黃宇然，張智敏，董婉潔，徐 良，韓于冰，郝 翔，匡翠方,3,4 ，劉 旭

（1. 浙江大學 光電科學與工程學院 現(xiàn)代光學儀器國家重點實驗室, 浙江 杭州 310027；2. 之江實驗室 智能芯片與器件研究中心, 浙江 杭州 311121；3. 浙江大學 寧波研究院, 浙江 寧波 315100；4. 山西大學 極端光學協(xié)同創(chuàng)新中心, 山西 太原 030006）

1 引 言

熒光顯微鏡是生命科學領域探索細胞結構、分析細胞生命活動的重要工具。然而，由于阿貝衍射極限[1]的存在，熒光顯微鏡的分辨率被限制在半波長左右，從而限制了對亞細胞器、蛋白質等更細微結構的研究。近年來，為了突破衍射極限的限制，一系列超分辨顯微成像技術被提出，其根據(jù)原理可分為3類：基于點擴散函數(shù)（PSF）工程[2-3]、基于單分子定位[4-5]和基于頻域擴展[6]。

在基于PSF工程的點掃描超分辨顯微技術中，受激輻射損耗顯微術（STimulated Emission Depletion microscopy, STED）[2]是最具代表性的一種，其基本原理是利用一束經(jīng)渦旋相位調制產生的高光強空心損耗光斑抑制位于實心激發(fā)光斑外圍的熒光分子的發(fā)射熒光，以獲得更窄的有效PSF。目前，STED技術已經(jīng)獲得了廣泛應用，但其生物成像能力仍受特異性染料需求及高損耗光強引起的光漂白和光毒性問題的限制。

熒光輻射差分顯微術（Fluorescence Emission Difference microscopy, FED）[3]使用空心激發(fā)光斑掃描樣品，獲得空心光斑圖像；再與實心激發(fā)光斑掃描樣品獲得的圖像進行差分，從而獲得背景噪聲更低且分辨率較共聚焦系統(tǒng)提升一倍的熒光顯微圖像。FED的空心光斑光強與實心激發(fā)光斑相近，遠遠低于STED中的損耗光，因此極大地緩解了光漂白和光毒性問題，且對熒光染料高度普適。

由于FED需要進行兩次掃描成像，近年來，本團隊提出了一系列旨在提高FED成像速度的方法[7-9]。其中與并行探測相結合而形成的虛擬熒光輻射差分顯微術（virtual Fluorescence Emission Difference microscopy, vFED）[7]只使用空心激發(fā)光斑對樣品進行單次掃描形成空心光斑圖像，再經(jīng)過光子重組形成虛擬的實心光斑圖像，兩者差分后得到vFED圖像。在這一方法的基礎上，本團隊進一步提出了飽和虛擬熒光輻射差分顯微術[10]，該方法利用熒光的非線性效應將分辨率在vFED的基礎上又提升了34.5%。然而，這兩項工作主要進行了原理與計算方面的研究，vFED方法的實驗驗證尚未完成。

本文在前述工作的基礎上，進一步考慮了信噪比和背景噪聲的影響，提出了實驗上可行的vFED成像模型，設計并搭建了一套三色虛擬熒光輻射差分顯微成像系統(tǒng)，并對系統(tǒng)性能進行了實驗驗證。

2 vFED系統(tǒng)及原理

2.1 系統(tǒng)光路

vFED系統(tǒng)相較于需要兩個激發(fā)光路的FED系統(tǒng)更加簡化，只需單路即可實現(xiàn)超分辨成像，降低了光路的搭建和校準難度。圖1為簡化光路圖，激光由一單模保偏光纖出射后，經(jīng)過準直透鏡L1，并被渦旋相位板調制為渦旋光，從而在物鏡聚焦后產生甜甜圈形的空心光斑。用一個半波片和一個1/4波片聯(lián)合調整光束的偏振，以在焦面上獲得高質量的圓偏振光。然后，通過一組4f透鏡組L2、L3對激發(fā)光進行擴束，在實現(xiàn)激發(fā)光充滿物鏡入瞳的同時，也起到了使渦旋相位板與物鏡入瞳共軛的作用。激發(fā)光照明樣品產生的熒光沿原光路返回，此時透鏡L3也同時用作探測光的收集透鏡；熒光透過二色鏡后被一19芯多模光纖束收集，光纖束中每根光纖的端面都起到了共聚焦顯微鏡中小孔的作用。光纖束將光信號分別導入19個雪崩光電二極管中，產生的電信號被采集卡采集并導入計算機中進行分析，并實時成像。本文使用488 nm、561 nm、640 nm 3個波段的激發(fā)光分別調制，3束光合束后進入同一個物鏡，從而實現(xiàn)了三色vFED成像。

