盧 婧，李尉興，徐曉君，紀(jì) 偉

（中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所, 北京 100101）

1 引 言

細(xì)胞是所有生物的基本功能單位，而細(xì)胞功能很少由單一種類的分子完成，大多數(shù)細(xì)胞功能起源于細(xì)胞內(nèi)不同種類分子之間的相互作用，很多重要的分子復(fù)合體根植于它們所在的細(xì)胞環(huán)境中，無法在不破壞其結(jié)構(gòu)完整性的同時(shí)將它們剝離出來。因此，在細(xì)胞原位對(duì)生物大分子進(jìn)行觀察和結(jié)構(gòu)解析，研究生命活動(dòng)和疾病入侵的分子機(jī)理，既有助于揭示生命現(xiàn)象本質(zhì)，也關(guān)系到國(guó)家生物安全、醫(yī)藥衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)和綠色產(chǎn)業(yè)發(fā)展等重大戰(zhàn)略需求。

冷凍電子斷層掃描（cryo-ET）是在細(xì)胞原位解析生物大分子結(jié)構(gòu)的核心技術(shù)[1]。在該過程中，細(xì)胞樣品被迅速冷凍固定（通常是液氮溫度-196°），其中的水跳過結(jié)晶態(tài)直接進(jìn)入玻璃態(tài)，因此，細(xì)胞中的細(xì)胞器和大分子復(fù)合體得以維持其原始位置和形態(tài)；樣品制備完成后，送入冷凍透射電鏡，通過將樣品傾斜不同角度，采集一系列的二維圖像，重建出樣品的三維圖像，可以得到0.1納米量級(jí)的分辨率。然而，cryo-ET要應(yīng)用于細(xì)胞原位檢測(cè)，還面臨3個(gè)技術(shù)難點(diǎn)：第一，受限于電子穿透深度，樣品厚度需要小于300nm[2]，大多數(shù)細(xì)胞樣品無法直接成像；第二，電鏡圖像的襯度來源于樣品質(zhì)量密度分布，而細(xì)胞內(nèi)環(huán)境非常嘈雜，很難精確定位所需的生物大分子[3]。第三，很多生物過程在細(xì)胞中呈稀疏分布，無法單純根據(jù)電鏡圖像定位。因此，要在細(xì)胞原位進(jìn)行cryo-ET成像，需要精確定位目標(biāo)區(qū)域，并將樣品減薄到300 nm以下。

聚焦離子束（FIB）減薄是目前最有前景的冷凍樣品減薄方式[4]，F(xiàn)IB通常集成在掃描電鏡（SEM）腔室內(nèi)。聚焦至納米量級(jí)的離子束（常用Ga+離子）接觸樣品表面后，會(huì)濺射出部分樣品，并氣化為二次離子或是中性原子，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的切割減薄。通過將離子槍和樣品設(shè)置成一定角度，并對(duì)細(xì)胞中感興趣區(qū)域上下表面進(jìn)行切割減薄，可以得到透射電鏡所需要的300 nm以下的平整薄片樣品[5-6]，再將制備好的薄片樣品通過冷凍傳輸系統(tǒng)送入冷凍透射電鏡進(jìn)行斷層掃描成像。由于生物樣品中大多數(shù)都是碳、氫、氧等輕原子，為了避免樣品切割范圍外的表面損傷，離子束減薄時(shí)的電流很小，相應(yīng)也會(huì)花費(fèi)更長(zhǎng)的時(shí)間；樣品從掃描電鏡腔室轉(zhuǎn)移到透射電鏡腔室，需要全程處于低溫低濕狀態(tài)，同樣費(fèi)時(shí)良久，且樣品有一定的污染概率。綜上所述，F(xiàn)IB雖然可以將冷凍細(xì)胞樣品減薄到300 nm以下，但為了提高透射電鏡樣品制備成功率，需要精確高效地定位目標(biāo)分子所在區(qū)域。

熒光顯微成像可以通過用染料或熒光分子標(biāo)記細(xì)胞中特定的蛋白或者亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)對(duì)生物大分子和分子復(fù)合物的定位及對(duì)其生物過程的觀測(cè)。將熒光顯微鏡和電鏡結(jié)合起來的方式被稱為冷凍光電關(guān)聯(lián)顯微成像（cryo-CLEM），將熒光顯微鏡對(duì)目標(biāo)分子的定位優(yōu)勢(shì)和電鏡的分辨率優(yōu)勢(shì)相結(jié)合，通過光鏡圖像和電鏡圖像的配準(zhǔn)，在復(fù)雜的細(xì)胞環(huán)境中定位感興趣的細(xì)胞器或分子復(fù)合物，并在原位對(duì)其進(jìn)行觀察和解析。為了保證光電關(guān)聯(lián)圖像精確配準(zhǔn)，細(xì)胞冷凍需要在光鏡成像之前進(jìn)行，因?yàn)樵诶鋬鲞^程中可能出現(xiàn)樣品載網(wǎng)變形，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)變化，而且對(duì)于活細(xì)胞來說，在光鏡成像到原位冷凍期間，內(nèi)部結(jié)構(gòu)功能也會(huì)發(fā)生改變。

