張前進,曹麗茹,馬晨晨,龐蕓蕓,葉飛宇,魯曉民

玉米基因的分子特性、克隆和響應(yīng)干旱脅迫的表達分析

張前進,曹麗茹,馬晨晨,龐蕓蕓,葉飛宇,魯曉民*

河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所, 河南 鄭州 450002

胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白是一類富集在種子胚發(fā)育后期的脫水保護蛋白，在抵御干旱、高鹽等逆境脅迫中發(fā)揮著重要的作用。本文克隆了一個胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白基因，該基因含有876 bp的開放閱讀框，編碼了291個氨基酸，屬于親水性蛋白。蛋白進化樹分析，發(fā)現(xiàn)ZmLEA34蛋白與高粱的同源關(guān)系最近，且同一位置具有相同的保守基序；順式作用元件分析，發(fā)現(xiàn)該基因含有多個響應(yīng)逆境脅迫、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、光信號等結(jié)合位點；qRT-PCR實驗結(jié)果表明，基因?qū)儆诮M成型表達基因，在胚、根、葉中表達量較高，基因在根和葉中受干旱脅迫的誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達，且抗旱玉米自交系鄭36中的表達量始終高于B73，推測該基因其表達量與材料的耐旱性呈顯著正相關(guān)。研究結(jié)果為進一步揭示基因的作用機制奠定基礎(chǔ)。

玉米; 組成型表達; 抗旱性

玉米（.L）是世界上主要的糧食作物之一，種植面積比較廣泛，其產(chǎn)量居各糧食作物之首[1]。但隨著自然災(zāi)害的頻繁發(fā)生，對玉米產(chǎn)量造成了不小的損失，尤其是干旱脅迫[2]。我國是農(nóng)業(yè)大國，玉米是我國十分重要的糧食作物、飼料作物和工業(yè)原料，但大部分玉米主產(chǎn)區(qū)存在水資源短缺嚴重、蒸發(fā)量較大等的問題，再加上極端干旱天氣頻發(fā)，導(dǎo)致玉米減問題日益突出。因此，對玉米抗旱機理的分子研究，來提高玉米的產(chǎn)量和保障糧食安全具有十分重要的現(xiàn)實意義。

植物胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白(late embryogenesis abundant proteins，LEA)是一類龐大、多樣化的蛋白，主要定位在細胞核、細胞質(zhì)和線粒體中[3]。在棉花胚胎發(fā)育后期的子葉中LEA蛋白首次被發(fā)現(xiàn)，之后在玉米[4]、擬南芥[5]、水稻[6]、小麥[7]等植物中同樣發(fā)現(xiàn)了LEA蛋白的存在，發(fā)現(xiàn)LEA蛋白在維持植物正常生長發(fā)育和響應(yīng)非生物脅迫中發(fā)揮著十分重要作用?；蚩杀幻撀渌岷透鞣N非生物脅迫等如干旱，滲透脅迫等的誘導(dǎo)表達。在玉米中ZmLEA3蛋白在滲透和氧化脅迫下通過保護蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和結(jié)合金屬來保護植物免受傷害[8]；編碼了一個LEA家族蛋白，是一種正向抗旱性的調(diào)控因子，的過表達增加了ABA的敏感性，增強了水稻耐旱性[9]；過表達提高了轉(zhuǎn)基因水稻的抗旱能力和耐鹽性[10]。過表達OsLEA3-2蛋白能改善鹽和干旱條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥和水稻的生長[11]；在大豆中LEA蛋白基因積極響應(yīng)鹽和滲透脅迫，研究發(fā)現(xiàn)該基因在擬南芥中過表達增強了轉(zhuǎn)基因植株對鹽和滲透脅迫的耐受能力[12]。

