姜 萍, 曲肼靚, 賈雨欣, 孫智超, 劉思盈, 王 飛

(南京林業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院,江蘇 南京 210037)

紅豆杉屬在全世界約有11種[1]，紅豆杉是提取天然抗癌藥物紫杉醇的主要樹種[2-4],其主要含有活性多糖、黃酮類、紫杉烷二萜類、生物堿、植物多酚等活性物質(zhì)[5-7]。由于抗癌藥物紫杉醇在紅豆杉中含量較低,因此在提取制備紫杉醇時,還可提取分離出原花色素等活性成分,從而提高紅豆杉資源的利用率。目前,提取原花色素一般采用傳統(tǒng)提取方法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、超臨界CO2萃取等提取方法[8-11]。近些年大量研究表明,原花色素具有抗炎、抗癌、抗氧化、抑制糖尿病、抗心血管疾病、降血脂等生物活性。因此,原花色素可以廣泛應(yīng)用于保健品、醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域。目前,對紅豆杉的研究主要集中在紫杉醇等紫杉烷二萜類化合物、黃酮類化合物、多糖類以及生物堿類化合物等[12],而對紅豆杉中原花色素的提取工藝、分離方法及其抑制糖尿病活性的報道較少。中國的紅豆杉資源約占世界50%以上,對于紅豆杉中多種有效成分及其生物活性的研究具有重要的應(yīng)用價值。本研究采用酶與超聲波輔助耦合提取法提取東北紅豆杉枝葉中原花色素,采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝,并探討了紅豆杉枝葉中不同溶劑萃取物及乙酸乙酯萃取物大孔吸附樹脂分離組分對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性,以期為紅豆杉中原花色素的開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支持,同時為開發(fā)出具有潛力的糖尿病抑制劑提供理論依據(jù)。

1 實 驗

1.1 原料、試劑與儀器

東北紅豆杉(TaxuscuspidataSieb. et Zucc)枝葉粉末,含水率8.39%,粒徑0.425 mm,由山東威海榮成健康集團(tuán)有限公司提供,采集于2021年6月。果膠酶,北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶,Sigma公司；4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷,上海麥克林生化科技有限公司；阿卡波糖,拜耳醫(yī)藥保健有限公司；大孔吸附樹脂,蚌埠遼源新材料有限公司；葡聚糖凝膠,臺州市路橋四甲生化塑料廠；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

UV-2450紫外-可見分光光度儀,日本SHIMADZU公司；AC5200DTD型超聲波清洗機(jī),南京安秀儀器設(shè)備有限公司； Cytation 3酶標(biāo)儀,BioTek公司；Shimadzu LC-IT-TOF-MS液質(zhì)聯(lián)用儀,Shimadzu公司；SepaBeanTMmachine T中壓制備色譜,南京斑馬實驗器材。

1.2 紅豆杉枝葉原花色素的提取

1.2.1原料中原花色素總含量的測定 稱取紅豆杉枝葉粉末原料5.00 g置于索氏抽提器中,用50%乙醇為溶劑提取10 h,測定原料中原花色素總含量,做2次平行實驗。

1.2.2酶與超聲波輔助耦合提取單因素試驗 稱取紅豆杉枝葉粉末原料3.00 g,置于100 mL錐形瓶中,加入不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶劑,再加入果膠酶。在不同的酶質(zhì)量濃度、液料比、酶解溫度、酶解時間、酶超聲波功率的條件下,進(jìn)行酶與超聲波輔助耦合提取(提取1次),離心分離,過濾、定容至100 mL,采用香草醛-硫酸法測定提取物中原花色素的含量,并計算原花色素的得率。

1.2.3響應(yīng)面法優(yōu)化試驗 采用響應(yīng)面法對紅豆杉枝葉中原花色素的酶與超聲波輔助耦合提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)單因素試驗結(jié)果,采用Design-Expert 10.0.7.0軟件,依據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理,設(shè)計4因素3水平響應(yīng)面分析試驗[13]。