2 原位冷凍光電關(guān)聯(lián)成像概述

cryo-CLEM成像流程通常如圖1（彩圖見期刊電子版）所示，首先將生物細(xì)胞培養(yǎng)在電鏡載網(wǎng)上（圖1（a）），并對(duì)細(xì)胞中感興趣的結(jié)構(gòu)或過程進(jìn)行熒光標(biāo)記（圖1（b）），再將載網(wǎng)迅速降低到液氮溫度以下（圖1（c）），然后將樣品轉(zhuǎn)移到冷凍光鏡中進(jìn)行熒光成像，并選擇需要減薄的目標(biāo)位置（圖1（d）），接下來，將樣品傳輸?shù)紽IB-SEM雙束電鏡下，將光鏡圖像和電鏡圖像進(jìn)行關(guān)聯(lián)，并將目標(biāo)位置FIB減薄到300 nm以下（圖1（e）），最后將樣品轉(zhuǎn)移到透射電鏡下進(jìn)行cryo-ET成像（圖1（f））。

圖1 原位冷凍細(xì)胞光電關(guān)聯(lián)成像示意圖。（a）細(xì)胞培養(yǎng)；（b）熒光標(biāo)記；（c）原位冷凍；（d）光鏡成像；（e）FIB減??；（f）cryo-ET成像Fig. 1 Schematic diagram of cryo-CLEM. (a) Cell culturing; (b) fluorescent labeling; (c) fast freezing; (d) fluorescent imaging; (e) FIB milling; (f) cryo-ET imaging

冷凍熒光成像可以精確定位標(biāo)記生物分子的位置，可是僅對(duì)熒光標(biāo)記的分子種類敏感，缺乏詳細(xì)的細(xì)胞背景，而冷凍電鏡則對(duì)生物樣品中所有分子的電子密度敏感，能夠提供詳細(xì)的細(xì)胞背景，但它缺乏廣泛適用的、特異性強(qiáng)的標(biāo)記方法。Cryo-CLEM結(jié)合了熒光圖像的特異性標(biāo)記，以及電鏡圖像的電子密度敏感特性，是一項(xiàng)發(fā)展迅速的新興技術(shù)。已經(jīng)成功用于觀測(cè)植物細(xì)胞中的自噬體[7]、動(dòng)物細(xì)胞中的微管等細(xì)胞骨架[8-9]、多層膜結(jié)構(gòu)[10-11]、酵母菌中的質(zhì)膜隔室[12]和蛋白自噬機(jī)制[13]、果蠅腦神經(jīng)[14]以及神經(jīng)細(xì)胞突觸[15]等。

3 原位冷凍技術(shù)

為了在cryo-ET下實(shí)現(xiàn)生物大分子的結(jié)構(gòu)解析，細(xì)胞的原位冷凍固定是樣品制備的第一個(gè)技術(shù)難點(diǎn)。如果將生物樣品緩慢降溫，其中的水會(huì)形成結(jié)晶態(tài)的冰，結(jié)晶態(tài)的冰會(huì)導(dǎo)致電子束發(fā)生散射，不僅會(huì)降低透射電鏡圖像對(duì)比度，還會(huì)破壞細(xì)胞中分子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。因此，為了避免細(xì)胞中的水在降溫過程中出現(xiàn)結(jié)晶態(tài)，需要使細(xì)胞中的溫度迅速降低，形成一種玻璃態(tài)的冰，這種冰對(duì)電子束來說是透明的，不會(huì)影響電鏡圖像質(zhì)量，而且能完整保存細(xì)胞中分子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，這就是原位冷凍技術(shù)[16]。

目前，根據(jù)樣品的厚度和種類，原位冷凍技術(shù)主要分為快速冷凍和高壓冷凍兩種?？焖倮鋬黾夹g(shù)主要應(yīng)用于厚度小于15 μm的樣品，其原理是將鋪設(shè)了樣品的電鏡載網(wǎng)固定在栓塞上，通過重力驅(qū)動(dòng)將載網(wǎng)迅速浸入冷卻腔室，此時(shí)腔室中注滿了由液氮冷卻的乙烷或者乙烷和甲烷的混合物，通過熱傳導(dǎo)對(duì)生物樣品進(jìn)行快速冷凍，這些液體的高熱容量、較高的沸點(diǎn)和導(dǎo)熱性可以保證冷卻速度。很多商用的快速冷凍儀器可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化冷凍控制和環(huán)境參數(shù)調(diào)節(jié)，極大地提高了生物樣品的制備效率。例如：FEI公司推出的VitrobotTM系列（圖2（a）），Gatan公司的CP3系列（圖2（b））等。