圖1 虛擬熒光輻射差分顯微系統(tǒng)簡圖Fig. 1 Sketch of virtual fluorescence emission difference microscopy

2.2 系統(tǒng)成像原理與模型

在vFED中，在每個掃描位置都進行一次19通道的并行探測，在完成整個視場的掃描后，即獲得了19幅圖像。光纖束端面中處于位置的光纖所對應的圖像可表示為：

式中q（ 0＜q≤1）是位移系數(shù)。相應地，光子重組后的圖像最終PSF為：

在vFED中，雖然是使用空心光斑而非實心光斑掃描樣品，但光子重組仍然有效。圖2（彩圖見期刊電子版）是遵循矢量衍射理論計算[13-14]的vFED原理仿真結果。圖2(a)中的黑紅藍3條曲線分別代表圖1中對應顏色通道PSF的歸一化強度分布，在計算時各項參數(shù)設置得與實際實驗中的參數(shù)相同，物鏡NA為1.49，激發(fā)光波長為640 nm時光纖束總直徑相當于1.2個艾里斑。不同通道的PSF峰值位置發(fā)生了偏移，然而它們的0值位置仍然都位于中心處。此時若將各圖像直接相加，結果圖仍得到空心PSF，但若如圖2(b)所示進行光子重組，則PSF原中心處將不再是0值，相加后得到了實心PSF，通過選取合適的位移系數(shù)q，可使實心PSF與空心PSF的外輪廓能夠較好地匹配。將實心PSF與空心PSF對應的圖像進行差分，即得到vFED圖像。這一過程及其對應的PSF可以表示為：

圖2 系統(tǒng)成像模型。（a）黑色、紅色、藍色曲線分別是并行探測的中心通道和左側、右側邊緣通道的PSF的歸一化強度分布；（b）進行光子重組后邊緣通道的PSF歸一化強度分布，與中心通道外輪廓匹配；（c）n=1，q=0.35，p=1，無噪聲時的vFED成像模型，紅色、藍色、黑色曲線分別是光子重組并相加得到的虛擬實心光斑圖像PSF、中心通道獲得的空心光斑圖像PSF、vFED圖像PSF；（d）n=7，q=0.5，p=0.85，無噪聲時的vFED成像模型，曲線的意義和（c）相同；（e) 考慮背景噪聲時的vFED成像模型，各通道包含的背景噪聲在該通道總光子數(shù)中的占比相同，參數(shù)n、q、p與（c）相同；（f）藍色、紅色、黑色、綠色曲線分別是共聚焦PSF、實心光斑光子重組方法PSF、按（c）和（d）的n、q、p參數(shù)計算的vFED圖像PSF，背景噪聲水平與（e）相同F(xiàn)ig. 2 Imaging model of the system. (a) The black, red, and blue curves are the normalized PSFs of the center, left and right edge channels in parallel detection, respectively; (b) the normalized PSFs of the edge channels after photon reassignment, matching the outer contour of the center channel; vFED imaging model without noise at (c) n=1, q=0.35, p=1 and(d) n=7, q=0. 5, p=0.85, the red, blue and black curves are virtual solid spot image PSF obtained by photon reassignment and summation, the hollow spot image PSF obtained from the center channel, and the vFED image PSF, respectively; (e) vFED imaging model when background noise is considered, the background noise contained in each channel accounts for the same proportion of the total number of photons in the channel, and the parameters n, q, p are the same as those in (c); (f) the blue, red, black, and green curves are the confocal PSF, solid spot photon reassignment method PSF, vFED image PSF calculated according to the n, q, p parameters of (c) and (d) , respectively. The background noise level is the same as that in (e)

