SlCOMT1基因克隆及在番茄組織器官中的表達(dá)和褪黑素生物合成變化

葉欣悅， 閆見敏，2， 楊雪蓮， 李云洲，2， 須 文，2

(1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州貴陽 550025； 2.貴州大學(xué)蔬菜研究院，貴州貴陽 550025)

褪黑素(melatonin)化學(xué)名為N-乙?；?5-甲氧基色胺(N-acetyl-5-methoxytryptamine)，分子式為C13H16N2O2，相對(duì)分子質(zhì)量為232.27，是一種高度保守的小分子色氨酸吲哚類衍生化合物。由褪黑素及其代謝產(chǎn)物組成的持續(xù)性清除活性氧(ROS)或活性氮(RNS)的過程被稱為自由基清除級(jí)聯(lián)(free radical scavenging cascade)[1]。據(jù)估計(jì)，通過這種自由基級(jí)聯(lián)清除，1分子的褪黑素可以清除多達(dá)10個(gè)ROS或RNS分子，這使得褪黑素能夠在較低的劑量下也能夠有效保護(hù)生物免受氧化應(yīng)激[2-3]。研究表明，外源褪黑素的應(yīng)用可以減緩不同非生物脅迫誘導(dǎo)的衰老，因此也被稱為植物非生物脅迫的通用調(diào)節(jié)劑[4-6]。除此之外，褪黑素還作為一種多功能信號(hào)分子，參與植物晝夜節(jié)律[7]、外植體生長、開花[8]和種子萌發(fā)[9]等生理過程。

近年來，植物褪黑素合成途徑已被闡明。植物褪黑素的合成主要由6種不同的酶參與，包括色氨酸脫羧酶(tryptophan decarboxylase，簡稱TDC)、色氨酸羥化酶(tryptophan hydroxylase，簡稱TPH)、色胺5-羥化酶(tryptamine 5-hydroxylase，簡稱T5H)、血清素N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶(serotoninN-acetyltransferase，簡稱SNAT)、乙酰5-羥色胺甲基轉(zhuǎn)移酶(acetylserotonin methyl transferase，簡稱ASMT)、咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶 (caffeic acidO-methyltransferase，簡稱COMT)[8]。根據(jù)Byeon 等的研究[10]，COMT與ASMT同屬于O-甲基轉(zhuǎn)移酶家族，能夠甲基化苯丙烷類化合物、黃酮類化合物和生物堿，而能夠甲基化N-乙酰血清素的COMT則被重新命名為COMT1。過表達(dá)番茄咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因(SlCOMT1)提高了番茄內(nèi)源褪黑素的含量，并通過提高抗壞血酸(ASA)-谷胱甘肽(GSH)循環(huán)減輕多菌靈帶來的藥害[11]。而通過病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)技術(shù)沉默SlCOMT1基因減少了內(nèi)源褪黑素的含量，并加劇了番茄在高溫脅迫下誘導(dǎo)的衰老[12]。

番茄(Solanumlycopersicum)是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，同時(shí)也是茄科的模式作物。Micro-Tom作為一種小型栽培品種具有株型小和生長周期短等特點(diǎn)，被廣泛用作番茄研究的模式作物[13]。目前，關(guān)于SlCOMT1基因的研究主要集中在番茄栽培變種Ailsa Craig中[14]。本試驗(yàn)以研究較少的番茄品種Micro-Tom作為試驗(yàn)材料，通過設(shè)計(jì)特異性引物，克隆SlCOMT1基因。利用qRT-PCR技術(shù)和酶聯(lián)免疫法探討SlCOMT1基因在不同組織器官、不同生育時(shí)期的表達(dá)模式和褪黑素含量變化，以期為深入研究SlCOMT1基因的功能以及番茄的抗逆育種和栽培提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 番茄幼苗的培養(yǎng)

2021年9月，于貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院園藝系實(shí)驗(yàn)室將番茄(Lycopersiconesculentumvar. Micro-Tom)種子經(jīng)過50 ℃的無菌水溫湯浸種10 min后，在恒溫25 ℃的黑暗條件下進(jìn)行催芽。2 d后將萌發(fā)的種子置入裝滿基質(zhì)的50穴穴盤中，并置入培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)，2葉1心后將番茄幼苗移栽至10 cm寬的圓形營養(yǎng)缽中，并置于貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院園藝系溫室中，每5 d施用1次霍格蘭德營養(yǎng)液，培養(yǎng)室溫度為恒定25 ℃，光暗周期為16 h/8 h。