而對(duì)于超過15 μm厚的細(xì)胞樣品或者組織樣品，由于水本身的導(dǎo)熱性較差，無法通過快速冷凍技術(shù)實(shí)現(xiàn)整個(gè)樣品的快速降溫，故需要采用高壓冷凍固定（HPF）的方式[17]。當(dāng)環(huán)境壓力增加時(shí)，水的融化溫度降低，而高壓冷凍固定技術(shù)可以在幾毫秒的時(shí)間內(nèi)對(duì)樣品施加2×108Pa壓力，將水的融化溫度降低至-40 °C。高壓冷凍固定技術(shù)通過降低水的冰點(diǎn)避免形成冰晶，其可以使～250 μm厚度的樣品均勻玻璃化[18]。常用的商用高壓冷凍儀包括Leica公司的EMPact系列（圖2（c）），Bal-Tec公司的HPM系列等（圖2（d））。

圖2 商用原位冷凍設(shè)備。（a）FEI公司VitrobotTM；（b）Gatan公司CP3；（c）Leica公司EMPact；（d）Bal-Tec公司HPMFig. 2 Commercial plunge freezers and high pressure freezers. (a) VitrobotTM from FEI; (b) CP3 from Gatan; (c) EMPact from Leica; (d) HPM from Bal-Tec

4 原位冷凍光電關(guān)聯(lián)系統(tǒng)

4.1 冷凍樣品臺(tái)技術(shù)

冷凍光鏡和冷凍電鏡的關(guān)聯(lián)，依賴于高穩(wěn)定性的冷凍樣品臺(tái)。此外，對(duì)冷凍光鏡的物鏡也有特殊需求：首先，冷凍光鏡的物鏡大多使用空氣物鏡，因?yàn)榻^大多數(shù)商用油浸顯微物鏡都不適用于低溫；其次，物鏡的工作距離應(yīng)該盡量長(zhǎng)，因?yàn)槲镧R相對(duì)于樣品的溫度更高，如果距離樣品太近，會(huì)導(dǎo)致樣品結(jié)晶或是物鏡發(fā)生損傷；最后，為了達(dá)到更高的分辨率，物鏡的數(shù)值孔徑需要盡量大。世界上第一臺(tái)用于原位冷凍細(xì)胞熒光成像的冷凍樣品臺(tái)（簡(jiǎn)稱“冷臺(tái)”）由Sartori等人開發(fā)，并放置于一個(gè)倒置的光學(xué)顯微鏡上[19]。隨后，他們和FEI公司合作開發(fā)了第二代冷臺(tái)，并于2010年發(fā)布。這個(gè)冷臺(tái)可以使用工作距小于2 mm的顯微物鏡，冷臺(tái)中的自動(dòng)液氮泵可以保證EM載網(wǎng)上的樣品處于玻璃態(tài)，其一次最多可以加載4個(gè)樣品載網(wǎng)。同時(shí)，Schwartz等人開發(fā)了一臺(tái)可放置于正置光學(xué)顯微鏡上的冷凍樣品臺(tái)[20]，隨后和Instec公司合作開發(fā)了CLM77K系列冷臺(tái)（圖3（a）），為了確保樣品不升溫，該冷臺(tái)只能使用工作距為5 mm以上的顯微物鏡。Linkam公司也在同期開發(fā)了適用于多數(shù)正置光學(xué)顯微鏡的冷臺(tái)CMS196（圖3（b）），在該冷臺(tái)中，內(nèi)置液氮杜瓦瓶的設(shè)計(jì)使得冷臺(tái)不需要連接液氮泵，同時(shí)可對(duì)顯微物鏡進(jìn)行降溫，使得CMS196可以使用NA為0.9，工作距離僅有300 μm的顯微物鏡。Leica公司基于Schorb和Brigg的工作[21]，開發(fā)了商用冷臺(tái)。該冷臺(tái)通過斷開液氮罐和冷臺(tái)的直接連接，減少了氮?dú)夥序v和泵送過程中產(chǎn)生的震動(dòng)。針對(duì)冷凍熒光成像，Leica公司還開發(fā)了適用于低溫工作的空氣物鏡，在物鏡前端使用熱導(dǎo)率較低的陶瓷材料，使得物鏡的NA可達(dá)0.9，工作距離僅有280 μm。2016年，F(xiàn)EI公司開發(fā)了適用于倒置顯微鏡的冷臺(tái)CorrSight（圖3（c）），可以使用NA為0.9的物鏡，由于物鏡和樣品被一個(gè)玻璃窗口片隔開，該冷臺(tái)可以使用任意工作距離大于410 μm，且經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)蓋玻片校正的商用空氣物鏡。

圖3 幾種商用冷臺(tái)和冷臺(tái)樣機(jī)實(shí)物圖。（a）Instec公司的CLM77K；（b）Linkam公司的CMS196；（c）FEI公司的CorrSight；（d）Li等人提出的高穩(wěn)定性冷臺(tái)[19]；（e）徐濤組提出的高穩(wěn)定冷臺(tái)[20]Fig. 3 Commercial cryo stages and prototypes. (a) CLM77K from Instec; (b) CMS196 from Linkam; (c) CorrSight from FEI;(d) Cryo stage proposed by Li[19]; (e) Cryo stage proposed by Xu[20]

