侯 骉,黃偉民,王曉明,韓志偉,員建平,鄒 龍,王 亮
缺血性心臟病的發(fā)病率和死亡率一直居高不下,嚴(yán)重威脅著人類的生命安全[1]。在臨床上,缺血性心臟病的治療策略,無(wú)論是支架介入還是冠狀動(dòng)脈旁路移植,目的都是冠狀動(dòng)脈再通恢復(fù)心肌供血[2]。因此,很難回避心肌缺血再灌注帶來(lái)的負(fù)面影響,如心肌細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥等[3]。為了減輕缺血再灌注所致的心肌損傷,本文在細(xì)胞和分子水平,分別觀察了微小核糖核酸(miRNA)過(guò)表達(dá)對(duì)缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)所致的細(xì)胞凋亡的影響。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,miRNA不僅參與了細(xì)胞分化、增殖和凋亡的調(diào)節(jié),還與心血管疾病的發(fā)展密切相關(guān),如心肌梗死、心肌肥大和心肌細(xì)胞凋亡等[4]。本研究利用miRNA家族之一的miR-342-5p,對(duì)H9c2細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,使之過(guò)表達(dá)miR-342-5p,并建立H9c2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型,探究miR-342-5p能否減輕H/R所致的細(xì)胞凋亡,為心血管疾病的治療提供新思路和新靶點(diǎn)。
1.1 材料 H9c2細(xì)胞(富衡生物科技有限公司,上海);胎牛血清(FBS)、高糖細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM)、胰酶(gibco公司,美國(guó));逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)試劑盒、miRNA-342-5p模擬物(mimics)、陰性轉(zhuǎn)染質(zhì)粒(miR-NC mimics)(吉瑪基因有限公司,蘇州);lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑(Sigma公司,美國(guó));CCK-8細(xì)胞增殖毒性檢測(cè)試劑盒、1%青霉素/鏈霉素、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗(索萊寶科技有限公司,北京);B淋巴細(xì)胞瘤-2基因相關(guān)X(Bax)蛋白、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)、半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)和3-磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehy?drogenase,GAPDH)抗體(abcam公司,英國(guó))。
1.2 研究對(duì)象 將H9c2細(xì)胞復(fù)蘇后接種于高糖DMEM完全培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素)中,培養(yǎng)于恒溫恒濕孵箱中。適時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基及傳代。
1.3 實(shí)驗(yàn)分組和miRNA-342-5p轉(zhuǎn)染 根據(jù)不同的處理方法將細(xì)胞分為四組:空白對(duì)照(Sham)組;H/R處理(H/R組);轉(zhuǎn)染miR-342-5p mimics后H/R處理(miR-342-5p)組;轉(zhuǎn)染mimics control后H/R(miR-NC)組,該組為miR-342-5p的陰性對(duì)照組。待細(xì)胞融合度為70%~80%時(shí)用胰酶進(jìn)行消化處理,隨后接種于6孔培養(yǎng)板(2×105個(gè)細(xì)胞/孔)。嚴(yán)格按照l(shuí)ipofectamine3000操作說(shuō)明書(shū),分別將miRNA-342-5p mimics或miR-NC mimics轉(zhuǎn)染至H9c2細(xì)胞中,待轉(zhuǎn)染成功后,各組細(xì)胞同時(shí)給予H/R處理(Sham組除外),缺氧培養(yǎng)(1%O2+5%CO2+94%N2)24 h后,更換新鮮完全培養(yǎng)基,再放入常規(guī)孵箱(95%空氣+5%CO2)復(fù)氧2 h。
1.4 miRNA-342-5p表達(dá)水平檢測(cè) 通過(guò)RTqPCR法檢測(cè)H9c2細(xì)胞中miRNA-342-5p的表達(dá)水平,用Trizol試劑從細(xì)胞中分離總RNA,使用分光光度計(jì)(NanoDrop2000)檢測(cè)總RNA的濃度及純度。嚴(yán)格按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,將miRNA合成為cDNA,并以cDNA作為模板,用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng) 儀 進(jìn) 行 擴(kuò) 增 反 應(yīng)。以U6(上 游5’-3GTGCTCGCTTCGGCACATATAC和下游5-3AAAAATATGGAACGCTCACGAATTTG)為 內(nèi) 參,用2-△△ct法計(jì)算miR-342-5p(上游5’-3CGGAG GGGT?GCTATCTG和下游5-3CAGATAG CACCCCTCCG)的相對(duì)表達(dá)水平。