1.2 樣品的取樣分析

分別取4葉1心番茄幼苗的同一葉位的幼葉、成熟葉和衰老葉為待測葉片樣品；在花期分別取花苞、正在開放的花和開放后5 d衰老的花為待測花樣品；在結(jié)果期分別取綠熟期、破色期、紅熟期的番茄果實(shí)為待測果實(shí)樣品。所有樣品從正常生長的番茄植株上取下后迅速用液氮速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 番茄總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄

使用RNA提取試劑盒(DP432，北京天根)對(duì)番茄樣品進(jìn)行總RNA的提取，通過1%瓊脂糖凝膠電泳確定RNA質(zhì)量。使用cDNA第一鏈合成試劑盒(KR118，北京天根)完成RNA的逆轉(zhuǎn)錄。獲得的cDNA保存在-20 ℃的冰箱中待用。

1.4 SlCOMT1基因的克隆

從番茄基因組數(shù)據(jù)庫(https：//solgenomics.net/)中獲得SlCOMT1基因(Solyc03g080180)的蛋白質(zhì)編碼區(qū)(CDS)序列，通過Primer 5.0設(shè)計(jì)全長引物并使用Primer-BLAST進(jìn)行檢測引物特異性后交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以番茄葉片cDNA為模板，在BIO-RAD T100 Thermal Cycler平臺(tái)進(jìn)行RT-PCR克隆SlCOMT1基因序列，反應(yīng)總體系為20 μL，其中cDNA 2 μL，正、反引物各 0.5 μL，2×TaqPCR 10 μL，ddH2O 7 μL；PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離，回收所需的條帶并連接到pMD18-T克隆載體上交由北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序。SlCOMT1基因克隆所使用的引物見表1。

表1 本研究中使用的引物

1.5 SlCOMT1蛋白的生物信息學(xué)分析

通過番茄基因組數(shù)據(jù)庫(https：//solgenomics.net/)獲得SlCOMT1(Solyc03g080180.2.1)編碼的堿基序列和氨基酸序列；使用NCBI中的Batch CD-Search(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索COMT1蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域，擬南芥和西瓜的COMT1蛋白序列分別參考Byeon[10]、Chang等的序列[15]，經(jīng)過MUSLE多序列比對(duì)后使用Tbtools MSA trimmer修剪后進(jìn)行可視化；使用ExPASy(https：//web.expasy.org/)分析SlCOMT1蛋白的理化性質(zhì)；使用TMHMM 2.0(https：//services.healthtech.dtu.dk/)預(yù)測SlCOMT1蛋白的跨膜區(qū)域；使用NCBI的Protein BLAST工具尋找同源蛋白序列，通過ClustalW進(jìn)行多序列比對(duì)后使用MEGA(V.10.2.6) 采用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(bootstrap=1 000)；使用Plant-mPloc(http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/)預(yù)測亞細(xì)胞定位；用SOPMA(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/)和SWISS-MODEL(https：//swissmodel.expasy.org/)預(yù)測SlCOMT1的二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.6 番茄內(nèi)源性褪黑素含量的檢測

分別精確稱取0.3 g番茄各組織樣品，添加 3 mL 磷酸緩沖溶液，在冰上研磨成勻漿，3 000 r/min 離心10 min取上清液。按照植物褪黑素(MT)ELISA試劑盒(深圳子科生物科技有限公司)說明書上的方法檢測褪黑素含量，在多功能酶標(biāo)儀Multiskan FC(賽默飛世爾科技公司)測定 450 nm 波長下上清反應(yīng)液的吸光度，計(jì)算不同組織中內(nèi)源性褪黑素的含量，每個(gè)組織部位含3次生物學(xué)重復(fù)。結(jié)果通過DPS軟件采用最小顯著性差異(LSD)法檢驗(yàn)不同組織內(nèi)源性褪黑素含量的差異顯著性(α=0.05)。

1.7 SlCOMT1基因的表達(dá)模式分析

用qRT-PCR檢測SlCOMT1基因在不同組織的表達(dá)情況。以Actin(Solyc03g078400)為內(nèi)參基因，用SYBR-Green染料在FQD-96A(BIOER，杭州)平臺(tái)進(jìn)行qRT-PCR。體系及步驟參照周露等的方法[16]，用2-ΔΔCT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)倍數(shù)。每個(gè)處理3次生物學(xué)重復(fù)，每次生物學(xué)重復(fù)3次技術(shù)重復(fù)。結(jié)果通過DPS軟件用LSD法檢驗(yàn)不同組織或處理間SlCOMT1基因相對(duì)表達(dá)量的差異顯著性(α=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SlCOMT1基因克隆及序列分析

