王瑞萍，程浩杰，余 靂，黃明敏，譚擁軍

（湖南大學(xué)生物學(xué)院，長沙 410082）

近年來，隨著惡性腫瘤的發(fā)病率逐漸增高［1］，癌癥成為僅次于心腦血管疾病致死率第二的“殺手”，使人類健康受到嚴(yán)重的危害，因此，抗腫瘤藥物的研發(fā)迫在眉睫。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前國際上常見的臨床抗腫瘤藥物約80余種［2］，大致可分為6類：細(xì)胞毒類藥物［3］、激素類藥物［4］、生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑［5］、單克隆抗體藥物［6］、其他類藥物、輔助藥。為提高新藥的研發(fā)速度，降低癌癥的死亡率，建立一種高效的藥物篩選平臺(tái)是很有必要的。

目前，藥物篩選平臺(tái)可分為3類：基于靶點(diǎn)的細(xì)胞模型［7］、基于表型的細(xì)胞模型［8］、抗病毒藥物篩選的細(xì)胞模型［9］。其中，基于靶點(diǎn)的細(xì)胞模型是目前用于藥物篩選的主要模型，根據(jù)靶點(diǎn)的不同可以分為4類：以受體為靶點(diǎn)的細(xì)胞模型、以通道為靶點(diǎn)的細(xì)胞模型、以信號(hào)通路為靶點(diǎn)的細(xì)胞模型、以報(bào)告基因和其他類型連用為靶點(diǎn)的細(xì)胞模型。事實(shí)上，前3種藥物篩選細(xì)胞模型通常均是與報(bào)告基因聯(lián)用建立起來的，這樣可以快速且直觀地觀察到藥物作用于細(xì)胞后的變化。

常用的報(bào)告基因有5種，分別是熒光素酶（luciferase，Luc）［10］、 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（chloramphenicol acetyltransferase，CAT）［11］、 β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-gal）［12］、 分泌性人胎盤堿性磷酸酶（secreted alkaline phos-phatase，SEAP）［13］和GFP［14］。這些報(bào)告基因在細(xì)胞內(nèi)受到調(diào)控后表達(dá)量的改變可對應(yīng)于它們的酶活性或發(fā)光強(qiáng)度的改變。對螢火蟲熒光素酶和海參熒光素酶而言，檢測利用的是它對底物的發(fā)光強(qiáng)度；對β-半乳糖苷酶報(bào)告基因而言，利用的是它催化底物后的顯色反應(yīng)；對于GFP等熒光蛋白而言，則利用的是它們被激活后特定波長的發(fā)光強(qiáng)度。在試驗(yàn)時(shí)可根據(jù)報(bào)告基因質(zhì)粒的使用方便性、成本及現(xiàn)有條件進(jìn)行選擇。

這些報(bào)告基因的工作原理［15］是通過把已確定的順式調(diào)控序列剪接到報(bào)告基因上來控制基因的活性。這些反應(yīng)元件可以對宿主細(xì)胞中基因調(diào)控和表達(dá)的變化起反應(yīng)，因此就可以直觀地報(bào)道細(xì)胞內(nèi)與基因表達(dá)有關(guān)的信號(hào)級(jí)聯(lián)。

在細(xì)胞中，NF-κB的活性水平與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［16］。如在乳腺癌、結(jié)腸癌、淋巴癌等癌癥中，NF-κB的持續(xù)性激活可導(dǎo)致與細(xì)胞周期相關(guān)的蛋白活性異常，如周期蛋白D1（cyclinD1）、周期蛋白依賴激酶Cdk2（cyclin-dependent kinases）、c-myc等［17］；其次，持續(xù)性激活的NF-κB能提高一些促進(jìn)腫瘤生長的細(xì)胞因子水平，如IL-1β（急性白血病生長因子）、TNF（惡性淋巴肉芽腫瘤、T細(xì)胞淋巴癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤生長因子）、IL-6（多發(fā)性骨髓瘤的生長因子）［18］；此外，在腫瘤細(xì)胞的生長和組織侵潤過程中，NF-κB參與調(diào)節(jié)新血管生成的相關(guān)蛋白的基因表達(dá)，如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），持續(xù)性激活的NF-κB能增強(qiáng)VEGF基因的轉(zhuǎn)錄［19］；最后，NF-κB的持續(xù)性激活也能導(dǎo)致細(xì)胞的抗凋亡，抵抗化療藥物的誘導(dǎo)凋亡作用［20］。因此，NF-κB是研究抗腫瘤藥物的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一［21］。