1.3 原花色素含量的測定及得率計算

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用香草醛-硫酸法[14],以兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品,得到線性關(guān)系良好的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。配制質(zhì)量濃度為0.1、 0.2、 0.3、 0.4和0.5 g/L的兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品甲醇溶液,各取0.5 mL放入棕色試劑瓶中,加入3%香草醛甲醇溶液2.5 mL,再加入2.5 mL 30%硫酸溶液,混合均勻。室溫條件下顯色15 min,采用紫外分光光度計測定其500 nm處的吸光度。以吸光度(Y)為縱坐標(biāo),原花色素質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到原花色素標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=4.020 8X-0.009 1,R2=0.999 9。

1.3.2原花色素得率計算 按式(1)計算原花色素得率：

(1)

式中：Y—原花色素的得率,%；c—提取液中原花色素質(zhì)量濃度,mg/L；V—提取液體積,mL；n—提取液的稀釋倍數(shù)；m—原料的氣干質(zhì)量,g；w—氣干原料含水率,%。

1.4 紅豆杉枝葉提取物的萃取與分離

1.4.1不同溶劑的萃取 稱取紅豆杉枝葉原料200 g,用60%乙醇溶液在優(yōu)化條件下通過酶與超聲波輔助提取,浸提3次,合并提取液,過濾,減壓濃縮,得濃縮液。依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取,得到5種不同溶劑的萃取物。將得到的5種萃取物進(jìn)行抑制糖尿病活性實驗，選擇抑制糖尿病活性較好的乙酸乙酯萃取物進(jìn)一步分離純化。

1.4.2大孔吸附樹脂分離 取3 g乙酸乙酯萃取物經(jīng)大孔吸附樹脂flash快速中壓制備色譜進(jìn)行分離,選擇水/乙醇反相溶劑系統(tǒng),依次用水,10%、 20%、 30%、 40%、 50%和95%乙醇梯度洗脫,流速為20 mL/min,254和280 nm紫外檢測,收集流出液,減壓濃縮,冷凍干燥,得到CBFr.1～CBFr.7這7個分離組分,測定原花色素含量,選擇原花色素含量較高的CBFr.4進(jìn)行進(jìn)一步分離純化。

1.4.3葡聚糖凝膠分離 取200 mg CBFr.4分離組分經(jīng)過Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱層析分離,采用甲醇/水溶劑系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫,薄層色譜(TLC)跟蹤檢測,采用V(乙酸乙酯) ∶V(正丁醇) ∶V(乙酸) ∶V(水)=5 ∶4 ∶2 ∶1為展開劑,碘蒸氣熏顯色法,合并得到LFr.4分離組分。

1.4.4硅膠柱層析分離 取76.8 mg LFr.4分離組分經(jīng)硅膠柱層析分離,二氯甲烷/甲醇溶劑系統(tǒng)洗脫,TLC跟蹤檢測,展開劑為氯仿/甲醇(體積比1 ∶1),碘蒸氣熏顯色法,合并得到一種原花色素化合物SP,對其進(jìn)行MS分析。

1.5 分離產(chǎn)物SP的MS分析

采用Shimadzu LC-IT-TOF-MS儀進(jìn)行MS分析。樣品以0.35 mL/min的流速洗脫到ESI離子源中,加熱塊、彎曲去溶劑化線(CDL)保持在200 ℃。使用氮氣作為霧化器和干燥氣體,流速設(shè)定為1.5 mL/min。ESI源電壓設(shè)定為4.5 kV,檢測器設(shè)定為1.61 kV。m/z從100到1 000的負(fù)值和正值模式都采集數(shù)據(jù)。

1.6 糖尿病抑制活性實驗

1.6.1α-淀粉酶抑制活性 在含有5 μL 10 g/L淀粉溶液的96孔板中，加入35 μL不同質(zhì)量濃度樣品溶液。混合物在37 ℃下反應(yīng)5 min,向每個孔中加入10 μL 2Uα-淀粉酶溶液,并在37 ℃下孵育10 min,然后加入150 μL/孔魯哥比染色液。使用酶標(biāo)儀測量595 nm處的吸光度值,平行實驗3次，以阿卡波糖作為陽性對照。根據(jù)式(2)計算樣品的抑制率(η),根據(jù)不同質(zhì)量濃度樣品抑制率的變化得到半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(IC50)值[15]。

η=(A2-A1)/(A3-A1)×100%

(2)