為了從番茄中獲得SlCOMT1基因，以成熟Micro-Tom番茄葉片的cDNA為模板，使用特異性的SlCOMT1引物(表1)進(jìn)行PCR，在1.2%的瓊脂糖凝膠上檢測到預(yù)期大小的條帶(圖1)，并對(duì)其進(jìn)行測序和特征分析。SlCOMT1基因全長為1 074 bp，編碼357個(gè)氨基酸。保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，與其他COMT1類似，番茄SlCOMT1蛋白序列在第28～79氨基酸和第134～338氨基酸處分別含有二聚化保守結(jié)構(gòu)域和甲基轉(zhuǎn)移酶2保守結(jié)構(gòu)域，屬于SAM(S-腺苷甲硫氨酸)依賴型甲基轉(zhuǎn)移酶超家族成員(圖2)，表明該基因在不同物種中較為保守。多序列比對(duì)結(jié)果(圖3)表明，番茄SlCOMT1的S-腺苷甲硫氨酸(SAM)結(jié)合位點(diǎn)、催化殘基和酚類底物結(jié)合位點(diǎn)，都顯示出較高保守性。根據(jù)ExPASy預(yù)測對(duì)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，SlCOMT1蛋白分子量為38.95 ku，結(jié)構(gòu)式為 C1 746H2 740N448O513S23，理論等電點(diǎn)(PI)為5.63，負(fù)電荷殘基(Asp+Glu)總數(shù)41個(gè)，正電荷殘基(Asp+Glu)總數(shù)33個(gè)。不穩(wěn)定系數(shù)為29.20，屬于穩(wěn)定蛋白。脂肪系數(shù)為88.26，表明SlCOMT1蛋白脂溶性很強(qiáng)。

2.2 SlCOMT1蛋白親水性分析

用ProtScale對(duì)SlCOMT1蛋白親水性預(yù)測結(jié)果(圖4)表明，SlCOMT1的親水性均值(GRAVY)為0.020，表明該蛋白為疏水性蛋白。其中，多肽鏈第120位的脯氨酸具有最高的疏水性(2.344)，第324位的精氨酸具有最高的親水性(-2.700)。

2.3 SlCOMT1跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過TMHMM 2.0對(duì)番茄SlCOMT1進(jìn)行蛋白質(zhì)跨膜區(qū)域預(yù)測，結(jié)果(圖5)表明SlCOMT1蛋白不含有跨膜區(qū)域，屬于非跨膜蛋白。

2.4 SlCOMT1蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測

使用NetPhos預(yù)測了SlCOMT1蛋白的磷酸化位點(diǎn)，結(jié)果(圖6)表明，SlCOMT1含有預(yù)測的磷酸化位點(diǎn)31個(gè)，其中絲氨酸磷酸化位點(diǎn)18個(gè)；蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)11個(gè)；酪氨酸磷酸化位點(diǎn)2個(gè)。

2.5 SlCOMT1亞細(xì)胞定位預(yù)測

使用Plant-mPloc預(yù)測SlCOMT1的亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明，SlCOMT1定位于葉綠體中。

2.6 SlCOMT1蛋白的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

使用SOPMA預(yù)測SlCOMT1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖7)，在SlCOMT1的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α螺旋占45.10%，無規(guī)則卷曲占32.77%，延展鏈占15.41%，β轉(zhuǎn)角占6.72%，推測SlCOMT1蛋白主要由α螺旋和無規(guī)則卷曲組成。使用SWISS-MODEL預(yù)測SlCOMT1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖8。

2.7 SlCOMT1的系統(tǒng)發(fā)育樹及保守基序分析

通過系統(tǒng)發(fā)育樹及MEME保守基序分析SlCOMT1，結(jié)果(圖9)表明，番茄SlCOMT1與同科的辣椒和馬鈴薯具有較高的親緣關(guān)系且具有相同的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)量。