上述冷臺(tái)存在的一個(gè)共同問題：較低的溫度穩(wěn)定性和機(jī)械穩(wěn)定性。為了解決這個(gè)問題，研究者提出將換樣機(jī)構(gòu)和冷臺(tái)的溫度同機(jī)械穩(wěn)定性耦合，以提高冷臺(tái)的穩(wěn)定性，進(jìn)而提高光鏡成像分辨率和敏感度。但是這種設(shè)計(jì)對(duì)物鏡工作距離有較高要求[22-24]。Hessel等人設(shè)計(jì)的冷臺(tái)采用了長(zhǎng)工作距物鏡，可以在液氦溫度（1.6 K）下使用，光路相對(duì)簡(jiǎn)單，但是如果采用高NA物鏡，會(huì)引起很大的球差和色差[24]。Li等人提出的冷臺(tái)結(jié)構(gòu)如圖3（d）所示，將物鏡放置在冷臺(tái)外的室溫中，物鏡和冷臺(tái)之間用光學(xué)窗隔開，因此，需要采用更長(zhǎng)工作距離的物鏡，其能使用的最大NA物鏡是0.7[22]。國(guó)內(nèi)方面，中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所的徐濤課題組在2018年報(bào)道了一臺(tái)具備極高的溫度穩(wěn)定性（＜0.06 K/10 h）和機(jī)械穩(wěn)定性（＜200 nm/5 h）的冷臺(tái)（圖3（e）），使用的商用物鏡的NA為0.8，工作距離為3 mm，其采用該冷臺(tái)實(shí)現(xiàn)了單分子定位成像[23]。

4.2 原位冷凍光電關(guān)聯(lián)成像系統(tǒng)

根據(jù)原位冷凍光鏡相對(duì)于電鏡的位置，可以將cryo-CLEM成像系統(tǒng)分成兩類，一類是分體式cryo-CLEM系統(tǒng)（圖4（a）），其冷凍光鏡獨(dú)立于FIB-SEM電鏡，樣品在冷凍光鏡下成像后，通過冷凍傳輸系統(tǒng)傳輸?shù)诫婄R真空腔室內(nèi)，再進(jìn)行電鏡成像和FIB切割減薄，減薄后的樣品薄片再經(jīng)由冷凍傳輸?shù)絚ryo-ET中；另外一類是嵌入式冷凍光電關(guān)聯(lián)系統(tǒng)，其光鏡部分嵌入電鏡腔室內(nèi)，冷凍樣品在光鏡下成像后直接在真空腔室切換到電鏡下成像，而且在FIB切割減薄過程中，可以隨時(shí)將樣品移動(dòng)到光鏡成像位置，樣品薄片制備完成后，再通過冷凍傳輸?shù)絚ryo-ET中。

圖4 （a）分體式cryo-CLEM的成像系統(tǒng)示意圖；（b）分體式cryo-CLEM的成像流程Fig. 4 (a) Schematic diagram and (b) flow chart of imaging process of independent cryo-CLEM system

4.2.1 分體式冷凍光電關(guān)聯(lián)成像系統(tǒng)

如圖4（b）所示，分體式冷凍光電關(guān)聯(lián)成像流程如下：首先，在電鏡載網(wǎng)上培養(yǎng)細(xì)胞和熒光標(biāo)記；然后，將載網(wǎng)放入冷凍設(shè)備中進(jìn)行快速冷凍或高壓冷凍；接下來，通過冷凍傳輸將樣品傳到冷凍光鏡中進(jìn)行光鏡成像，再通過冷凍傳輸將樣品傳入FIB-SEM中，關(guān)聯(lián)光鏡和電鏡圖像，并用FIB切割減薄；最后，將樣品冷凍傳輸?shù)嚼鋬鐾干潆婄R中，進(jìn)行cryo-ET成像[22]。由于冷凍光鏡獨(dú)立于FIB-SEB雙束電鏡，可以采用更復(fù)雜的光路結(jié)構(gòu)，引入各種超分辨成像模態(tài)[23]。

冷凍樣品的光學(xué)超分辨成像仍然是一個(gè)較新的領(lǐng)域：一方面，熒光分子的光漂白（photo-bleaching）和光分解(photo-decomposition)效應(yīng)在低溫下會(huì)大大降低，甚至消失[19,24]；另一方面，有些熒光蛋白的光轉(zhuǎn)換（photo-switching）能力消失，有些雖然存在，也和室溫下的條件差異很大；另外，很多超分辨方法需要使用較高的激光強(qiáng)度，可能會(huì)使樣品局部升溫，生成冰晶，導(dǎo)致生物樣品損壞。下面介紹一些已經(jīng)應(yīng)用于冷凍樣品成像的超分辨成像技術(shù)，如圖5（彩圖見期刊電子版）所示。