1.5 細(xì)胞增殖試驗(yàn) 通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑(CCK-8)評(píng)估H9c2細(xì)胞活力。轉(zhuǎn)染成功后,取各組對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的H9c2將各組細(xì)胞接種于96孔板(2×103個(gè)細(xì)胞/孔)中,在正常環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)24 h和72 h,在不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)加入10 μl CCK-8溶液,在37℃的正常培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)2 h。通過(guò)酶標(biāo)儀(Bio-Rad,Cal,USA)測(cè)定波長(zhǎng)450 nm的光密度(optical density,OD)值,以此對(duì)細(xì)胞進(jìn)行增殖測(cè)定和生長(zhǎng)曲線繪圖。
1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的H9c2細(xì)胞,制成105/ml的細(xì)胞懸液,經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次后,離心取下層沉淀,再用結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,加入5 μl膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素和10 μl碘化丙啶,避光輕輕振蕩混勻,室溫放置15 min。15 min后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況并計(jì)算凋亡率。
1.7 蛋白印跡法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白 將各組細(xì)胞收集并用細(xì)胞裂解液提取蛋白后,吹勻取20 μl用蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定樣品內(nèi)蛋白含量,測(cè)定后向每組樣品加入PBS配平,按4∶1的比例加入5×加樣緩沖液后,100℃水浴5 min。取不同組別樣品20 μg,采用4%~15%濃度的變性蛋白預(yù)制膠(Bio-Rad垂直板式電泳儀)90 min進(jìn)行分離,然后采用半干轉(zhuǎn)方式轉(zhuǎn)膜70 min。5%BSA封閉液37℃封閉2 h,加入一抗,Caepase-3和Bcl-2為1∶1 000,Bax為1∶2 000,4℃孵育過(guò)夜,Western洗滌緩沖液(TBS-T)洗滌3次,每次15 min,偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶羊抗兔IgG(1∶5 000)室溫孵育2 h,TBS-T洗滌3次,每次15 min,顯影。內(nèi)參選用GAPDH。通過(guò)BioRad成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白質(zhì)條帶,隨后使用Image J軟件定量分析。
1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Graphpad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件,所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)呈現(xiàn),組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用方差分析(SNK-q檢驗(yàn)),P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 經(jīng)轉(zhuǎn)染后H9c2細(xì)胞miR-342-5p的表達(dá)水平 激光共聚焦結(jié)果顯示H9c2細(xì)胞經(jīng)miR-342-5p和miR-NC轉(zhuǎn)染后,miR-342-5p組的熒光強(qiáng)度與miR-NC組無(wú)明顯差異,見(jiàn)圖1A。結(jié)果顯示,H9c2細(xì)胞經(jīng)miRNA-342-5p轉(zhuǎn)染后,miR-342-5p組的相對(duì)表達(dá)量(3.67±0.69)最高,顯著高于miR-NC組(1.02±0.11)和Sham組(1.02±0.13),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說(shuō)明miR-342-5p轉(zhuǎn)染成功。見(jiàn)圖1B。
圖1 H9c2細(xì)胞miR-342-5p的轉(zhuǎn)染和表達(dá)水平
2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果 通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在24~72 h的時(shí)間范圍內(nèi),隨著時(shí)間的推移,三組H9c2細(xì)胞逐漸增殖,并且增殖趨勢(shì)一致。但在24 h、48 h、72 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn),Sham組的細(xì)胞增殖率略高于其他兩組,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0316)。在被轉(zhuǎn)染的兩組,三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖率保持一致,未出現(xiàn)組間差異。見(jiàn)圖2。