式中：A1—不受抑制的酶的吸光度值(空白對照)；A2—樣品和酶混合的吸光度值；A3—不加酶的吸光度值。

1.6.2α-葡萄糖苷酶抑制活性 按照Boue等[16]建立的方法測定α-葡萄糖苷酶抑制活性。在96孔板中加入不同質(zhì)量濃度樣品溶液10 μL,同時加入120 μL磷酸緩沖液和20 μL 2U葡萄糖苷酶溶液,混勻,37 ℃孵育10 min,再加入20 μL 2.5 mol/L 4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)溶液,混勻,37 ℃孵育15 min；立刻加入80 μL 0.2 mol/L Na2CO3,混勻,在405 nm處測定吸光度,以阿卡波糖作為陽性對照。根據(jù)式(3)計算樣品的抑制率(η′),得出IC50值。

η′=(A′2-(A′1-A0))/A′2×100%

(3)

式中：A0—不同質(zhì)量濃度樣品溶液的吸光度值；A′1—樣品對α-葡萄糖苷酶作用后的吸光度值；A′2—無抑制劑的溶液反應(yīng)后的吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同條件對原花色素提取得率的影響

2.1.1乙醇體積分?jǐn)?shù) 在果膠酶質(zhì)量濃度0.1 g/L、超聲波功率144 W、酶解時間60 min、液料比14 ∶1(mL ∶g，下同)和酶解溫度50 ℃的條件下提取1次,探討乙醇體積分?jǐn)?shù)與原花色素得率的關(guān)系,結(jié)果見圖1(a)。由圖可知,隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加原花色素得率增大,乙醇體積分?jǐn)?shù)60%時達(dá)最大值2.44%,提取率53.04%(原料含原花色素4.60%)；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于60%時,原花色素得率下降。這是由于當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增加,溶劑的滲透性增強(qiáng),加劇了原花色素溶出；但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到一定程度,脂溶性物質(zhì)比例增大,降低了原花色素得率。因此,適宜的乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。

a.乙醇體積分?jǐn)?shù)ethanol volume fraction; b.酶質(zhì)量濃度enzyme concentration; c.酶解溫度enzymolysis temperature; d.酶解時間enzymolysis time; e.超聲波功率ultrasonic power; f.液料比liquid-solid ratio圖1 不同條件對原花色素提取得率的影響Fig.1 Effect of different conditions on proanthocyanidins extraction yield

2.1.2酶質(zhì)量濃度 選擇提取溶劑為60%乙醇、超聲波功率120 W,其他提取條件同2.1.1節(jié),探討酶質(zhì)量濃度與原花色素得率的關(guān)系,結(jié)果見圖1(b)。由圖可見隨著酶質(zhì)量濃度增大,原花色素得率逐漸增大,在酶質(zhì)量濃度0.15 g/L時達(dá)到最大,得率為2.60%。繼續(xù)升高酶質(zhì)量濃度,得率反而下降。適量的果膠酶可以破壞植物細(xì)胞壁,使原花色素更容易溶出,當(dāng)酶質(zhì)量濃度大于0.15 g/L時,酶的活性部位無法與更多的底物相結(jié)合,從而使原花色素得率有所下降。因此,較好的酶質(zhì)量濃度為0.15 g/L。

2.1.3酶解溫度 選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、酶質(zhì)量濃度0.15 g/L、超聲波功率120 W,其他條件同2.1.1節(jié),探究酶解溫度與原花色素得率的關(guān)系,結(jié)果見圖1(c)。由圖1(c)可知,酶解溫度在40 ℃以下時,原花色素得率隨著溫度升高而升高；在40 ℃時得率達(dá)到最大值為3.57%；超過40 ℃時,原花色素得率反而下降。原因是當(dāng)溫度過高時,某些原花色素不穩(wěn)定,其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。因此,較好的酶解溫度為40 ℃。

2.1.4酶解時間 選擇乙醇體積分?jǐn)?shù) 60%、超聲波功率120 W、酶質(zhì)量濃度 0.15 g/L、酶解溫度40 ℃,其他提取條件同2.1.1節(jié),探討酶解時間與原花色素得率的關(guān)系,結(jié)果見圖1(d)。由圖1(d)可知,在50 min以內(nèi)時,原花色素得率隨酶解時間的延長而增加,得率在50 min 時達(dá)到最大值為3.14%；50 min后原花色素得率開始下降。這是因為原花色素結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,長時間的酶解會使原花色素發(fā)生變化,且酶解時間過長會導(dǎo)致酶活降低。因此,50 min是較好的酶解時間。