冷凍受激發(fā)射耗盡顯微術(shù)（cryo-STED）采用兩路激光同時(shí)進(jìn)行掃描，一路是激發(fā)光，用于成像，另一路是STED光通過相位調(diào)制產(chǎn)生甜甜圈形狀的光斑，用于抑制焦點(diǎn)邊緣信號(hào)，從而獲得更小的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（圖5（a）），其分辨率可達(dá)30～80 nm，且可以實(shí)現(xiàn)三維成像。有研究者發(fā)現(xiàn)低溫下，cryo-STED的分辨率可以提升1.6倍[25]，然而文獻(xiàn)中的樣品是緩慢降溫，并未進(jìn)入玻璃態(tài)，而且低溫下所需的功率密度可達(dá)MW/cm2～GW/cm2。此外，還有研究證明300 W/cm2強(qiáng)度激光照射樣品1～2分鐘，就會(huì)破壞玻璃態(tài)，導(dǎo)致冷凍樣品中產(chǎn)生冰晶。最近一些研究人員將STED成像應(yīng)用于樹脂包埋后的生物樣品中，并與透射電鏡圖像進(jìn)行關(guān)聯(lián)[8,26-27]，而在原位冷凍生物樣品中的應(yīng)用還有待進(jìn)一步研究。

圖5 幾種超分辨冷凍熒光顯微鏡示意圖。（a）冷凍STED成像；（b）冷凍單分子定位成像；（c）冷凍結(jié)構(gòu)光照明成像；（d）冷凍Airyscan成像Fig. 5 Schematic diagrams of cryo supper resolution fluorescent microscopy. (a) cryo-STED; (b) cryo-SMLM; (c) cryo-SIM;(d) cryo-Airyscan

基于熒光分子的光轉(zhuǎn)換能力，研究人員提出了冷凍單分子定位成像（cryo-SMLM）。該技術(shù)使每次采集圖像僅有少量的單個(gè)熒光分子發(fā)光，并準(zhǔn)確定位每個(gè)熒光分子的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)質(zhì)心，再將多張圖像疊加形成一幅超高分辨率的圖像（圖5（b））。冷凍單分子定位成像包含冷凍光激活定位（cryo-PALM）、冷凍隨機(jī)光學(xué)重建（cryo-STORM）、冷凍熒光活化定位（cryo-fPALM），冷凍光學(xué)波動(dòng)成像（cryo-SOFI）等，分辨率取決于探測(cè)到的單個(gè)熒光分子的光子數(shù)。目前已有多種單分子熒光定位成像應(yīng)用于冷凍樣品中[28-32]。通過采用長(zhǎng)工作距，較高數(shù)值孔徑（0.75～0.8）的空氣物鏡，提供了出色的分辨率（75～125 nm）。2021年，Andrian等人采用DNA-PAINT單分子成像技術(shù)和透射電鏡成像關(guān)聯(lián)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)納米顆粒的高精度光電關(guān)聯(lián)[33]。然而,要達(dá)到常溫單分子定位成像的納米級(jí)別分辨率[34-35]，對(duì)于原位冷凍生物樣品來說，還面臨許多挑戰(zhàn)。首先，cryo-SMLM高度依賴于熒光分子在低溫下的轉(zhuǎn)換特性[36]，前期樣品制備較為復(fù)雜。針對(duì)這一問題，Robichaux等人在2019年將老鼠視網(wǎng)膜做成超薄切片，并進(jìn)行cryo-STORM和cryo-ET成像，在感光細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了以前未知的亞結(jié)構(gòu)，并揭示了關(guān)鍵蛋白的分布[37]；Moser等人于2019年采用cryo-SOFI成像對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行成像，并與cryo-ET圖像進(jìn)行關(guān)聯(lián)，由于SOFI的成像不需要光漂白或者光開關(guān)，所需的激發(fā)功率更低，能夠有效降低樣品結(jié)晶的風(fēng)險(xiǎn)[38]；Hoffman等人在2020年發(fā)表了有關(guān)原位冷凍多色單分子光電關(guān)聯(lián)成像的研究成果，他們采用液氦作為冷源，使用藍(lán)寶石蓋玻片支撐樣品，獲得了可以與透射電鏡精準(zhǔn)關(guān)聯(lián)的高分辨光鏡圖像[29]。其次，長(zhǎng)時(shí)間的高強(qiáng)度激光照射，導(dǎo)致樣品溫度升高，存在玻璃態(tài)被破壞的風(fēng)險(xiǎn)，針對(duì)這一問題，Liu等人采用方華膜載網(wǎng)代替炭膜載網(wǎng)，以降低載網(wǎng)從激光中吸收的熱量，這樣可以將用于單分子成像的光功率增加到1.75 kW/cm2，并獲得了75 nm的分辨率[32]?？墒牵捎诜饺A膜對(duì)電子的吸收率較高，導(dǎo)致電鏡成像對(duì)比度和分辨率降低。此外，單分子成像的定位精度與收集到的光子數(shù)開方成正比，要實(shí)現(xiàn)超高分辨率，需要大量圖片疊加，耗時(shí)良久，單分子成像視場(chǎng)通常小于50 μm×50 μm，在光電關(guān)聯(lián)應(yīng)用上，通常需要進(jìn)行視場(chǎng)拼接，這進(jìn)一步增加了成像時(shí)間。這也是限制冷凍單分子定位成像應(yīng)用的主要因素。

