吳 珊，周海金，徐廣賢*

(1. 西安市人民醫(yī)院(西安市第四醫(yī)院)檢驗科，陜西 西安 710000；2. 廣東醫(yī)科大學 醫(yī)學技術學院醫(yī)學檢驗系，廣東 東莞 523000)

結核病是機體感染結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,Mtb)后發(fā)生的一種慢性傳染病，嚴重危害人類健康，據2019年世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計，全球估算結核病死亡數約為140×104個，是單一病菌感染致死率最高的傳染病之一[1]。牛結核分枝桿菌引起的牛結核病是一種全年都可能發(fā)生的慢性人畜共患病，不僅影響牛的健康和農場的經濟效益, 還影響?zhàn)B牛人員的身體健康及牛奶、牛肉等相關食品的質量安全[2]。結核病潛伏期較長，目前尚缺乏特效的治療方法。結核病的難以治療和根除障礙與Mtb在宿主細胞內生活方式復雜多變密切有關，因而探索Mtb病原體-宿主細胞之間的相互作用，對結核病的診療有重要指導作用。

自噬(Autophagy)是細胞內的一種“自食(Self-eating)”現象，是普遍存在于真核細胞中的一種高度保守的代謝過程，也是細胞內物質降解的主要途徑[3]。泛素介導的異種吞噬是一種選擇性自噬，在宿主防御包括結核分枝桿菌(Mtb)在內的細胞內病原體中具有至關重要的作用[4]。然而，宿主泛素靶標侵入微生物引發(fā)異種吞噬的確切機制仍不清楚。Chai等[5]研究發(fā)現泛素可以識別Mtb表面蛋白PE_PGRS29，這是一種以前未發(fā)現的泛素結合蛋白，含有真核生物樣泛素化相關(UBA)結構域，UBA介導的泛素可與PE_PGRS29直接結合，隨后招募自噬受體p62將分枝桿菌遞送至LC3相關的自噬體，PE_PGRS29-泛素相互作用的破壞減弱了巨噬細胞中Mtb的異種吞噬清除，并增加了炎癥反應升高小鼠的細菌負荷。作為新發(fā)現的泛素結合蛋白，其生物學功能及可能存在蛋白與蛋白之間相互作用的網絡尚未完全清楚。本試驗采用生物信息學分析方法對PE_PGRS29蛋白的結構和功能進行預測分析[6-9]，為進一步了解泛素靶標入侵微生物引發(fā)異種吞噬的作用和調節(jié)機制提供理論依據，有助于更好的預防和控制結核病。

1 材料與方法

1.1 材料

Mtb H37Rv株全基因組，從美國國立生物技術信息中心(NCBI)GenBank數據庫獲取PE_PGRS29蛋白的基因序列及氨基酸序列等信息。PE_PGRS29蛋白的Gene ID為886556，基因組序列為NC_000962.3，蛋白序列為YP_177814.1。

1.2 方法

1.2.1 PE_PGRS29基本信息及序列分析 在NCBI中獲取PE_PGRS29蛋白的基因序列，通過ORF Finder分析其開放閱讀框。

1.2.2 PE_PGRS29蛋白基本理化性質分析 PE_PGRS29蛋白的理化特性如分子式、分子質量、等電點、不穩(wěn)定指數等通過Expasy提供的在線軟件Protparam進行預測分析。

1.2.3 PE_PGRS29蛋白的親疏水性、跨膜結構、信號肽、結構域及磷酸化位點分析 蛋白質的折疊情況可由氨基酸的親疏水性來反映，疏水區(qū)可能出現潛在的跨膜結構區(qū)[10]。蛋白的親疏水性和跨膜區(qū)域分別用ProtScale和TMHMM Server v.2.0在線分析軟件分析；利用信號肽服務器SignalP 4.0預測PE_PGRS29蛋白的信號肽的有無及數量；用NetPhos 3.1 Server預測蛋白的磷酸化位點。