植物在面臨干旱脅迫時體內(nèi)的生理生化指標會發(fā)生一定的變化，而抗氧化反應(yīng)是干旱脅迫最終的反應(yīng)之一，在干旱脅迫下作物體內(nèi)會產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)，活性氧的積累使細胞受到嚴重的傷害，從而導(dǎo)致代謝功能紊亂[13]。目前，在干旱脅迫等逆境中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)等酶活性的變化在植物中已經(jīng)被廣泛作為生理生化指標[14]。在相關(guān)研究中，發(fā)現(xiàn)水分脅迫下玉米的抗旱性與SOD、POD、CAT等保護酶的活性呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，且抗旱性強的品種中SOD、POD、CAT等保護酶的活性較高[15]；干旱脅迫下小麥干物質(zhì)積累量降低，抗氧化酶活性隨著干旱程度的增強而增加[16]；和的表達水平隨著小麥干旱條件的變化而發(fā)生改變尤其在嚴重干旱時表達量顯著增強[17]。

本文利用實驗室前期轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)基因在正常生長條件和干旱脅迫下相對表達量差異達到極顯著的水平。對基因的生物信息學(xué)進行預(yù)測，并從玉米中克隆了基因的開放閱讀框，對ATG前2 000 bp啟動子元件進行分析，通過熒光定量PCR分析該基因在各組織中的表達情況以及非生物脅迫下的表達模式進行分析，發(fā)現(xiàn)該基因積極響應(yīng)干旱脅迫。該研究結(jié)果為進一步對玉米的抗旱機制的探究奠定了分子基礎(chǔ)，也為抗逆育種提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與處理

利用鄭36和B73兩個自交系作為實驗材料，挑選出籽粒飽滿的種子種植在營養(yǎng)土中，并用Hoagland's營養(yǎng)液澆灌，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（光照培養(yǎng)30 ℃，16 h；黑暗培養(yǎng)26 ℃，8 h；相對濕度約35%～55%）。當玉米苗長至三葉一心時，開始對長勢一致的玉米進行20% PEG-6 000脅迫處理，分別對脅迫0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h的玉米苗的根和葉隨機進行取樣，每3個樣品等量混合作為1個重復(fù)，各取3個重復(fù)；對正常生長和20% PEG-6 000脅迫5 d的葉片進行取樣，每5株為1個樣品，取6個生物學(xué)重復(fù)，分別用于進行轉(zhuǎn)錄組測序分析和生理生化指標的測定，將樣品迅速放入液氮中，并在-80 ℃超低溫冰箱中保存。以及對鄭36的根、莖、葉、雄穗、雌穗、胚、胚乳組織進行取樣，對基因的不同組織進行特異性的表達分析。

1.2 ZmLEA34基因的克隆

利用NCBI網(wǎng)站BLAST基因（）的CDS序列，設(shè)計特異性引物（ZmLEA34-F：CCAGCGGTGATCTGTAGTAGC；ZmLEA34-R：CTTCAGAGTCCAGGACACGC）對基因進行擴增，并將擴增的產(chǎn)物與T載進行連接，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑出陽性單克?。ú簧儆?個）送到華大測序公司進行測序，測序的結(jié)果與Maize GDB數(shù)據(jù)庫進行序列比對。

1.3 ZmLEA34基因的生物信息分析

利用ExPASy ProtParam 軟件在線分析ZmLEA34蛋白質(zhì)的分子量、等電點、穩(wěn)定性和疏水性等；利用TMHMM分析跨膜螺旋區(qū)；利用SOPMA進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；利用NetPhoS在線預(yù)測蛋白磷酸化位點；利用BLASTP對ZmLEA34蛋白的其他物種同源序列進行搜索，DNAMAN進行序列比對，軟件MEGA6.1構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；利用MEME分析蛋白的保守基序進行，最大基序值設(shè)置為10；利用PlantCARE對啟動子元件進行分析。

1.4 RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR數(shù)據(jù)處理

利用RNA提取試劑盒（EasyPure RNA Purification Kit）抽提玉米的總RNA，用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit）將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并放在-20 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩８鶕?jù)基因序列設(shè)計熒光定量引物（ZmLEA34-F：GAGACGAGGACAAGGCCAC；ZmLEA34-R：TCGTTCCTGTTGCGGTTCTC），并利用玉米18S（18S-F：CCTGCGGCTTAATTGACTC；18S-R：GTTAGCAGGCTGAGGTCTGG）作為內(nèi)參，利用熒光定量試劑盒（SYBR Premix Ex Taq TM）上的實驗操作在CFX96實時熒光定量 PCR儀進行qRT-PCR分析，每個樣品3次重復(fù)，相對表達量利用2^-△△Ct法進行計算。