式中p（ 0 ＜p≤1）是差值系數(shù)。其中，

然而，若考慮噪聲的影響， 由于中心通道只接收到總光子數(shù)中的一部分，由單張圖像構成的空心光斑圖像往往信噪比不足，使得差分后的vFED圖像的信噪比受到限制。為解決這一問題，可采用部分非中心通道獲得的圖像相加；此外采取較大的位移系數(shù)q也可進一步提升信噪比。然而，更大的空心光斑圖像數(shù)n將導致分辨率略微下降。同時，隨著位移系數(shù)q的增大負值畸變也將出現(xiàn)。此時為避免過大的負值畸變淹沒樣品的有效信息，差值系數(shù)p需適當減小。圖2(d)展示了傾向于保證信噪比時的各圖像PSF，此時，空心光斑圖像數(shù)n取 7，位移系數(shù)q取0.5，差值系數(shù)p取0.85。此時vFED圖像PSF出現(xiàn)了與傳統(tǒng)FED相似的負值畸變，但相較傳統(tǒng)FED，其只需單次掃描即可成像的優(yōu)勢仍得以保留。實際成像時，需選取合適的空心光斑圖像數(shù)n、 位移系數(shù)q和差值系數(shù)p，以使分辨率、信噪比和負值畸變這三者達到平衡：首先由信噪比確定合適的空心光斑圖像數(shù)n，再確定不產生明顯負值畸變時的最大位移系數(shù)q和差值系數(shù)p。

進一步地，在實際成像時由于樣品的離焦信號和雜散光等的影響，各通道獲得的圖像可能包含一定的背景噪聲。圖2(e)和圖2(f)說明了考慮背景噪聲時vFED的成像性能，其中各通道包含的的背景噪聲在該通道總光子數(shù)中的占比相同。圖2(e)除有背景噪聲外，其余參數(shù)與圖2(c)相同?？梢?，經(jīng)過vFED差分處理后，vFED圖像基本消除了背景噪聲的影響，其總光子數(shù)、半高全寬等與圖2(c)基本相同。圖2(f)對比了vFED與共聚焦以及實心光斑光子重組方法的成像性能，各方法設置的背景噪聲水平相同， 兩個vFED圖像的歸一化強度分布采用的參數(shù)（除背景噪聲外）分別與圖2(c)和圖2(d)相同。差分產生的負值被置為0?？梢娂词瓜噍^于效果略好于共聚焦的實心光斑光子重組方法，vFED圖像的PSF半高全寬也明顯減小，分辨率得到提高，且其背景噪聲水平顯著降低，證明vFED方法具有良好的去背景能力。

3 實驗結果

為了驗證虛擬熒光輻射差分顯微系統(tǒng)的超衍射極限成像能力，本文首先使用波長為640 nm的激發(fā)光激發(fā)200 nm熒光顆粒進行成像，結果如圖3（彩圖見期刊電子版）所示。圖3(a)是從光路中取出渦旋相位板后掃描樣品，將各通道圖像直接相加得到的共聚焦圖像；圖3(b)是對同一組數(shù)據(jù)進行光子重組后得到的圖像。圖3(c)是加入渦旋相位板后的同一區(qū)域的vFED圖像，它是通過圖3(d)光子重組后的虛擬實心光斑圖像和圖3(e)中心通道的空心光斑圖像之間進行差分得到的。由圖3可見，一系列在共聚焦中因為衍射極限的存在而無法分辨的彼此靠近的顆粒，在vFED圖像中能夠被很好地分開。圖3(f)選取了其中一個區(qū)域，給出了沿共聚焦圖像、實心光斑光子重組圖像和vFED圖像中白色截線的歸一化強度分布。可見，不同于前兩者，vFED圖像對應的曲線呈現(xiàn)兩個明顯的峰值，從而清晰地揭示了兩個顆粒的位置。為進一步定量說明vFED圖像分辨率的提升，分別對圖3(a)～3(c)中方框內的區(qū)域進行了高斯擬合，得到的半高全寬分別為425.75 nm、320.96 nm、224.72 nm，由此可知，vFED方法相較1.2倍艾里斑針孔下的共聚焦圖像實現(xiàn)了1.9倍分辨率提升。事實上，考慮到熒光顆粒具有一定的大小，vFED方法的實際分辨率的提升性能還要高于這一水平。