1.2.4 PE_PGRS29蛋白二級結構分析與三級結構建模 用SOPMA預測分析PE_PGRS29蛋白的二級結構，然后在SWISS-MODEL軟件中輸入蛋白的氨基酸序列，建立PE_PGRS29蛋白的三級結構模型。

1.2.5 PE_PGRS29蛋白的B細胞抗原表位分析 登錄IEDB網站，輸入該蛋白的氨基酸序列，通過 Karplus & Schulz分析柔韌性、Kolaskar8. Tongaonkar預測抗原性、Emini預測抗原表面可及性、Parker預測親水性及Chou & Fasman法預測氨基酸編碼蛋白質的β轉角[8]，聯(lián)合對B細胞抗原表位進行分析。

1.2.6 PE_PGRS29蛋白的Th細胞抗原表位分析 通過SYFPEITHI和RANKPEP對PE_PGRS29抗原蛋白Th表位進行綜合預測。進入SYFPEITHI首頁，選擇HLA-DRE1*0101、0401、0701、0801、0901、1101、1501這7種HLA基因分型并選取得分>18分的氨基酸序列進行輔助T細胞表位預測分析；進入RANKPEP主頁,選擇SYFPEITHI所預測的HLA基因分型,找出紅色標記的結果,確定SYFPEITHI和RANKPEP的綜合預測結果,篩選出分析結果均較好的輔助T細胞表位。

1.2.7 PE_PGRS29蛋白的細胞毒性T淋巴細胞抗原表位分析 通過SYFPEITHI、NetMHCpan對PE_PGRS29抗原蛋白的細胞毒性T淋巴細胞表位進行綜合預測。

1.2.8 PE_PGRS29蛋白的相互作用網絡 與PE_PGRS29蛋白相互作用的其他蛋白信息使用STRING數據庫進行檢索。

1.2.9 PE_PGRS29蛋白與人類蛋白同源性分析 使用EXPASY對PE_PGRS29蛋白氨基酸序列與人類蛋白的同源性進行BLAST分析。

1.2.10 PE_PGRS29蛋白的同源性預測和進化樹構建 運用在線 uniprot蛋白數據庫的Blast工具，將PE_PGRS29基因序列與同源性較高的核苷酸進行比，并用MEGA-X軟件構建進化樹。

2 結果與分析

2.1 PE_PGRS29蛋白的基因基本信息及序列分析

Rv1468c基因(ID：886556)位于Mtb(H37Rv)的全基因組(NC_000962.3)1 655 609～1 656 721區(qū)域，全長1 113 bp。PE_PGRS29蛋白在NCBI GenBank數據庫中氨基酸序列的登錄號為YP_177814.1，由370個氨基酸構成,包含18種氨基酸，其中以甘氨酸(34.6%)、丙氨酸(19.2%)、天冬氨酸(7.0%)、絲氨酸(5.7%)的組成比例較高。經ORF Finder工具分析，PE_PGRS29蛋白含有5個開放閱讀框，最長的一個開放閱讀框顯示PE_PGRS29基因被通讀，全長1 113 bp(圖1)。

圖1 PE_PGRS29蛋白的開放閱讀框分析Fig.1 Open reading box analysis of the PE_PGRS29 protein

2.2 PE_PGRS29蛋白基本理化性質

PE_PGRS29蛋白分子式為C1375H2111N431 O465S3，原子總數為4 385，相對分子質量為322.1567×103，消光系數為9 970，280 nm處的吸光度為0.309，脂肪族氨基酸指數為66.81。PE_PGRS29蛋白帶負電荷的殘基(Asp+Glu)12個，帶正電荷的殘基(Arg+Lys)5個,其理論等電點pI為4.66。PE_PGRS29蛋白的不穩(wěn)定性指數為15.60，提示該蛋白為穩(wěn)定蛋白。