冷凍結(jié)構(gòu)光照明顯微成像（cryo-SIM）采用空間光調(diào)制器生成周期性條紋的激發(fā)光，并將3個(gè)不同方向的條紋光照射到樣品上，再利用算法重建出含有高頻信息的圖像，其橫向和軸向分辨率相比寬場(chǎng)成像可以提高2倍（圖5（c））。由于多數(shù)熒光蛋白低溫下的熒光強(qiáng)度更高，更不易漂白，基于此，cryo-SIM已經(jīng)成功應(yīng)用到冷凍樣品成像中[29]。然而，傳統(tǒng)的SIM成像對(duì)調(diào)制照明光路像質(zhì)要求非常高，容易在圖像重建中出現(xiàn)偽像。對(duì)原位冷凍光鏡成像來說，顯微物鏡僅能使用長(zhǎng)工作距的空氣物鏡，加上物鏡到樣品焦面真空和玻璃態(tài)水的折射率偏差，SIM系統(tǒng)的像質(zhì)難以保證。Arnold等人將在光鏡和電鏡中均能成像的鐵磁小球鋪在生物樣品上，利用小球的相對(duì)位置對(duì)光鏡和電鏡圖像進(jìn)行配準(zhǔn)，將圖像關(guān)聯(lián)精度提高到200～300 nm[6]。Hoffman等人則首先在液氦溫度下，通過cryo-SIM得到光鏡圖像，再用冷凍樹脂替代樣品，送入FIB-SEM雙束電鏡中進(jìn)行切片成像，最后利用樣品中的熒光小球進(jìn)行光電關(guān)聯(lián)配準(zhǔn)[29]。Phillips等人開發(fā)了一套3D cryo-SIM成像系統(tǒng)，采用NA為0.9，工作距離為2 mm的物鏡。對(duì)于488 nm激發(fā)光的熒光小球，成像橫向分辨率和軸向分辨率分別為210 nm和640 nm[39]。

冷凍Airyscan（cryo-Airyscan）顯微成像是一種基于像素重構(gòu)原理（Pixel Reassignment）的超分辨成像技術(shù)，它源自生物光學(xué)成像的金標(biāo)準(zhǔn)——共聚焦顯微成像技術(shù)。cryo-Airyscan將原先的針孔替換為陣列探測(cè)器。陣列探測(cè)器的每個(gè)單元獨(dú)立成像。通過對(duì)每個(gè)單元圖像解卷積和移位線性運(yùn)算，可以重建出最終的超分辨圖像，其分辨率相對(duì)于傳統(tǒng)共聚焦成像（未做解卷積）提高了1.7倍（圖5（d））。如果將每個(gè)探測(cè)單元的圖像不經(jīng)過移位直接相加，就得到了共聚焦圖像。cryo-Airyscan成像與cryo-SIM成像類似，均可使冷凍樣品的熒光強(qiáng)度提高，光漂白效應(yīng)減弱，并且已經(jīng)成功應(yīng)用到冷凍生物樣品中[40]。此外，由于Airyscan采用點(diǎn)掃描和有限尺度探測(cè)的成像方式，在圖像重建之前，就已經(jīng)有效過濾了焦面外的背景熒光，更適用于熒光分子分布更密集的厚樣品。Zeiss公司開發(fā)了一套基于Airyscan的cryo-CLEM成像系統(tǒng)，并成功應(yīng)用于FIB-SEM和Cryo-ET[10,41-42]。

國(guó)內(nèi)方面，中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所成像平臺(tái)開發(fā)了一套基于寬場(chǎng)成像的cryo-CLEM系統(tǒng)HOPE[43]，其硬件主體是一臺(tái)高真空冷臺(tái)。其可以搭載在寬場(chǎng)熒光顯微鏡上，實(shí)現(xiàn)冷凍熒光成像，并可與透射電鏡冷凍樣品桿連接。由于機(jī)械結(jié)構(gòu)的限制，該冷臺(tái)只使用了10倍和40倍的空氣物鏡。此外，徐濤課題組還開發(fā)了一套基于單分子成像的冷凍超分辨sCLEM成像系統(tǒng)[20,44]。該系統(tǒng)采用開放式冷凍樣品臺(tái)，其收集端使用柱透鏡以提高軸向分辨率，并引入實(shí)時(shí)漂移校正（校正精度約5 nm）模塊。該系統(tǒng)可以使用NA為0.8，工作距離為3 mm的空氣鏡，橫向分辨率可達(dá)13 nm，軸向分辨率約為40 nm。

4.2.2 嵌入式冷凍光電關(guān)聯(lián)成像系統(tǒng)