為了高效地篩選出以NF-κB為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物，根據(jù)報(bào)告基因質(zhì)粒的工作原理，本課題成功構(gòu)建了pGL6-NF-κB-GFP報(bào)告基因質(zhì)粒，用于指示細(xì)胞中NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性水平，并且使用一線抗癌藥物如雷帕霉素［22］、紫杉醇［23］、吉西他濱［24］及本實(shí)驗(yàn)室研究開發(fā)的多肽類藥物M1-20［25］、M1-21［26］，驗(yàn)證了該報(bào)告基因體系的有效性。

1 材料與方法

1.1 材料

HEK-293T細(xì)胞購自美國模式培養(yǎng)物保藏所（American Type Culture Collection，ATCC）。DH5α感受態(tài)、pGL6-Enhancer、金牌Mix、GFP抗體、Rabbit二抗購買于碧云天生物技術(shù)公司；BamH I、Hind III限制性內(nèi)切酶購自Thermo fisher；T4 DNA Ligase 購自Ferments公司；PCR引物、1kb Marker購自北京擎科生物技術(shù)有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自O(shè)mega；Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）以及胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自GIBCO公司。

1.2 方法

1.2.1 pGL6-NF-κB-GFP報(bào)告基因質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

以實(shí)驗(yàn)室保存的pcDNA3.1-Flag-GFP質(zhì)粒為模板擴(kuò)增GFP基因。上游引物為AAGCTTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA，下游引物為GGATCCTTACTTGTACAGCTCGTCCA。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：上游引物 F 2 μL、下游引物 R 2 μL、模板 50 ng（1 μL）、金牌Mix 45 μL。擴(kuò)增條件為98℃ 2 min、98℃ 10 s、65℃ 10 s、72℃ 10 s、72℃ 5 min，30個(gè)循環(huán)。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物做膠回收，隨后用BamH I和Hind III限制性內(nèi)切酶對膠回收產(chǎn)物及pGL6-NF-κB-Luc質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，用1%的瓊脂糖凝膠電泳并回收目的片段，用T4 DNA連接酶22℃、2 h水浴連接，連接后的產(chǎn)物加入50 μL DH5α感受態(tài)進(jìn)行轉(zhuǎn)化、涂板、挑取單克隆、搖菌，送擎科生物有限公司測序，測序正確的菌液進(jìn)行質(zhì)粒小提。

1.2.2 報(bào)告基因質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染與檢測

HEK-293T細(xì)胞用體積分?jǐn)?shù)為10%的FBS和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿后，傳代到6 cm盤中；細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，轉(zhuǎn)染6 μg pGL6-NF-κB-GFP報(bào)告基因質(zhì)粒；12 h后去除培養(yǎng)基，用1×磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）洗一遍細(xì)胞，更換新鮮培養(yǎng)基；待36～48 h后用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞拍照。然后收集細(xì)胞，加300 μL IP（immunol precipitation）細(xì)胞裂解液和3 μL蛋白酶抑制劑，冰上裂解20 min，15 000 r/min、4℃離心10 min，取上清，即為細(xì)胞中的蛋白；加入5×蛋白電泳上樣緩沖液，于100℃金屬浴中10 min進(jìn)行蛋白變性，通過蛋白質(zhì)印記（Western blot，WB）檢測GFP蛋白。

1.2.3 細(xì)胞流式分析

將HEK-293T細(xì)胞接種于6 cm盤中，待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，轉(zhuǎn)染pGL6-NF-κB-GFP報(bào)告基因質(zhì)粒6 μg；12 h后換新鮮培養(yǎng)基，48 h后用0.5%的胰酶將細(xì)胞消化下來，用1×PBS清洗細(xì)胞2次，最后用500 μL的1×PBS重新懸浮細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測表達(dá)GFP細(xì)胞的比例。

