長期的保護(hù)，但在最后一次接種80 d 后，中等劑量的雙倍疫苗接種已經(jīng)不能提供完全的保護(hù)。缺乏長期保護(hù)的觀察結(jié)果與Sánchez-Cordón 等獲得的研究結(jié)果相一致。在后一項研究中，Sánchez-Cordón 等用ASFV OURT88/3 株或BeninΔMFG株給豬進(jìn)行單次肌內(nèi)注射免疫后，沒有觀察到長期保護(hù)作用。免疫接種后130 d 進(jìn)行攻毒，所有豬發(fā)生急性ASF。免疫保護(hù)的持續(xù)時間仍然是ASF 疫苗的一個弱點。因此，這方面需要開展深入研究和闡明。

最近，Borca 等推出了另一株候選疫苗株，即ASFV-G-ΔI177L株。這個基于ASFV格魯吉亞株的候選疫苗株只有I177L基因通過同源重組技術(shù)被敲除。在培養(yǎng)中，該ASFV 變異株表現(xiàn)出生長速度放慢(動力學(xué)和產(chǎn)量)。ORF I177L 編碼一個由177 個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的功能未知。用純化的該基因缺失突變體以102～106TCID50劑量免疫一次豬，達(dá)50%血紅素吸附量(haemadsorbing doses 50%，HAD50)，在28 d 的觀察期里，接種豬臨床健康，雖然在整個觀察期檢測到了低至中等水平的病毒DNA 載量，但沒有向哨兵豬排毒，并且在試驗結(jié)束時檢測到高水平的抗體。在免疫后28 d 的肌內(nèi)注射攻毒中，所有接種豬在臨床上都保持健康。用定制的PCR 方法檢測到了疫苗株，但未檢測到攻毒的毒株。只有低劑量組的一頭豬被檢測到低水平的攻毒毒株。正如Carlson 等所述，通過間接全病毒ELISA 方法檢測到的ASFV 抗體水平與上述保護(hù)作用相關(guān)。

3.3 載體疫苗、DNA 疫苗和亞單位疫苗

與減毒活疫苗相比，載體疫苗和亞單位疫苗具有更高的安全性，并可以區(qū)分野毒感染動物和疫苗接種動物。此外，疫苗生產(chǎn)通常不會依賴原代細(xì)胞。然而，由于缺乏有關(guān)保護(hù)性抗原及其潛在相互作用的知識，疫苗株的開發(fā)受到了嚴(yán)重的影響。此外，亞單位疫苗不能用于野豬的口服接種(這需要采用活疫苗的方法)。

根據(jù)康復(fù)豬的血清學(xué)反應(yīng)，結(jié)構(gòu)蛋白p30(由CP204L基因編碼)、p54(E183L基因)、p72(B646L基因)、pp62(CP530R基因) 和CD2v(EP402R基因)已成為合理設(shè)計疫苗株的主要靶蛋白，并在攻毒研究中對蛋白質(zhì)、DNA和病毒載體的ASFV 疫苗株進(jìn)行了測試。此外，不同的疫苗設(shè)計也使用了生物信息學(xué)預(yù)測的抗原。不幸的是，使用類似抗原的結(jié)果并不總是結(jié)論性的。這種不一致性可歸因于多種因素，包括疫苗的類型、接種策略、抗原和誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，以及攻毒模型，包括動物遺傳學(xué)、病毒毒株、疫苗接種和野毒攻毒的劑量等因素。大多數(shù)方法都沒有產(chǎn)生保護(hù)作用或部分保護(hù)作用。

例如，桿狀病毒表達(dá)p30 蛋白、p54 蛋白、p72 蛋白和p22 蛋白誘導(dǎo)動物機(jī)體產(chǎn)生具有中和能力的抗體，但對6 頭免疫豬在第4 次加強(qiáng)接種后用ASFV Pretoriuskop/96/4 株(ASFV Pr4 株)(攻毒劑量為104TCID50，肌內(nèi)注射)進(jìn)行同源攻毒后并沒有起到有效的預(yù)防作用。攻毒豬發(fā)病和出現(xiàn)病毒血癥的時間稍稍延后。相比之下，重組桿狀病毒在昆蟲的體細(xì)胞和粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)幼蟲中表達(dá)的p30蛋白和p54 蛋白形成的融合蛋白確實誘發(fā)了部分保護(hù)作用，并減弱了2 頭豬的病毒血癥的嚴(yán)重程度，這2 頭豬接種了5 次疫苗，肌內(nèi)注射了500 TCID50的ASFV E75 株。豬接種重組的CD2v 蛋白后出現(xiàn)了抗體反應(yīng)，并產(chǎn)生了劑量依賴性保護(hù)作用，在用400 TCID50的ASFV E75 株攻毒后，3 頭豬產(chǎn)生了保護(hù)作用。高免疫劑量可以防止豬出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床癥狀和可檢測水平的病毒血癥。