嵌入式冷凍光電關(guān)聯(lián)成像流程如圖6（b）所示。首先在電鏡載網(wǎng)上培養(yǎng)細(xì)胞和熒光標(biāo)記，再將載網(wǎng)放入冷凍設(shè)備中進(jìn)行快速冷凍或高壓冷凍，然后通過冷凍傳輸將樣品傳到嵌入式光電關(guān)聯(lián)設(shè)備中進(jìn)行光鏡成像、光電圖像關(guān)聯(lián)和FIB切割減薄，最后將樣品冷凍傳輸?shù)嚼鋬鐾干潆婄R中，進(jìn)行Cryo-ET成像。對(duì)比分體式系統(tǒng)，嵌入式系統(tǒng)的流程中少了將樣品冷凍傳輸送入光鏡和FIB-SEM的過程，而是直接在電鏡艙室內(nèi)完成冷凍光鏡成像、光電圖像關(guān)聯(lián)和FIB減薄。由于在冷凍傳輸過程中部分樣品存在升溫的可能，減少冷凍傳輸?shù)牟襟E不僅可以簡(jiǎn)化成像流程，提高效率，還能減少樣品污染的風(fēng)險(xiǎn)。另外，由于冷凍光鏡和電鏡成像位于同一腔室，可以方便快捷地在兩種成像模式中進(jìn)行切換。FIB的減薄過程，也能夠用冷凍光鏡進(jìn)行監(jiān)控，從而提高減薄的準(zhǔn)確率。同時(shí)，嵌入式冷凍光鏡由于部分嵌入雙束電鏡中，受限于電鏡腔室大小和外形尺寸，很難采用復(fù)雜的光路結(jié)構(gòu)，現(xiàn)有的嵌入式冷凍光鏡大多采用比較簡(jiǎn)單的成像模式。

圖6 嵌入式cryo-CLEM成像系統(tǒng)的（a）示意圖和（b）成像流程Fig. 6 (a) Schematic diagram and (b) block diagram of imaging process of integrated cryo-CLEM system

Faas等人最早將一個(gè)寬場(chǎng)顯微鏡集成到透射電鏡中，并應(yīng)用于觀測(cè)冷凍樣品，命名為iLEM[45]。其可以通過熒光位置判斷樣品薄片上的感興趣區(qū)域。iLEM的主要限制因素是透射電鏡腔室內(nèi)的空間有限，冷凍光鏡的分辨率很低，而且采用光電關(guān)聯(lián)成像的重要原因是這種結(jié)構(gòu)無法實(shí)現(xiàn)熒光導(dǎo)航樣品減薄。后來，Gorelick等人提出將一個(gè)寬場(chǎng)光學(xué)顯微鏡集成到一臺(tái)商用雙束電鏡中。其可以使用若干不同的商用顯微物鏡，最高NA為0.95，工作距為0.33 mm，可實(shí)現(xiàn)對(duì)原位冷凍樣品的高分辨成像[5]，同時(shí)通過采用鐵磁小球進(jìn)行光電圖像配準(zhǔn)，指導(dǎo)FIB減薄。隨后，Delmic公司開發(fā)了一套嵌入式光電關(guān)聯(lián)成像系統(tǒng)——METEOR，該系統(tǒng)可以外掛在商用FIB-SEM電鏡艙室上，并通過真空法蘭將光路導(dǎo)入電鏡腔室內(nèi)[46]，從而實(shí)現(xiàn)多色寬場(chǎng)熒光成像，并指導(dǎo)FIB減薄[47-48]。

5 總結(jié)與展望

自從Schwartz等人首次將冷凍熒光成像和冷凍電鏡成像相結(jié)合[49]，cryo-CLEM技術(shù)已經(jīng)發(fā)展了15年，它結(jié)合了冷凍電鏡成像的高分辨能力和熒光成像的特異性標(biāo)記能力，隨著細(xì)胞原位蛋白解析在生物學(xué)上的應(yīng)用越來越廣泛，cryo-CLEM及其派生的熒光導(dǎo)航減薄技術(shù)有著廣闊的應(yīng)用前景。然而，作為一項(xiàng)新興技術(shù)，cryo-CLEM還遠(yuǎn)不夠成熟，有很多挑戰(zhàn)有待克服。

cryo-CLEM目前有兩條技術(shù)實(shí)現(xiàn)路線：分體式和嵌入式cryo-CLEM成像。分體式cryo-CLEM成像中的冷凍光鏡獨(dú)立于電鏡存在，其可以在現(xiàn)有的熒光顯微鏡上嵌入冷凍樣品臺(tái)，目前已經(jīng)開發(fā)出多種成像模態(tài)。目前面臨的技術(shù)瓶頸主要是冷凍樣品臺(tái)的機(jī)械穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性，尤其對(duì)于超分辨冷凍熒光成像，例如對(duì)于cryo-SMLM，冷凍樣品臺(tái)需要達(dá)到納米級(jí)別的穩(wěn)定性，才能獲得納米量級(jí)的分辨率，才能更好地與cryo-ET圖像匹配[50]。此外，絕大多數(shù)冷凍熒光成像使用的都是空氣物鏡，數(shù)值孔徑有限，這影響了冷凍熒光成像的分辨率和信噪比。因此，研制能夠在冷凍條件下使用的浸沒式物鏡，進(jìn)一步提高數(shù)值孔徑和光子接收效率，也是未來的發(fā)展方向。