2.1.5超聲波功率 選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)60%,其他條件同2.1.1節(jié),探究超聲波功率與原花色素得率的關(guān)系,結(jié)果見圖1(e)。由圖1(e)可知,在超聲波功率較低時,原花色素得率隨著功率提高而增大；得率在超聲波功率為120 W時達(dá)到最大值3.09%。超聲波功率繼續(xù)增大,原花色素得率反而下降。由于超聲波機(jī)械效應(yīng)會造成植物細(xì)胞壁的破壞,使得活性物質(zhì)更容易被提取出來；超聲波功率進(jìn)一步加大時,會使得原花色素發(fā)生降解而破壞,且其他成分更易析出。因此,120 W為較好的超聲波功率。

2.1.6液料比 選擇提取溶劑為60%乙醇,其他條件同2.1.1節(jié),探討液料比對原花色素得率的影響,結(jié)果見圖1(f)。由圖1(f)可知,液料比小于14 ∶1時,原花色素得率會隨液料比的增大而增大；大于14 ∶1時,原花色素得率會隨液料比的增大而減??；在14 ∶1時得率最大值為2.79%。這可能是由于溶劑量的加大使物料與溶劑的接觸面積增大,原料中的原花色素更易被浸提出來；當(dāng)液料比增加到一定值時,溶劑和原料已充分接觸,如果繼續(xù)加大溶劑量,反而會使雜質(zhì)更多地被提取出來,導(dǎo)致原花色素得率下降,并且加大溶劑量,也使提取和回收成本增大[17]。因此,適宜的液料比為14 ∶1。

2.2 酶與超聲波輔助耦合提取的響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果 結(jié)合單因素試驗結(jié)果選取酶解溫度(X1)、酶解時間(X2)和酶質(zhì)量濃度(X3)為自變量,以原花色素得率為響應(yīng)值(Y),根據(jù)Box-Behnken模型,運用Design-Expert 10.0.7.0軟件進(jìn)行設(shè)計,通過響應(yīng)面法對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[17],試驗方案及結(jié)果見表1。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 1 Experimental design and results of response surface analysis

表2 回歸模型方差分析Table 2 Variance analysis of the regression model

2.3 產(chǎn)物SP的MALDI-TOF-MS分析

由SP樣品的MALDI-TOF-MS二級分析圖譜可知,原花色素分子質(zhì)子峰(m/z)[M-H]-為577.13,主要碎片峰有287.05、 289.07、 407.07、 425.08。其中425.08主要是原花色素I的醚鍵斷裂得到的碎片峰II；407.07為II失去1分子水形成的碎片峰III；289.07為原花色素I失去了刺槐亭醇醌式氧化物V形成的碎片峰兒茶素IV,具體裂解途徑見圖2。

圖2 樣品SP的TOF-MS裂解途徑Fig.2 TOF-MS fragmentation pathway of sample SP

由此可以看出,SP樣品的分子式為C30H26O12,相對分子質(zhì)量為578。因此,該原花色素化合物為兒茶素與刺槐亭醇縮合的二聚體。

2.4 對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性

2.4.1不同溶劑萃取物 由表3可知,紅豆杉粗提物不同溶劑萃取物在1 g/L質(zhì)量濃度下,乙酸乙酯萃取物對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶有較好的抑制活性,抑制率達(dá)到83.60%和63.03%(阿卡波糖抑制活性分別為90.90%和85.73%)；其次正丁醇萃取物對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶也有一定的抑制活性,抑制率分別為63.03%和53.97%；二氯甲烷、石油醚、水萃取物則抑制活性不高。這是由于紅豆杉枝葉粗提物不同萃取組分中，乙酸乙酯和正丁醇萃取物中原花色素的含量較多,且乙酸乙酯萃取物中原花色素的含量最多,而原花色素具有較強(qiáng)的抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶作用[21]。因此,乙酸乙酯萃取物對抑制糖尿病有較好的活性。