1.2.4 抗腫瘤藥物的篩選

將HEK-293T細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，每孔轉(zhuǎn)染pGL6-NF-κB-GFP報(bào)告基因質(zhì)粒3 μg；12 h后換新鮮的培養(yǎng)基，同時(shí)，分別加入0.04 μmol的紫杉醇、0.02 μmol的吉西他濱、20 μmol的雷帕霉素、10 μmol的M1-20、10 μmol的M1-21處理細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞進(jìn)行流式檢測，同時(shí)收集蛋白，通過WB檢測細(xì)胞中GFP蛋白表達(dá)量的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 報(bào)告載體的調(diào)控模式

報(bào)告載體包括最基本的兩個(gè)部分，即響應(yīng)序列和報(bào)告基因。通過把已確定的順式調(diào)控序列剪接到報(bào)告基因上來控制基因的活性，這些反應(yīng)元件可以對宿主細(xì)胞中基因調(diào)控和表達(dá)的變化起反應(yīng)，從而就可以直觀地報(bào)道細(xì)胞內(nèi)與基因表達(dá)有關(guān)的信號(hào)級(jí)聯(lián)（圖1）。

圖1 報(bào)告基因載體工作模式圖Fig.1 Shows a pattern of gene vector operation

2.2 NF-κB報(bào)告基因質(zhì)粒的構(gòu)建

pGL6-NF-κB-GFP報(bào)告基因質(zhì)粒的構(gòu)建是以pGL6-NF-κB-Luc為載體，酶切去除Luc基因，同時(shí)將GFP基因連接在響應(yīng)序列之后。pGL6-NF-κBGFP報(bào)告基因質(zhì)粒的調(diào)控模式及報(bào)告序列（圖2a、2b）、質(zhì)粒圖譜（圖2c）和單克隆測序結(jié)果（圖2d）證明了質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 報(bào)告基因質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.2 Construction of the reporting gene plasmid

2.3 pGL6-NF-κB-GFP報(bào)告基因質(zhì)粒的驗(yàn)證

在HEK-293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染構(gòu)建成功的pGL6-NF-κB-GFP報(bào)告基因質(zhì)粒，48 h后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞（圖3a），結(jié)果顯示，細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，證明報(bào)告基因質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)可正常表達(dá)。同時(shí)為進(jìn)一步證明構(gòu)建質(zhì)粒的正確性，收取轉(zhuǎn)染報(bào)告基因質(zhì)粒的細(xì)胞蛋白做WB分析（圖3b），通過抗體進(jìn)一步證明GFP基因的表達(dá)及所構(gòu)建的質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)可以正常響應(yīng)。最后，用流式細(xì)胞儀對轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行定量分析（圖3c），結(jié)果同樣證明了報(bào)告基因質(zhì)粒的正確性。

圖3 報(bào)告基因質(zhì)粒的驗(yàn)證Fig.3 Validation of the reported gene plasmid

2.4 pGL6-NF-κB-GFP報(bào)告基因體系響應(yīng)抗腫瘤藥物

為證明構(gòu)建成功的pGL6-NF-κB-GFP報(bào)告基因質(zhì)粒可以做為抗腫瘤藥物篩選的工具，在體外培養(yǎng)的HEK-293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pGL6-NF-κB-GFP報(bào)告基因質(zhì)粒，然后使用臨床上常用的抗癌藥物紫杉醇（0.04 μmol）、吉西他濱（0.02 μmol）、雷帕霉素（20 μmol）、M1-20（10 μmol）、M1-21（10 μmol）處理細(xì)胞，進(jìn)行流式細(xì)胞分析（圖4a）以及WB檢測GFP蛋白的表達(dá)量（圖4b），探究此類抗腫瘤藥物對細(xì)胞中NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的影響。其結(jié)果為紫杉醇、吉西他濱、雷帕霉素、M1-20、M1-21均抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。該結(jié)果證明了報(bào)告基因體系可以正常響應(yīng)抗腫瘤藥物。