1.5 生理生化指標的測定方法

超氧化物歧化酶SOD活性利用氮藍四唑法測定；過氧化物酶POD活性利用愈創(chuàng)木酚法測定；過氧化氫酶CAT的活性利用紫外吸收法測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下不同玉米生理生化指標的測定

前人研究中，發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下玉米的抗旱性與抗氧化酶的活性呈正相關(guān)。本研究利用鄭36和B73兩個自交系為實驗材料，在苗期時進行干旱脅迫，對抗氧化酶活性進行測定。發(fā)現(xiàn)干旱脅迫后這兩個材料的超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化物歧化酶（POD）活性和過氧化氫酶（CAT）的活性均顯著提高（圖1），但鄭36抗氧化酶活性提高幅度遠高于B73，說明鄭36抗旱能力比B73強。

圖1 干旱脅迫下ZmLEA34基因生理指標測定

2.2 ZmLEA34基因的鑒定

實驗室前期對玉米三葉期幼苗進行干旱脅迫處理，取玉米葉片進行轉(zhuǎn)錄組測序，并分析基因的FPKM值和功能注釋，發(fā)現(xiàn)基因在正常生長條件和干旱脅迫下差異達到極顯著的水平。另對玉米葉片中基因進行qRT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)該基因在干旱脅迫后相對表達量顯著提高，這與轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果是一致的（圖2），因此表明了基因在玉米響應(yīng)干旱脅迫過程中發(fā)揮著十分重要的作用。

圖2 ZmLEA34基因的qRT-PCR

RPKM：每百萬個比對上的reads中比對到外顯子的每1 000個堿基上的片段個數(shù)

RPKM: Number of fragments per 1 000 bases of an exon matched in reads per million alignments

2.3 ZmLEA34基因的克隆

利用RT-PCR實驗技術(shù)對基因進行擴增，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳得到了一條大小約為900 bp的條帶（圖3）。通過條帶回收和連接載體，并挑選出陽性的單克隆，將菌液送到測序公司進行測序。對測序結(jié)果進行分析，發(fā)現(xiàn)這個序列是一個完整的876 bp的開放閱讀框，編碼了291個氨基酸，這與B73的序列是一致的。

圖3 ZmLEA34基因PCR擴增電泳結(jié)果

M. 2 000 bp DNA Marker; 1.

2.4 ZmLEA34基因的生物信息學(xué)分析

利用ExPASy ProtParam軟件對蛋白結(jié)構(gòu)進行分析，發(fā)現(xiàn)ZmLEA34的相對分子質(zhì)量約為28.41kDa，理論等電點為4.51，分子式為C1 196H1 923N373O42S5；不穩(wěn)定系數(shù)為32.77，屬于穩(wěn)定性蛋白；脂肪系數(shù)為70.76；利用ProtScale在線分析GRAVY值大小為-0.209，屬于親水性蛋白；通過對PHD跨膜螺旋區(qū)進行分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)域，不是跨膜蛋白；利用SOPMA對蛋白結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，顯示該蛋白無規(guī)則卷曲占比45.02%，α螺旋占40.21%，β折疊占6.78%，主要以無規(guī)則卷曲為主（表1）。NetPhoS在線分析顯示ZmLEA34蛋白包含5個絲氨酸和7個蘇氨酸位點，表明該蛋白很有可能被絲氨酸和蘇氨酸激酶激活，調(diào)控其響應(yīng)基因，參與植物生長發(fā)育過程、逆境脅迫過程等。

表1 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

2.5 玉米ZmLEA34蛋白進化樹分析

利用BLAST在線軟件對ZmLEA34蛋白的同源序列進行搜索，選擇同源性較高的其他物種的蛋白序列。利用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，發(fā)現(xiàn)玉米ZmLEA34蛋白與高粱的同源關(guān)系最近，同源度高達95%，其次是芒草、洋槐，與狗尾草和畫眉草親緣關(guān)系較遠（圖4）。為了進一步對ZmLEA34蛋白和同源蛋白的保守性進行分析，利用在線軟件MEME對10個保守基序進行鑒定，發(fā)現(xiàn)玉米不僅與高粱的同源性高，而且在氨基酸相同位置含有相同的保守基序，說明了物種之間的同源性越高，保守基序就越相似，之間的關(guān)系也就越親近。