2.8 SlCOMT1在番茄不同組織器官中的表達(dá)模式及褪黑素含量變化

采用qRT-PCR技術(shù)，筆者檢測了不同發(fā)育階段的番茄葉片、花和果實(shí)中SlCOMT1基因的相對(duì)表達(dá)量、內(nèi)源性褪黑素的含量。結(jié)果(圖10)表明，SlCOMT1基因在番茄幼葉、成熟葉、衰老葉、花苞、開放當(dāng)天的花、開放后5 d的花、綠熟果、破色期果實(shí)、紅熟果等不同組織器官中都有表達(dá)，而且表達(dá)量不同。在葉片和果實(shí)的不同發(fā)育階段，SlCOMT1的表達(dá)隨著葉片和果實(shí)器官的發(fā)育其相對(duì)表達(dá)量顯著降低。不同組織器官中內(nèi)源褪黑素的含量變化也表現(xiàn)出類似的變化趨勢，表明番茄葉片和果實(shí)中SlCOMT1基因的表達(dá)與內(nèi)源褪黑素的生物合成密切相關(guān)。而在花器官中，SlCOMT1的表達(dá)隨著花的發(fā)育呈現(xiàn)出先下調(diào)后上調(diào)的變化趨勢，并在衰老花(開放后5 d的花)中表達(dá)量最高。而衰老花的內(nèi)源褪黑素含量與其他時(shí)期的花之間沒有顯著差異，表明褪黑素在花發(fā)育進(jìn)程中發(fā)揮的功能可能有別于其他組織。

3 討論與結(jié)論

褪黑素是一種重要的信號(hào)分子，在植物響應(yīng)非生物和生物脅迫中具有多種生理功能[19]。番茄SlCOMT1是與擬南芥褪黑素合成相關(guān)的AtCOMT1核苷酸序列最相似的基因，通過過表達(dá)和基因沉默技術(shù)證明了SlCOMT1與番茄褪黑素合成有關(guān)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)SlCOMT1在Micro-Tom不同時(shí)期的組織器官中表達(dá)水平與內(nèi)源性褪黑素的含量存在一定的關(guān)聯(lián)，并在幼嫩組織中SlCOMT1的相對(duì)表達(dá)和褪黑素含量最高，這可能與SlCOMT1參與組織發(fā)育以及褪黑素的代謝水平有關(guān)，因?yàn)檫@些組織的代謝活動(dòng)較高。Okazaki 等采用酶聯(lián)免疫吸附劑測定(ELISA)方法[20]，在Micro-Tom所有器官中均檢測到褪黑素含量在1.5～66.6 ng/g之間，種子中褪黑素的含量最高，其次是發(fā)芽后生長4 d的幼苗，葉片中的含量高于花中的含量。Liu等采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法[14]檢測Ailsa Craig番茄中SlCOMT1的時(shí)空表達(dá)情況。結(jié)果表明，SlCOMT1在番茄的根、芽、葉、花、果實(shí)等組織中具有時(shí)空特異性，在這些組織中表達(dá)水平不同。在根中表達(dá)量最低，在果實(shí)中表達(dá)量最高，說明SlCOMT1可能參與了果實(shí)發(fā)育的調(diào)控。本研究結(jié)果是Micro-Tom正在開放的花和開放后5 d的花中褪黑素含量高于成熟葉片，紅熟果中的褪黑素含量顯著低于綠熟果，這與Liu等的研究結(jié)果[14，19]不太一致，這可能與分析的樣品、植株生長發(fā)育的狀態(tài)不同有關(guān)。Okazaki等的研究是取包括花苞到開放了的花，也就是全部花的混合樣品進(jìn)行分析；他們對(duì)不同成熟階段的果實(shí)褪黑素含量分析結(jié)果表明，進(jìn)入綠熟階段后，隨著果實(shí)的進(jìn)一步成熟，果實(shí)中褪黑素含量有所增加，但是差異并不顯著[19]。Liu等沒有對(duì)SlCOMT1的表達(dá)量進(jìn)行差異顯著性分析[14]。本研究和Okazaki等的研究[19]一致表明在番茄葉、花、果實(shí)中均檢測到褪黑素，且褪黑素在幼葉中的積累量高于成熟葉，并和Liu等的研究[14]一致表明，褪黑素在番茄花中的積累量高于葉片。褪黑素的濃度因番茄發(fā)育階段的不同而不同，表明褪黑素在番茄發(fā)育過程中起著作用，可能參與番茄成熟的一些過程。

番茄SlCOMT1蛋白具有SAM(S-腺苷甲硫氨酸)依賴型甲基轉(zhuǎn)移酶超家族典型的保守結(jié)構(gòu)域，不含跨膜結(jié)構(gòu)，是一種穩(wěn)定的高脂溶性蛋白。SlCOMT1基因及褪黑素在矮生型番茄Micro-Tom的葉片、花、果實(shí)等不同組織器官中都有表達(dá)和積累，SlCOMT1的表達(dá)和內(nèi)源褪黑素生物合成在番茄不同發(fā)育時(shí)期的葉片和果實(shí)之間存在一定的相關(guān)性，并在幼嫩組織中檢測到SlCOMT1較高表達(dá)和褪黑素積累，這可能與SlCOMT1參與組織發(fā)育以及褪黑素的代謝水平有關(guān)，SlCOMT1在花發(fā)育過程中的生物學(xué)功能將是進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。