用p54 蛋白、p30 蛋白和CD2v 蛋白胞外結(jié)構(gòu)域融合的DNA 疫苗不會產(chǎn)生保護(hù)作用，除非與泛素融合。這種構(gòu)建體可保護(hù)一部分免疫過3 次的豬(12 頭豬中有3 頭) 免受ASFV E75(104HAU50)株的致命攻擊。沿著這些思路，對表達(dá)文庫(expression library)采取了類似的方法，60%的豬(n=5)2 次免疫接種后在受到104HAU50ASFV E75 株的攻擊時得到了部分或幾乎完全的保護(hù)。盡管有上述結(jié)果，但在使用CD2v 蛋白、p30 蛋白和p54 蛋白進(jìn)行蛋白融合的DNA-初免(DNA-prime) 時并沒有產(chǎn)生保護(hù)作用。在此項研究中，用包括ASFV質(zhì)粒DNA(CD2v、p72、p32、±p17) 和重組蛋白(p15、p35、p54、±p17)的混合物對豬(n=5)進(jìn)行了3 次免疫接種。接種疫苗的豬仍然感染ASFV Arm07 株或發(fā)病。與未接種疫苗的對照組豬相比，接種疫苗的豬在受到ASFV 強(qiáng)毒株的攻擊后，出現(xiàn)臨床癥狀、病毒血癥和死亡的時間更早。ASFV 引發(fā)的病理變化在接種疫苗的豬上也更重。

使用γ 干擾素酶聯(lián)免疫斑點試驗(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT) 對被ASFV 免疫豬淋巴細(xì)胞識別的病毒蛋白進(jìn)行合理篩選，得到了由ASFV 基因A151R、B646L(p72)、C129R、CP204L(p30)、CP530R(pp62)、E146L、I73R、I125L、L8L、M448R、MGF110-4L和MGF110-5L組成的基因庫。這些抗原在復(fù)制缺陷型人5 型腺病毒(replication-deficient human adenovirus，rAd5)初始免疫和改良的痘苗病毒安卡拉株(modified vaccinia Ankara，MVA)增強(qiáng)免疫的引導(dǎo)下，在挑戰(zhàn)ASFV 強(qiáng)毒株OUR T88/1 分離株后，導(dǎo)致一部分豬的臨床癥狀減輕，病毒血癥嚴(yán)重程度下降。

例如，含有基因B646L(p72)、CP204L(p30)、CP530R(pp62)、E183L(p54)與成熟的p37 產(chǎn)物和pp220 多聚蛋白的兩段成熟p150 蛋白(CP2475L基因) 相組合的腺病毒載體疫苗，被證明可以誘導(dǎo)豬產(chǎn)生抗體和T細(xì)胞反應(yīng)，包括細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞。然而，攻毒感染顯示，相對于對照組，一些疫苗(使用9 種抗原混合物的佐劑疫苗)有更嚴(yán)重的反應(yīng)，并且沒有產(chǎn)生明顯的保護(hù)作用。

最近，對35 種合理設(shè)計的腺病毒載體介導(dǎo)的ASFV 抗原在野豬體內(nèi)的免疫原性和有效性進(jìn)行了評估(n=9，按不同的時間表處理)。該混合物包含表達(dá)上述抗原的腺病毒和其他抗原，如EP153R、p10、p15、CP80R、I329L、H108R、K196R、CP312R、F334L、NP419L、NP868R、B66L、H339R 和R298L，早先的研究證明這些抗原在家豬體內(nèi)具有免疫原性。其余的抗原(K145R、B385R、F165R、F778R、S273R、MGF100-1 L、A224L、MGF505-6R 和B175L) 是根據(jù)假定的T 細(xì)胞表位選擇的。挑戰(zhàn)是按照“排毒者-豬攻毒-暴露感染”模型進(jìn)行的，在兩個排毒者中肌內(nèi)接種進(jìn)行10 HAU50。綜上所述，在用ASFV Arm07 攻毒時沒有觀察到保護(hù)作用。所有的免疫豬都出現(xiàn)了ASF 的臨床癥狀和病理變化。