圖2 各組H9c2細(xì)胞相對(duì)增殖率
2.3 miR-342-5p減輕H/R誘發(fā)的細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果右上象限為凋亡細(xì)胞所占比率,見(jiàn)圖3A。經(jīng)H/R處理后,與sham組相比H/R組的凋亡率[(12.4±1.02)%]顯著升高,但經(jīng)miRNA-342-5p轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞,即miR-342-5p組,凋亡率[(7±1.03)%]又顯著下降,說(shuō)明miR-342-5p可以部分消除H/R誘發(fā)的細(xì)胞凋亡,量化后的4組結(jié)果詳見(jiàn)圖3B。
圖3 miR-342-5p對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響
2.4 miR-342-5p對(duì)H/R誘發(fā)凋亡蛋白的影響 利用Western blot免疫印跡方法,檢測(cè)了三種凋亡蛋白:Bcl-2、Bax和Caspase-3。結(jié)果miR-342-5p組中的Bcl-2的蛋白表達(dá)水平顯著高于miR-NC組與H/R組,而B(niǎo)ax與Caspase-3的蛋白表達(dá)水平顯著低于miR-NC和H/R組,miR-342-5p部分抑制H/R誘發(fā)的細(xì)胞凋亡。見(jiàn)圖4。
圖4 缺氧/復(fù)氧后H9c2細(xì)胞相關(guān)凋亡蛋白的變化
目前全球心臟病患者的首位死亡原因?yàn)槿毖孕呐K病,給社會(huì)經(jīng)濟(jì)造成了重大負(fù)擔(dān),雖然醫(yī)療技術(shù)飛速發(fā)展,但其治療方法目前仍以血運(yùn)重建為主[5]。缺血意味著心肌細(xì)胞缺氧,心肌再灌注就類似于心肌細(xì)胞缺氧后復(fù)氧,導(dǎo)致心肌細(xì)胞受損凋亡,近年來(lái),尋找能有效抑制心肌細(xì)胞再灌注損傷后的細(xì)胞凋亡一直是國(guó)內(nèi)外基礎(chǔ)與臨床研究的熱點(diǎn)。
以往多項(xiàng)研究表明,細(xì)胞凋亡是受到多種凋亡相關(guān)基因調(diào)控的,其中包括Bcl-2、Bax和Caspase-3等[6]。而miRNA作為真核生物中廣泛存在的一種RNA,在細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中扮演著不可替代的角色,如調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡、分化、自我更新等[7]。miR-342-5p作為眾多miRNA家族中的一員,具有抗凋亡和抗氧化等多種生物學(xué)特性。Sun等研究發(fā)現(xiàn),miR-342-5p可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞外因子通路,抑制氧化應(yīng)激水平從而調(diào)節(jié)動(dòng)脈斑塊的穩(wěn)定性,以發(fā)揮保護(hù)血管的作用[8]。Bi等發(fā)現(xiàn),其可靶向磷脂酰肌醇3-激酶Ⅰ型受體來(lái)激活蛋白激酶通路,起到促進(jìn)血管內(nèi)皮平滑肌細(xì)胞的增殖和分化,來(lái)保護(hù)血管內(nèi)皮的完整性和光滑性[9]。也有報(bào)道指出,長(zhǎng)期的運(yùn)動(dòng)會(huì)增加體內(nèi)miR-342-5p表達(dá)水平的增高,繼而減少心肌缺血再灌注損傷[10]。H9c2細(xì)胞被廣泛用于心肌缺血再灌注損傷的相關(guān)研究[11],因此本研究擬采用H9c2細(xì)胞探究miR-342-5p的保護(hù)作用和相關(guān)機(jī)制。
細(xì)胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷的主要因素[5]。Bcl-2和Bax作為凋亡家族中的主要調(diào)節(jié)因子,但在細(xì)胞凋亡途徑中卻有相反作用,Bcl-2抗細(xì)胞凋亡而B(niǎo)ax促細(xì)胞凋亡[12]。為了驗(yàn)證miR-342-5p是否影響H9c2的增值效率及抗凋亡作用,筆者通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn),miR-342-5p并不會(huì)影響細(xì)胞增殖效率,同時(shí)也能夠有效減少因H/R誘導(dǎo)的凋亡。在細(xì)胞相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)方面,筆者通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),miR-342-5p可以顯著增強(qiáng)H9c2細(xì)胞經(jīng)H/R誘導(dǎo)后Bcl-2的表達(dá)量,降低Bax的表達(dá),同時(shí)也能有效抑制Caspase-3的表達(dá)。
總之,本研究分別從細(xì)胞水平和分子水平證實(shí)了miRNA家族之一的miR-342-5p,能夠有效改善H/R帶來(lái)的細(xì)胞損傷,其保護(hù)機(jī)制是通過(guò)調(diào)控Bcl-2/Bax的表達(dá),抑制H/R引起的細(xì)胞凋亡。希望這一研究發(fā)現(xiàn)能為臨床上治療缺血性心臟病提供新靶點(diǎn)和新思路。