圖4 ZmLEA34蛋白與其他物種同源蛋白的進化樹及保守基序分析

2.6 ZmLEA34基因啟動子元件分析

為了進一步探究基因潛在的調(diào)控機制，利用Plantcare分析基因啟動子區(qū)域2 000 bp進行順式元件調(diào)控分析（表2）。發(fā)現(xiàn)有多種啟動子響應(yīng)元件，有CAAT-box、TATA-box、A-box等啟動子基本的元件，還含有G-Box、ACE、ABRE、CGTCA-motif、LTR等結(jié)合位點。ABRE參與脫落酸反應(yīng)，在ABA信號傳導(dǎo)途徑中發(fā)揮作用，響應(yīng)干旱脅迫；LTR是低溫應(yīng)激相關(guān)元件；CGTCA-motif、TGACG-motif等參與茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的途徑；還有ACE、G-box、GA-motif等大量的光反應(yīng)響應(yīng)元件。因此推測基因除了應(yīng)對非生物脅迫外，還參與調(diào)控植物開花和光合作用等。

表2 ZmLEA34基因啟動子順式元件分析

2.7 ZmLEA34基因在玉米不同組織中的表達分析

為了進一步了解基因的在玉米組織中的表達模式，對玉米的根、莖、葉、雄穗、雌穗、胚和胚乳進行qRT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)基因在這些組織中均有所表達，但相對表達量有較大差異（圖5）。其中在胚中的表達量最高，其次是葉和根，但在雌穗和胚乳中相對表達量極低。說明基因是組成型表達基因，在不同組織中相對表達量有顯著差異，在玉米的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著十分重要的作用。

圖5 ZmLEA34基因在不同組織中的相對表達量

2.8 ZmLEA34基因響應(yīng)干旱脅迫的表達模式分析

為揭示基因在干旱脅迫下的表達模式，對玉米抗旱自交系鄭36和旱敏感性自交系B73的根和葉的相對表達量進行分析，發(fā)現(xiàn)基因隨著干旱時間增長，相對表達量逐步升高，且在干旱脅迫48 h時，在根和葉片中的表達量均達到了最大，鄭36與B73中的表達量相差倍數(shù)分別為1.7倍和2.3倍（圖6）。結(jié)果表明基因相對表達量的高低與材料的抗旱能力存在著密切聯(lián)系，推測相對表達量越高，材料的抗旱性就越強。

圖6 ZmLEA34基因表達模式分析

2.9 ZmLEA34蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測

為探究基因可能存在的網(wǎng)絡(luò)機制，利用STRING在線預(yù)測ZmLEA34蛋白的互作蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與ZmLEA34的互作蛋白主要有胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白、3’,5’二磷酸核苷酸酶、腺嘌呤核苷酸α水解酶家族蛋白、tRNA鳥酰基轉(zhuǎn)移酶1、質(zhì)膜膽堿轉(zhuǎn)運蛋白、RNA結(jié)合家族蛋白。這些結(jié)構(gòu)域主要參與植物細胞的生長發(fā)育、次生代謝物的合成與降解、以及響應(yīng)植物非生物脅迫等整個植物的生長過程。因此推測ZmLEA34蛋白與互作蛋白協(xié)同構(gòu)建一張網(wǎng)絡(luò)，來調(diào)控植物生長發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答過程等。

表3 ZmLEA34基因的互作蛋白預(yù)測

3 討論

玉米是世界上重要的糧食作物、飼料作物和加工原料，在我國的糧食安全和人民的增收中發(fā)揮著非常重要的作用。近年來，隨著氣候溫度的升高，非生物脅迫發(fā)生的頻率逐漸增多，已經(jīng)嚴重威脅到全球糧食安全。干旱是主要影響農(nóng)作物產(chǎn)量的因素之一，其造成的玉米減產(chǎn)成為迫切解決的問題。因此抗旱基因的挖掘，抗旱機制的解析，抗旱種質(zhì)資源的篩選，從分子的層面來探究植物的抗旱能力，具有重要的現(xiàn)實意義。