Goatley 等最近證明，當(dāng)由復(fù)制缺陷型人5 型腺病毒(初次免疫)和改良的痘苗病毒安卡拉株(加強(qiáng)免疫) 引導(dǎo)時，由8 種ASFV抗原組成的抗原庫可以在ASFV 基因I 型分離株攻毒后保護(hù)豬免受致命疾病的影響。該實驗是早先研究的后續(xù)研究，該研究證明不同的抗原具有免疫原性，但在采用DNA 疫苗初次免疫(DNA prime)/ 牛痘疫苗加強(qiáng)免疫(vaccinia boost) 的免疫策略——“primeboost”免疫方案——時沒有保護(hù)作用。保護(hù)性抗原混合物含有B602L基因、B646L(p72)基因、CP204L(p30)基因、E183L(p54)基因、E199L(富半胱氨酸蛋白) 基因、EP153R(凝集素樣蛋白) 基因、F317L基因和MGF505-5R基因的產(chǎn)物。該制劑根本不是有效的疫苗，因為所有接種豬在臨床上都出現(xiàn)了癥狀，并顯示出相當(dāng)嚴(yán)重的病毒血癥，但這種方法在抗原選擇和證明DIVA 兼容的亞單位疫苗可提供保護(hù)方面具有應(yīng)用前景。遺憾的是，以上研究同樣不能推斷出保護(hù)作用的明確相關(guān)因素。

綜上所述，針對ASF 的病毒載體疫苗是一種可行的方法，然而，抗原的選擇是成功的關(guān)鍵，目前仍缺少有說服力的候選疫苗株。

3.4 疫苗的商業(yè)化及其實施

目前，頭條新聞和推特相繼報道了潛在的疫苗候選株，它們都是作為成功的案例被推出的，并暗示疫苗在短期內(nèi)是有效的。然而，由于缺乏有效數(shù)據(jù)，存在安全性問題，以及消費者擔(dān)憂，并非所有(或者說，幾乎沒有) 候選疫苗都適合作為一種高度有效的短期工具來控制法定動物傳染病，而且對于迄今為止提出的所有改良的候選疫苗株，由于缺乏能夠確保病毒在標(biāo)準(zhǔn)化條件下復(fù)制和生產(chǎn)的永久性細(xì)胞系，疫苗的生產(chǎn)將受到嚴(yán)重影響。所有報道的新的和有希望的候選疫苗株都依賴于原代細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)，這導(dǎo)致疫苗的生產(chǎn)既不安全也不可行。

此外，野豬需要一種基于誘餌的活疫苗。如果這種疫苗株用于野外接種，則需要大量安全性方面的數(shù)據(jù)。目前為止這方面的研究非常罕見。

預(yù)防ASF 的疫苗一旦獲得成功開發(fā)，它們也只能是控制ASF 的一個工具。免疫接種需被納入ASF 控制和預(yù)防策略中。在不太理想的條件下，利用疫苗根除疾病的效果很有限，一個例子是經(jīng)典豬瘟：雖然豬接種豬瘟兔化弱毒活疫苗后能夠產(chǎn)生很高的抗體水平，且非常安全，該疫苗可能是預(yù)防動物疾病的最佳疫苗之一，但迄今為止，亞洲一些國家仍然無法根除豬瘟。疫苗不能代替生物安全、行為改變、良好的管理、診斷方法和有針對性的撲殺措施。

3.5 差距和進(jìn)一步研究的方向

◆需要進(jìn)行ASFV 病毒學(xué)和功能基因組學(xué)研究，用重要的額外數(shù)據(jù)集(如蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能)來支撐疫苗的研究開發(fā)。

◆需要采用統(tǒng)一的攻毒模型，以利用免疫或攻毒試驗比較候選疫苗株。

◆必須制定與實驗性減毒活疫苗有關(guān)的安全特征和最低標(biāo)準(zhǔn)，并在這方面達(dá)成共識?？赡苄枰粋€藥典章節(jié)。

◆應(yīng)為疫苗生產(chǎn)開發(fā)能使ASFV 生長或促進(jìn)ASFV 生長但不會導(dǎo)致其基因發(fā)生重大改變的基因。

◆基因缺失的ASFV 變異株是主要的疫苗候選株，應(yīng)進(jìn)行更深入的研究和開發(fā)。

4 展望

未來，非洲豬瘟的防控必須更加注重傳統(tǒng)的控制措施，如早期檢測、嚴(yán)格的衛(wèi)生和生物安全措施、撲殺感染豬群、補償損失、暫停措施、流行病學(xué)追蹤和野豬控制計劃。這是特別必要的，因為短期內(nèi)可能無法開發(fā)出一種可大量生產(chǎn)并可用于野生動物群的合適、安全且有效的疫苗。因此，未來的研究應(yīng)該集中在填補本綜述所列出的空白上。

原題名：African swine fever -A review of current knowledge(英文)

原作者：Sandra Blome、Kati Franzke 和Martin Beer