2.3 PE_PGRS29蛋白的親疏水性、跨膜結構、信號肽、保守域及磷酸化位點

ProtScale預測PE_PGRS29蛋白為親水性蛋白，第331位氨基酸親水性得分最高為-1.533，第51為氨基酸疏水性得分最高為2.378(圖2)。PE_PGRS29蛋白信號肽的分析結果顯示(圖3)，標準值D值為0.166，小于閾值0.450，C、S、Y評分均在閾值之下，推測PE_PGRS29蛋白無信號肽。應用TMHMM分析該蛋白的跨膜結構(圖4)，其370個氨基酸殘基跨膜概率值均未突破閾值線(圖4粉色橫線)，表明該蛋白1～370位氨基酸序列均屬于膜外側(outside)，不存在跨膜螺旋(TMhelix)，預測該蛋白位于Mtb細胞壁和細胞膜上。用NCBI數據庫BLAST軟件分析顯示(圖5)，PE_PGRS29蛋白有1個結構域，屬于PE蛋白超家族。用NetPhos 3.1 Server軟件分析顯示(圖6)，PE_PGRS29蛋白含有10個絲氨酸磷酸化位點，2個蘇氨酸磷酸化位點和1個酪氨酸磷酸化位點。

圖2 PE_PGRS29蛋白的親(疏)水性分析Fig. 2 Hydrophilic (hydrophobic) analysis ofPE_PGRS29 protein

圖3 PE_PGRS29蛋白信號肽預測Fig. 3 PE_PGRS29 protein signaling peptide prediction

圖4 TMHMM Server, v. 2.0預測PE_PGRS29蛋白跨膜螺旋Fig. 4 TMHMM Server, v. 2.0 predicts PE_PGRS29 protein transmembrane helix

圖5 NCBI BLAST預測PE_PGRS29蛋白結構域Fig. 5 NCBI BLAST predicts the PE_PGRS29 protein domain

圖6 NetPhos 3.1 預測PE_PGRS29蛋白磷酸化位點Fig. 6 NetPhos 3.1 predicts the phosphorylation sites of the PE_PGRS29 protein

2.4 PE_PGRS29蛋白二級結構分析與三級結構建模

通過SOPMA預測PE_PGRS29蛋白的二級結構，α-螺旋(Hh)81個，占21.89%；β-轉角 (Tt)39個，占10.54%；β-折疊(Ee)81個，占21.89%；無規(guī)則卷曲(Cc)169個，占45.68%(圖7)。PE_PGRS29蛋白的三級結構模型通過SWISS MODEL蛋白質分析軟件進行構建，結果見圖8。

圖7 PE_PGRS29蛋白二級結構預測A.二級結構柱狀圖；B.二級結構序列圖；C.二級結構峰圖Fig. 7 Prediction of secondary structure of PE_PGRS29 proteinA. Bar chart of secondary structure; B. Secondary structure sequence diagram; C. Secondary structure peak map

圖8 PE_PGRS29蛋白三級結構同源建模Fig. 8 Homologous modeling of the tertiarystructure of PE_PGRS29 protein

2.5 PE_PGRS29蛋白的B細胞抗原表位預測

PE_PGRS29蛋白的B細胞抗原表位通過IDB軟件進行預測,柔韌性參數以基線1.018為參照，大于1.018的氨基酸區(qū)段柔韌性強,柔韌性越強越有利與抗體結合,是易形成抗原表位的區(qū)域。另外，結合線性表位、β轉角、可塑性、表面可及性、親疏水性、抗原等6個方面(圖9)來篩選B細胞的抗原表位，結果見表1。

圖9 IEDB預測PE_PGRS29蛋白的B細胞表位A. 線性表位預測; B. β轉角預測; C. 可塑性預測; D. 表面可及性預測; E. 親疏水性預測; F. 抗原預測Fig.9 Predicrion of B cell epitopes of Rv1733e protein in IEDBA. Linear epitope prediction; B. β-rotation angle prediction; C. Plasticity prediction;D. Surface accessibility prediction; E. Hydrophlicity prediction; F Antigenicity prediction

2.6 PE_PGRS29蛋白的Th細胞抗原表位

在線預測PE_PGRS29蛋白的限制性Th細胞表位,其中HLA-DRBI*0101、HLA-DRB1*0401表型具有最多的表位;潛在的限制性Th細胞抗原表位結果見表2。對該2種方法預測分值較高的表位作進一步統(tǒng)計分析，DRBl*0801和DRBl*0901表型的表位數量少。在分析 SYFPEITH和 RANKPEI的預測結果后,對于某個表型分值均較高的氨基酸序列進行篩選,以作為候選Th表位，結果見表3。HLA-DRB*0101、0401亞型的共同表位分布在59～66位,HLADRBl*0101、0401和1101亞型的共同表位分布在59～62位。

