黃酒釀造中氨基甲酸乙酯控制關(guān)鍵技術(shù)研究

黃酒是中國(guó)最古老的酒種，被列入重點(diǎn)扶植和發(fā)展的酒精飲品之一。 但黃酒的傳統(tǒng)釀造采用多菌種、邊糖化邊發(fā)酵的工藝，除了產(chǎn)生乙醇、功能寡肽和大量各類香氣物質(zhì)外，還可能會(huì)產(chǎn)生或不慎引入一些不利于人體健康的物質(zhì)，主要包括氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，EC)、甲醛、生物胺和黃曲霉毒素等。

近年來(lái)，江南大學(xué)、浙江大學(xué)等科研人員針對(duì)黃酒釀造中可能產(chǎn)生的氨基甲酸乙酯危害物，深入研究其生成積累規(guī)律與阻斷機(jī)制、功能菌株與酶制劑篩選、全過(guò)程減控工藝優(yōu)化與控制技術(shù)集成、檢測(cè)方法等，為黃酒產(chǎn)業(yè)安全生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。程艷等（2017）以一株黃酒生產(chǎn)工業(yè)菌株釀酒酵母XZ-11 為研究對(duì)象，采用ARTP 誘變和高通量篩選策略，獲得尿素積累量較低菌株，使用實(shí)時(shí)定量PCR 技術(shù)檢測(cè)氮代謝中尿素代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因(DUR1,2 和DUR3)的變化，篩選得到一株尿素高效穩(wěn)定性利用菌株5-11C，其尿素積累量比釀酒酵母XZ-11 降低了50.6%， 實(shí)時(shí)定量熒光PCR 結(jié)果表明， 與尿素代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因(DUR1,2 和DUR3)表達(dá)量分別提高了3.3 倍和2.2 倍。 方若思等（2021）研究添加鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶對(duì)氨基甲酸乙酯及黃酒基礎(chǔ)品質(zhì)的影響， 其采用基因工程手段從短乳桿菌中克隆并大量表達(dá)鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶，經(jīng)Ni-NTA 瓊脂糖純化樹脂純化后添加到黃酒發(fā)酵的不同階段。結(jié)果表明：在發(fā)酵中期添加的鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶能顯著降低氨基甲酸乙酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，最高可降低至原質(zhì)量分?jǐn)?shù)的15%，且對(duì)其主要前體物——尿素和瓜氨酸均有影響，同時(shí)檢測(cè)黃酒的理化品質(zhì)，結(jié)果表明游離氨基酸、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及味覺(jué)特性差異不顯著， 說(shuō)明添加鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶未對(duì)產(chǎn)品性質(zhì)產(chǎn)生影響。 中國(guó)專利CN202010922066.1 公開了一種降低黃酒中氨基甲酸乙酯含量的方法， 其提供了一種低產(chǎn)尿素和氨基甲酸乙酯的重組釀酒酵母S. cerevisiae NaDUR1,2/DUR3-Δcar1，此重組釀酒酵母以釀酒酵母Na 為宿主，敲除編碼精氨酸酶的基因CAR1， 并且， 高效表達(dá)編碼脲基酰胺酶的基因DUR1,2 和編碼尿素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因DUR3；使用此重組釀酒酵母生產(chǎn)得到黃酒發(fā)酵液中，尿素的質(zhì)量濃度低至3.0 mg/L，分別較釀酒酵母Na 和出發(fā)菌株S. cerevisiae NaDUR1,2-Δcar1 降低了92.1%和43.4%。 CN201911019263.6 公開一種降低黃酒釀造過(guò)程中尿素和氨基甲酸乙酯含量的方法， 向黃酒釀造體系中添加酒糟谷蛋白進(jìn)行發(fā)酵， 以原料米質(zhì)量計(jì)，酒糟谷蛋白添加量為0.5~8 g/hg，通過(guò)調(diào)控釀酒過(guò)程中酵母可利用的氮源組成，有效地抑制尿素循環(huán)，減少精氨酸的降解，從而減少EC 的形成。 CN201510812131.4 公開了一種可降低黃酒發(fā)酵中氨基甲酸乙酯積累的方法， 其使用氮代謝物阻遏效應(yīng)調(diào)控因子改造了的基因工程菌， 其中酵母工程菌消除了調(diào)控因子Gln3p 和Gat1p 的核定位調(diào)控序列并突變了核定位序列上的磷酸化位點(diǎn)。 在模擬的黃酒發(fā)酵體系中，基因工程菌發(fā)酵的黃酒中的尿素和氨基甲酸乙酯的含量分別下降了63%和72%， 其中氨基甲酸乙酯質(zhì)量濃度已經(jīng)降至55.53 μg/L，同時(shí)主要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和特征性風(fēng)味物質(zhì)的含量差異很小。 CN201210125030.6 公開了一種黃酒用氨基甲酸乙酯降解酶產(chǎn)生菌，該發(fā)明菌株分類命名為變幻青霉（Penicillium variabile）JN-A525，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)：CGMCCNo.5763。 該菌株的擴(kuò)增ITS區(qū)全序列其氨基酸序列為SEQIDNO:1。 該菌所產(chǎn)的EC 降解酶，最適pH 相對(duì)較寬為4.0~6.0，最適溫度為50 ℃，該菌產(chǎn)生的酶在模擬黃酒（乙醇15%，EC 3%，pH 4.4）條件下對(duì)氨基甲酸乙酯（EC）有相對(duì)較強(qiáng)的水解能力， 所產(chǎn)EC 降解酶有在清酒、 黃酒、 米酒等發(fā)酵食品中去除已產(chǎn)生的微量EC 與MC 的應(yīng)用潛力。CN201510218597.1 公開了一種降解尿素和氨基甲酸乙酯的耐乙醇雙功能酶及其應(yīng)用， 該酶是來(lái)自于地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis 9945A)的脲酶，能夠耐受高濃度乙醇的同時(shí)高效降解氨基甲酸乙酯。 該發(fā)明利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)BL21(DE3)/pRSFDuet-1，成功實(shí)現(xiàn)了具有EC 水解酶活力的脲酶基因的高效表達(dá)，以EC 為底物時(shí)酶活達(dá)到2.93 U/mL，以尿素為底物時(shí)酶活達(dá)到5.81 U/mL。重組酶在體積分?jǐn)?shù)20%的乙醇中37 ℃保留4 h，以EC 為底物時(shí)仍可保留其50%以上的活性。

黃酒中EC 的研究已取得一系列成果， 但如何在不影響黃酒品質(zhì)的條件下， 高效經(jīng)濟(jì)地控制并去除EC，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用，提高我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品行業(yè)核心競(jìng)爭(zhēng)力與國(guó)際影響力，是行業(yè)人員今后研究的重點(diǎn)方向。