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      黃酒釀造中氨基甲酸乙酯控制關(guān)鍵技術(shù)研究

      2023-01-11 01:54:07張群
      關(guān)鍵詞:鳥氨酸黃酒乙酯

      黃酒是中國(guó)最古老的酒種,被列入重點(diǎn)扶植和發(fā)展的酒精飲品之一。 但黃酒的傳統(tǒng)釀造采用多菌種、邊糖化邊發(fā)酵的工藝,除了產(chǎn)生乙醇、功能寡肽和大量各類香氣物質(zhì)外,還可能會(huì)產(chǎn)生或不慎引入一些不利于人體健康的物質(zhì),主要包括氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate,EC)、甲醛、生物胺和黃曲霉毒素等。

      近年來(lái),江南大學(xué)、浙江大學(xué)等科研人員針對(duì)黃酒釀造中可能產(chǎn)生的氨基甲酸乙酯危害物,深入研究其生成積累規(guī)律與阻斷機(jī)制、功能菌株與酶制劑篩選、全過(guò)程減控工藝優(yōu)化與控制技術(shù)集成、檢測(cè)方法等,為黃酒產(chǎn)業(yè)安全生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。程艷等(2017)以一株黃酒生產(chǎn)工業(yè)菌株釀酒酵母XZ-11 為研究對(duì)象,采用ARTP 誘變和高通量篩選策略,獲得尿素積累量較低菌株,使用實(shí)時(shí)定量PCR 技術(shù)檢測(cè)氮代謝中尿素代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因(DUR1,2 和DUR3)的變化,篩選得到一株尿素高效穩(wěn)定性利用菌株5-11C,其尿素積累量比釀酒酵母XZ-11 降低了50.6%, 實(shí)時(shí)定量熒光PCR 結(jié)果表明, 與尿素代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因(DUR1,2 和DUR3)表達(dá)量分別提高了3.3 倍和2.2 倍。 方若思等(2021)研究添加鳥氨酸氨甲?;D(zhuǎn)移酶對(duì)氨基甲酸乙酯及黃酒基礎(chǔ)品質(zhì)的影響, 其采用基因工程手段從短乳桿菌中克隆并大量表達(dá)鳥氨酸氨甲?;D(zhuǎn)移酶,經(jīng)Ni-NTA 瓊脂糖純化樹脂純化后添加到黃酒發(fā)酵的不同階段。結(jié)果表明:在發(fā)酵中期添加的鳥氨酸氨甲?;D(zhuǎn)移酶能顯著降低氨基甲酸乙酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù),最高可降低至原質(zhì)量分?jǐn)?shù)的15%,且對(duì)其主要前體物——尿素和瓜氨酸均有影響,同時(shí)檢測(cè)黃酒的理化品質(zhì),結(jié)果表明游離氨基酸、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及味覺(jué)特性差異不顯著, 說(shuō)明添加鳥氨酸氨甲?;D(zhuǎn)移酶未對(duì)產(chǎn)品性質(zhì)產(chǎn)生影響。 中國(guó)專利CN202010922066.1 公開了一種降低黃酒中氨基甲酸乙酯含量的方法, 其提供了一種低產(chǎn)尿素和氨基甲酸乙酯的重組釀酒酵母S. cerevisiae NaDUR1,2/DUR3-Δcar1,此重組釀酒酵母以釀酒酵母Na 為宿主,敲除編碼精氨酸酶的基因CAR1, 并且, 高效表達(dá)編碼脲基酰胺酶的基因DUR1,2 和編碼尿素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因DUR3;使用此重組釀酒酵母生產(chǎn)得到黃酒發(fā)酵液中,尿素的質(zhì)量濃度低至3.0 mg/L,分別較釀酒酵母Na 和出發(fā)菌株S. cerevisiae NaDUR1,2-Δcar1 降低了92.1%和43.4%。 CN201911019263.6 公開一種降低黃酒釀造過(guò)程中尿素和氨基甲酸乙酯含量的方法, 向黃酒釀造體系中添加酒糟谷蛋白進(jìn)行發(fā)酵, 以原料米質(zhì)量計(jì),酒糟谷蛋白添加量為0.5~8 g/hg,通過(guò)調(diào)控釀酒過(guò)程中酵母可利用的氮源組成,有效地抑制尿素循環(huán),減少精氨酸的降解,從而減少EC 的形成。 CN201510812131.4 公開了一種可降低黃酒發(fā)酵中氨基甲酸乙酯積累的方法, 其使用氮代謝物阻遏效應(yīng)調(diào)控因子改造了的基因工程菌, 其中酵母工程菌消除了調(diào)控因子Gln3p 和Gat1p 的核定位調(diào)控序列并突變了核定位序列上的磷酸化位點(diǎn)。 在模擬的黃酒發(fā)酵體系中,基因工程菌發(fā)酵的黃酒中的尿素和氨基甲酸乙酯的含量分別下降了63%和72%, 其中氨基甲酸乙酯質(zhì)量濃度已經(jīng)降至55.53 μg/L,同時(shí)主要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和特征性風(fēng)味物質(zhì)的含量差異很小。 CN201210125030.6 公開了一種黃酒用氨基甲酸乙酯降解酶產(chǎn)生菌,該發(fā)明菌株分類命名為變幻青霉(Penicillium variabile)JN-A525,已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,保藏編號(hào):CGMCCNo.5763。 該菌株的擴(kuò)增ITS區(qū)全序列其氨基酸序列為SEQIDNO:1。 該菌所產(chǎn)的EC 降解酶,最適pH 相對(duì)較寬為4.0~6.0,最適溫度為50 ℃,該菌產(chǎn)生的酶在模擬黃酒(乙醇15%,EC 3%,pH 4.4)條件下對(duì)氨基甲酸乙酯(EC)有相對(duì)較強(qiáng)的水解能力, 所產(chǎn)EC 降解酶有在清酒、 黃酒、 米酒等發(fā)酵食品中去除已產(chǎn)生的微量EC 與MC 的應(yīng)用潛力。CN201510218597.1 公開了一種降解尿素和氨基甲酸乙酯的耐乙醇雙功能酶及其應(yīng)用, 該酶是來(lái)自于地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis 9945A)的脲酶,能夠耐受高濃度乙醇的同時(shí)高效降解氨基甲酸乙酯。 該發(fā)明利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)BL21(DE3)/pRSFDuet-1,成功實(shí)現(xiàn)了具有EC 水解酶活力的脲酶基因的高效表達(dá),以EC 為底物時(shí)酶活達(dá)到2.93 U/mL,以尿素為底物時(shí)酶活達(dá)到5.81 U/mL。重組酶在體積分?jǐn)?shù)20%的乙醇中37 ℃保留4 h,以EC 為底物時(shí)仍可保留其50%以上的活性。

      黃酒中EC 的研究已取得一系列成果, 但如何在不影響黃酒品質(zhì)的條件下, 高效經(jīng)濟(jì)地控制并去除EC,實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用,提高我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品行業(yè)核心競(jìng)爭(zhēng)力與國(guó)際影響力,是行業(yè)人員今后研究的重點(diǎn)方向。

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