表1 PE_PGRS29蛋白B細胞抗原表位預測結果Table 1 Epitope prediction of PE_PGRS29 protein B cell

表2 不同軟件預測的PE_PGRS29蛋白Th細胞表位信息Table 2 Epitope information of PE_PGRS29 protein Th cell predicted by different software

表3 PE_PGRS29蛋白Th細胞表位綜合分析Table 3 Comprehensive analysis of Th cell epitopes of PE_PGRS29 protein

2.7 PE_PGRS29蛋白的細胞毒性T淋巴細胞抗原表位預測

限制性CTL表位HLA-A2、HLA-A3和HLA-B7的預測結果見表4。HLA表型進行預測的分值較高的潛在CTL表位數目及選擇出每一種表型分值均較高的多肽序列,可成為CTL候選表位,其結果見表5。

表4 不同軟件預測的PE_PGRS29蛋白CTL細胞表位信息Table 4 Cell epitope information of PE_PGRS29 protein predicted

表5 PE_PGRS29蛋白CTL表位綜合分析Table 5 Comprehensive analysis of PE_PGRS29 protein CTL epitopes

2.8 PE_PGRS29蛋白的相互作用蛋白

經STRING數據庫預測PE_PGRS29蛋白與ctpD(可能輸出鈷/鎳的p型ATP酶;參與重金屬穩(wěn)態(tài),屬于陽離子轉運ATP酶)、Rv1745c、fadE15(?；o酶a脫氫酶)、mmpS1、Rv3096(假設蛋白質)、trxB1(硫氧還原蛋白)、Rv1682、Rv3732和trxA等蛋白發(fā)生相互作用(圖10)。

圖10 PE_PGRS29蛋白的相互作用網絡Fig.10 The interaction network of PE_PGRS29 protein

2.9 PE_PGRS29蛋白的同源性預測和進化樹構建

經氨基酸序列比對,結核分枝桿菌(M.H37Ra)、結核分枝桿菌(M.H37Rv)、減毒牛型結核桿菌(M. bovis BCG)、結核分枝桿菌變種牛卡介苗(M.variant bovis BCG )、orygis 分枝桿菌(M. orygis)、卡內蒂分枝桿菌(M. canettii)、變種非洲K85結核分枝桿菌(M. tuberculosis variant africanum K85)、變種鰭足類結核分枝桿菌(M. tuberculosis variant pinnipedii)、decipiens分枝桿菌(M. decipiens)的序列覆蓋區(qū)域分別是100%、100%、100%、100%、100%、99.7%、99.6%、99.5%、72.6%。PE_PGRS29蛋白與以上物種的氨基酸序列相似度較高(圖11)。用MEGA-X軟件構建系統(tǒng)進化樹，PE_PGRS29蛋白在結核分支桿菌屬同源性較高(圖12)。

圖11 PE_PGRS29多序列比對分析Fig.11 Sequence alignment of PE_PGRS29

圖12 PE_PGRS29進化樹Fig.12 Evolutionary tree of PE_PGRS29

3 討 論

1998年，法國Pasteur和英國Sanger研究所對結核分枝桿菌進行了全基因組測序，因此一大類富含甘氨酸、N端有保守脯氨酸-谷氨酸序列(Proline-Glutamate，PE)的蛋白被發(fā)現，并被命名為PE蛋白家族，約占全部編碼基因的6%[11]。隨后，根據編碼蛋白質C端含有串聯(lián)重復序列的不同，PE蛋白家族進一步分為單獨PE(PE_only)和PE_PGRS兩個相近亞家族。PE_PGRS家族因C端編碼基因富含鳥嘌呤-胞嘧啶基序(polymorphic guanine-cytosine rich sequences，PGRS)而得名，是Mtb獨有的多基因亞家族，只存在于分枝桿菌屬，且絕大多數僅存在于致病性結核分枝桿菌中，與免疫逃逸和抗原變異密切相關[12]，近年來成為開發(fā)新藥物、研制疫苗和診斷試劑特異性靶點的熱點之一[13-14]。