表3 不同溶劑萃取物對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率Table 3 Inhibition rate of α-amylase and α-glucosidase by different solvent extracts

2.4.2乙酸乙酯層大孔吸附樹脂分離組分 如圖3(a)所示,大孔吸附樹脂分離得到的7個組分中,CBFr.1對α-淀粉酶抑制活性較高,其IC50值為0.036 g/L,略高于阿卡波糖IC50值0.021 g/L。其次為CBFr.2,其IC50值為0.039 g/L；CBFr.3～CBFr.6的α-淀粉酶抑制能力相當(dāng),IC50值分別為0.043、 0.041、 0.042和0.045 g/L,CBFr.7的α-淀粉酶抑制活性較低，IC50值為0.053 g/L?？梢钥闯?乙酸乙酯萃取物大孔吸附樹脂分離組分均具有一定的α-淀粉酶抑制活性。

圖3 乙酸乙酯層大孔吸附樹脂分離組分對α-淀粉酶(a)和α-葡萄糖苷酶(b)的抑制率Fig.3 Inhibition rate of α-amylase(a) and α-glucosidase(b) activity by macroporous adsorption resin fractions separated by ethyl acetate

如圖3(b)所示,大孔吸附樹脂分離得到的7個組分中,CBFr.3對α-葡萄糖苷酶抑制活性最好,IC50值為0.04 g/L,略低于阿卡波糖IC50值0.063 g/L；其次為CBFr.1和CBFr.4,其IC50值分別為0.058 和0.065 g/L,與阿卡波糖相當(dāng)；CBFr.2的IC50值為0.074 g/L,略高于阿卡波糖，抑制活性較好；CBFr.5的IC50值為0.125 g/L，有一定的抑制活性；CBFr.6和CBFr.7對α-葡萄糖苷酶抑制活性最差。結(jié)合上述分析可以看出：CBFr.1～CBFr.4都有較好的α-葡萄糖苷酶抑制活性,以及一定的α-淀粉酶抑制活性,這樣既可以達(dá)到降血糖的效果,又減少了因過量降低α-淀粉酶活性而產(chǎn)生的副作用。故紅豆杉乙酸乙酯萃取物大孔吸附樹脂的0～30%乙醇洗脫物CBFr.1～CBFr.4對糖尿病都有較好的抑制活性，表明紅豆杉枝葉乙酸乙酯萃取物具有作為天然Ⅱ型糖尿病抑制劑的潛力。

3 結(jié) 論

3.1采用單因素試驗和響應(yīng)面法優(yōu)化東北紅豆杉枝葉中原花色素的酶與超聲波輔助耦合提取工藝,得到最佳提取工藝條件為：60%乙醇溶液為溶劑、酶質(zhì)量濃度0.15 g/L、液料比14 ∶1(g ∶mL)、酶解時間50 min、酶解溫度40 ℃和超聲波功率120 W,此條件下提取1次,原花色素提取得率為3.84%,提取率達(dá)到83.48%。

3.2乙酸乙酯萃取物經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂、葡聚糖凝膠、硅膠柱層析分離純化得到一個原花色素化合物SP,通過TOF-MS結(jié)構(gòu)鑒定和紫外全波長掃描,確定該化合物為兒茶素與刺槐亭醇的二聚體原花色素。

3.3乙酸乙酯萃取物經(jīng)大孔吸附樹脂分離得到的7種組分(CBFr.1～CBFr.7)其抗糖尿病活性結(jié)果表明：紅豆杉枝葉乙酸乙酯萃取物對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶都有較好的抑制作用；分離的7個組分中,CBFr.1對α-淀粉酶抑制活性最高,IC50值為0.036 g/L,CBFr.2～CBFr.5也有較好的抑制能力；CBFr.3對α-葡萄糖苷酶抑制活性最好,IC50值為0.04 g/L(低于阿卡波糖的0.063 g/L)，CBFr.1和CBFr.4的抑制活性與阿卡波糖相當(dāng)，CBFr.6和CBFr.7的抑制活性最差。故紅豆杉乙酸乙酯萃取物大孔吸附樹脂的0～30%乙醇洗脫物CBFr.1～CBFr.4可作為Ⅱ型糖尿病抑制劑,為紅豆杉枝葉的綜合利用開辟了一條新的途徑。