圖4 抗腫瘤藥物對NF-κB信號(hào)通路的影響Fig.4 Effects of antineoplastic drugs on the NF-κB signaling pathway

3 討論

腫瘤是一種嚴(yán)重危害人類健康的疾?。?7］。幾十年來，人們一直在開發(fā)研究新的藥物以期能有效抑制腫瘤的惡性增長。在研究過程中，尋找一種能快速篩選出有效的抗腫瘤藥物的有效方法極為重要?，F(xiàn)如今，常用的一些篩選體系可以分為生化篩選體系和細(xì)胞篩選體系兩大類?；诩?xì)胞的篩選方法包括細(xì)胞活力（cell viability）、報(bào)告基因（reporter gene）、第二信使（second messenger）、高通量顯微鏡篩選（high-throughput microscopy assays）和基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的篩選。而基于報(bào)告基因建立的藥物篩選平臺(tái)，應(yīng)用熒光或化學(xué)發(fā)光法對報(bào)告基因進(jìn)行檢測更簡單、更靈敏。如Zlokarnik等［28］在進(jìn)行轉(zhuǎn)錄定量和單一活細(xì)胞克隆篩選的研究中，用β內(nèi)酰胺酶基因作為報(bào)告基因，在細(xì)胞株轉(zhuǎn)染受體表達(dá)后，再轉(zhuǎn)染構(gòu)建好的NF-κB內(nèi)酰胺酶質(zhì)粒。報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物可以水解細(xì)胞內(nèi)的一種跨膜脂蛋白，每一個(gè)酶分子可以催化很多底物分子的化學(xué)鍵斷裂，從而改變底物分子的共振能。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，這種變化可以通過胞內(nèi)顏色由綠到藍(lán)的改變來探測到。報(bào)告基因可以實(shí)時(shí)檢測細(xì)胞活動(dòng)和生理化學(xué)物質(zhì)的變化情況，并且具有實(shí)時(shí)性、可靠性等優(yōu)點(diǎn)，因此，在植物基因工程、動(dòng)物基因工程等中也被廣泛應(yīng)用。

用報(bào)告基因?qū)蜻x藥物進(jìn)行篩選，其最大的優(yōu)點(diǎn)在于整個(gè)篩選過程可以直接在存活細(xì)胞中進(jìn)行，不必破碎細(xì)胞，報(bào)告基因表達(dá)的定性定量分析可以簡單地通過胞內(nèi)顏色的變化來探測。如采用不同藥物處理細(xì)胞，根據(jù)報(bào)告基因質(zhì)粒的表達(dá)情況判斷藥物分子對細(xì)胞的影響，從而篩選得到有效的藥物，或者用同一藥物分子處理細(xì)胞，檢測不同報(bào)告基因質(zhì)粒的表達(dá)，判斷該藥物對細(xì)胞中某些信號(hào)通路或關(guān)鍵基因表達(dá)的影響，進(jìn)而高效地篩選出抗腫瘤藥物。但是報(bào)告基因系統(tǒng)也存在一定的缺陷，如這種瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法不能建立穩(wěn)定篩選的細(xì)胞株，每次篩選都要重新轉(zhuǎn)染，此外，對一些難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞（如原代細(xì)胞、不分化的細(xì)胞等）會(huì)出現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率低下及浪費(fèi)昂貴的轉(zhuǎn)染試劑等問題。

在本文中，我們運(yùn)用基因工程技術(shù)［29］，基于pGL6-NF-κB-GFP報(bào)告基因質(zhì)粒，建立了一個(gè)抗腫瘤藥物篩選平臺(tái)，并在分子及細(xì)胞水平上證明了報(bào)告基因體系可以響應(yīng)藥物對細(xì)胞的影響，從而實(shí)現(xiàn)對抗腫瘤藥物的篩選。在之后的研究工作中，我們考慮將這些報(bào)告基因質(zhì)粒構(gòu)建為穩(wěn)定的細(xì)胞株，建立完整的活細(xì)胞示蹤體系，從而為研究抗腫瘤藥物提供更好的技術(shù)體系。