PE_PGRS家族蛋白是由一組約104～1 901個氨基酸構成的酸性蛋白，參與構成Mtb的表面抗原成分，主要位于細胞壁和細胞膜上，與分枝桿菌的致病性與毒力息息相關[15]。PE_PGRS29作為該蛋白家族的一員，經預測分析，PE_PGRS29蛋白為親水性蛋白，無信號肽，不存在跨膜螺旋，且該蛋白具有多個T、B細胞抗原表位，佐證了該蛋白位于Mtb胞膜上，參與機體對結核分枝桿菌免疫反應。

基因序列和ORF分析結果顯示，PE-PGRS29基因編碼的蛋白由370個氨基酸構成，包含18種氨基酸，其中以甘氨酸(34.6%)、丙氨酸(19.2%)、天冬氨酸(7.0%)、絲氨酸(5.7%)的組成比例較高。PGRS結構域的特征性標志是包含大量甘氨酸和丙氨酸重復序列，通常以Gly-Gly-Ala或Gly-Gly-X(X為任意氨基酸)形式存在[12]。大量甘氨酸的GGXGXD/NXUX(U指非極性或疏水性大殘基)非肽序列(nonapeptide sequence)形成一個平行β滾筒或平行β螺旋結構，可與Ca2+連接，大量Ca2+與PE_PGRS蛋白結合，從而導致巨噬細胞中Ca2+濃度顯著下降，吞噬溶酶體的程度受到抑制，則巨噬細胞內的結核分枝桿菌無法被溶酶體及時清除，造成持續(xù)的慢性感染[16-17]。因此，控制巨噬細胞中Ca2+濃度或抑制Ca2+與PE_PGRS蛋白結合，可能有助于結核分枝桿菌的免疫調控。

理化性質分析顯示PE_PGRS29蛋白帶負電荷的殘基(Asp+Glu)總數為12，帶正電荷的殘基(Arg+Lys)總數為5，該蛋白的理論等電點pI為4.66，消光系數為9 970，280 nm處的吸光度為0.309。預測分析PE_PGRS29蛋白不穩(wěn)定性指數為15.60，表明該蛋白為穩(wěn)定蛋白。PE_PGRS29蛋白的二級結構分析顯示無規(guī)則卷曲(Cc)169個，占45.68%，而酶活性部位和其他蛋白質特異的功能部位經常由這類有序的非重復性結構構成，BLAST軟件分析證實PE_PGRS29蛋白含有1個結構域。Chai等[5]研究表明，PE_PGRS29蛋白含有真核生物樣泛素化相關(UBA)結構域，UBA介導的泛素與PE_PGRS29的直接結合，招募自噬受體p62將分枝桿菌遞送至LC3相關的自噬體，完成巨噬細胞中Mtb的異種清除。Bachhawat[18]研究發(fā)現，PE_PGRS蛋白中PE結構域普遍存在保守的DEVS(1個保守的四肽基序DEVS或DXXS，X為任意氨基酸)，與蛋白caspase-3的識別位點DEVD/E基序高度相似，caspase-3蛋白可競爭性與磷酸化后的絲氨酸殘基結合，抑制細胞凋亡，有助于逃避宿主細胞的免疫反應。預測分析PE_PGRS29蛋白含有10個絲氨酸磷酸化位點，表明PE_PGRS29蛋白可能參與這一抑制凋亡途徑。本研究構建了PE_PGRS29蛋白的進化樹以及多序列比對，發(fā)現PE_PGRS29蛋白與人類基因并無同源性，但在結核分枝桿菌菌屬中同源性極高，保守性很強，含有多個T、B細胞抗原表位，提示PE_PGRS29蛋白可作為結核病治療的潛在分子靶點以及對結核病新型候選疫苗有一定的參考價值。

結核分枝桿菌引起被感染的機體細胞自噬是降解細菌的重要過程，然而引發(fā)異種自噬的確切機制仍不清楚。本研究對PE_PGRS29蛋白進行了生物信息學分析，可為進一步研究PE_PGRS29蛋白的結構功能和理化性質提供參考，以期為結核病的預防和治療提供新的分子靶點。