除了硬件技術(shù)本身的限制，冷凍樣品本身也是限制冷凍超分辨熒光成像的因素。首先，cryo-SMLM和cryo-STED都需要很高的局部功率密度才能產(chǎn)生光漂白、光轉(zhuǎn)換或者光損耗效應(yīng)，而過高的激光功率密度產(chǎn)生的熱效應(yīng)會(huì)使得冷凍樣品發(fā)生局部結(jié)晶，從而破壞冷凍透射電鏡的成像效果。因此，cryo-SMLM和cryo-STED的激發(fā)功率密度遠(yuǎn)低于室溫下的SMLM和STED成像，對(duì)于cryo-STED來說，較低的STED光功率限制了成像的分辨率，而對(duì)于cryo-SMLM來說，如果沒有光漂白或是光轉(zhuǎn)換效應(yīng)，則無法進(jìn)行單分子成像。在較高激光功率密度下，如何及時(shí)給冷凍樣品降溫，避免樣品局部結(jié)晶是一個(gè)可行的思路。其次，在低溫冷凍條件下，很多熒光探針的特性發(fā)生了改變，大多數(shù)探針的熒光效率更高，同時(shí)更難被漂白或發(fā)生光轉(zhuǎn)換效應(yīng)，這對(duì)cryo-SIM和cryo-Airyscan這類成像來說是有利因素，而對(duì)cryo-SMLM來說則是不利因素，因此，探索單分子熒光探針的低溫特性，開發(fā)能夠在冷凍條件下使用的單分子探針也是未來的發(fā)展方向之一。

對(duì)于cryo-CLEM來說，將冷凍光鏡和電鏡模式下所成圖像進(jìn)行精確配準(zhǔn)，是成功實(shí)現(xiàn)原位光電關(guān)聯(lián)和熒光導(dǎo)航離子束減薄的必要步驟。光電關(guān)聯(lián)圖像配準(zhǔn)通常分為兩步。第一步是粗略配準(zhǔn)，通過使用帶有坐標(biāo)標(biāo)記的電鏡載網(wǎng)實(shí)現(xiàn)；第二步是精確配準(zhǔn)，目前常用的方法是在生物樣品制備過程中，鋪設(shè)在熒光成像和電鏡下都能看到的鐵磁珠、金顆?；蚓郾揭蚁┬∏颍龠x取一些小球作為基準(zhǔn)，將兩幅圖像進(jìn)行配準(zhǔn)。由于FIB圖像相對(duì)于SEM和熒光圖像有一個(gè)夾角，而且最終的樣品薄片小于200 nm，故要實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的FIB減薄，需要將熒光圖像和FIB圖像進(jìn)行精確的三維配準(zhǔn)。理論上來說，只要選取的配準(zhǔn)點(diǎn)足夠多，就能夠?qū)崿F(xiàn)高精度的三維配準(zhǔn)，可是在實(shí)際使用中還存在很多問題。例如在分體式cryo-CLEM中，從冷凍熒光成像到冷凍電鏡成像，需要經(jīng)過冷凍樣品轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移過程可能會(huì)改變樣品的局部形態(tài)，導(dǎo)致配準(zhǔn)失敗。此外，在配準(zhǔn)點(diǎn)中心的選擇、目標(biāo)中心的選擇等人工過程中也存在誤差，這些都會(huì)對(duì)配準(zhǔn)精度產(chǎn)生影響。針對(duì)上述問題，提高原位冷凍光電關(guān)聯(lián)圖像配準(zhǔn)精度是未來的重要發(fā)展方向。

另一種cryo-CLEM成像技術(shù)路線—嵌入式cryo-CLEM成像，是將冷凍光鏡集成在FIBSEM電鏡腔室內(nèi)，少了一個(gè)冷凍樣品傳輸步驟，故可以降低樣品結(jié)晶和污染的風(fēng)險(xiǎn)，且在FIB減薄過程中，可以方便地檢查熒光狀態(tài)，較分體式cryo-CLEM更有優(yōu)勢(shì)。嵌入式cryo-CLEM還處于發(fā)展的初級(jí)階段，光鏡模態(tài)目前僅限于寬場(chǎng)成像，分辨率較低，且缺失三維信息，主要限制因素是電鏡腔室內(nèi)空間有限，而光鏡的其他模塊如果外掛在電鏡主體上，可能影響電鏡的機(jī)械穩(wěn)定性。因此，下一步需要做的工作包括：第一，擴(kuò)展嵌入式cryo-CLEM中光鏡的成像模態(tài)，引入三維成像和超分辨成像，提高光鏡的成像分辨率；第二，使嵌入式cryo-CLEM為熒光導(dǎo)航FIB減薄提供更多信息，便于檢查樣品減薄過程中的熒光，為了提高熒光導(dǎo)航減薄的精度和準(zhǔn)確性，需要發(fā)展新的光電關(guān)聯(lián)配準(zhǔn)流程和方法。