圖3 熒光顆粒成像結果。（a）共聚焦圖像；（b）實心光斑光子重組圖像；（c）vFED圖像；(d）虛擬實心光斑圖像；（e）空心光斑圖像；（f）圖（a)～(c) 中白色截線的歸一化強度分布Fig. 3 Fluorescent particle imaging results. (a) Confocal image; (b) solid spot photon reassignment image; (c) vFED image;(d) virtual solid spot image; (e) hollow spot image; (f) normalized intensity of the white truncation line in figures(a)～(c)

生物樣品較熒光顆粒結構更加復雜，且更易漂白，限制了激發(fā)光功率，使其成像時較熒光顆粒更易受到噪聲的影響。本文進一步使用三色生物樣品（640:star red標記的核孔復合物；561:star orange標記的高爾基體；488:star green標記的波形蛋白）進行成像，結果如圖4（彩圖見期刊電子版）所示。圖4(a)～4(b)是實心光斑光子重組圖像，其中圖4(b)是圖4(a)中方框內區(qū)域的放大圖，圖4(c)是同一區(qū)域的vFED圖像。通過對比可以發(fā)現(xiàn)盡管vFED圖像信噪比有一定程度下降，但相較于實心光斑光子重組圖像，其可揭示出更多的樣品細節(jié)，分辨率得到明顯提高。

圖4 三色生物樣品的成像結果。（a）實心光斑光子重組圖像；（b）圖（a）中方框內區(qū)域的放大圖；（c）同一區(qū)域的 vFED 圖像Fig. 4 Imaging results of three-color biological samples.(a) Solid spot photon reassignment image; (b) enlarged view of the area inside the box in (a); (c)vFED image of the same area

4 結 論

本文提出了存在背景噪聲和受信噪比限制的vFED成像模型，設計搭建了一套三色虛擬熒光輻射差分顯微系統(tǒng)，并通過熒光顆粒和生物樣品成像驗證了其超衍射極限成像能力。

vFED方法在應用中遇到的主要困難是空心光斑圖像數(shù)n、 位移系數(shù)q和差值系數(shù)p三者間存在制約關系，而引起這一制約關系的根本因素是vFED方法受到的信噪比限制。為避免降低分辨率或引入較大的負值畸變，不宜選取過大的空心光斑圖像數(shù)n，這意味著部分邊緣通道包含的信息不會體現(xiàn)在空心光斑圖像中，從而一定程度上導致信噪比下降。然而，由于vFED方法比STED方法對樣品的損傷更小，因而其能夠容忍的激發(fā)光強適度提高，單點停留時間適當延長，從而可以對信噪比進行補償。此外，其他消除負值畸變的方法[15]也可用于vFED中，從而打破這一三角制約關系。

總體上說，vFED是一種對樣品高度普適、損傷低的超分辨方法，由于STED中損耗光不存在對激發(fā)光波長的制約，因此易于實現(xiàn)三色成像，為細胞器間的相互作用等研究提供強有力的研究工具。由于只需單次掃描即可成像，vFED系統(tǒng)成像速度較經(jīng)典FED系統(tǒng)提升了一倍。此外，vFED方法的去背景能力也使得系統(tǒng)更不易受到雜散光或使用低NA物鏡時出現(xiàn)的樣品離焦信息的干擾?？傊?，本文所搭建的三色虛擬熒光輻射差分顯微系統(tǒng)光路易于搭建和校準，對熒光染料普適性強。實驗結果表明：搭建的多色虛擬熒光輻射差分顯微成像系統(tǒng)在3個波長上都獲得了良好的成像效果，通過熒光顆粒和三色生物樣品的實驗驗證，本系統(tǒng)較1.2倍艾里斑針孔下的共聚焦實現(xiàn)了1.9倍的分辨率提升。實現(xiàn)了良好的成像效果，在細胞生命活動的研究中具有廣泛的應用前景。