本研究克隆了一個胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白基因，對ZmLEA34蛋白進行分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白結(jié)構(gòu)主要以無規(guī)則卷曲和α螺旋為主，且屬于親水性蛋白，這與大多數(shù)LEA蛋白結(jié)構(gòu)是一致[18,19]；對該蛋白進行系統(tǒng)進化樹和保守基序進行分析，發(fā)現(xiàn)ZmLEA34蛋白具有較高的保守性，且ZmLEA34蛋白與高粱的同源性最高，這與Nagaraju M的研究結(jié)果是一致的[20]；對啟動子區(qū)域順式元件分析，得到了低溫、脫落酸、茉莉酸響應(yīng)等相關(guān)的順式作用元件，有實驗研究表明這些順式元件在基因響應(yīng)非生物脅迫中起著十分重要的作用。高粱、上游啟動子區(qū)域含有與干旱和ABA 響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件MYC、ABRE[21]，但也并不能說明含有這些順式作用元件一定能夠響應(yīng)非生物脅迫，這需要進行實驗來驗證。為進一步了解基因的表達模式，對玉米的各個組織進行實時熒光定量分析，發(fā)現(xiàn)是組成型表達基因，且在胚、葉和根中的表達量較高，這與前人研究只在胚中高表達是不一致的[22]，該實驗結(jié)果說明了我們所克隆到的基因與其他的 LEA基因有明顯不同特點；LEA蛋白是一種功能蛋白，通過大量的實驗研究表明，其主要的功能特征是基因能夠響應(yīng)低溫、干旱等多種非生物脅迫[23]。基因在不同作物中的表達趨勢不同，過表達基因可以增強農(nóng)作物對逆境脅迫的耐受性。的過表達提高了轉(zhuǎn)基因煙草（）和酵母對干旱脅迫和低溫脅迫的耐受能力[24]?？梢栽诟鞣N非生物脅迫中表達，在高鹽、滲透脅迫和氧化脅迫中高表達，過表達能提高轉(zhuǎn)基因煙草對滲透脅迫的抗性[8]；過表達LEA基因能增強轉(zhuǎn)基因玉米對水分脅迫的耐受能力[25]。干旱條件下，過表達的擬南芥的耐旱能力強于野生型，且嚴重缺水時，AtLEA4蛋白的積累比野生型更加敏感[26]。在鹽和干旱生長條件下，過表達基因可以促進轉(zhuǎn)基因擬南芥和水稻的生長[27]；基因的誘導(dǎo)表達增強了小麥的的耐鹽和耐旱性[28]；基因在不同植物的組織中均有所表達，且該基因在擬南芥[29]和甘薯[30]中過表達提高了對鹽的耐受力。本實驗研究發(fā)現(xiàn)基因隨著干旱脅迫時間增長，表達量逐漸增高，在48 h時達到高峰，并與玉米的抗旱性存在正相關(guān)性，自交系鄭36的表達量始終高于B73，且增長幅度遠高于B73，說明基因與材料的抗旱能力存在著密切聯(lián)系，后續(xù)可以通過該基因的過表達研究其提高玉米耐旱性的作用機理，為抗逆玉米新品種的選育提供理論基礎(chǔ)。

根據(jù)實驗室前期轉(zhuǎn)錄組的分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)基因在正常和干旱脅迫下相對表達量達到極顯著差異水平。本文對基因進行分析，發(fā)現(xiàn)該基因?qū)儆诮M成型表達的基因，在胚、根和葉中高表達；進化樹分析，ZmLEA34蛋白與高粱的同源性最高，且保守基序相似度也高，進化關(guān)系最近；干旱脅迫下，基因在抗旱玉米自交系鄭36中的表達量始終高于B73，推測其表達量與玉米的抗旱性存呈正相關(guān)；并通過蛋白互作網(wǎng)站預(yù)測，或許該基因與其他基因協(xié)同調(diào)控玉米干旱脅迫的過程。該研究結(jié)果為進一步確定基因在逆境脅迫中的作用機制奠定基礎(chǔ)，同時也為抗逆育種提供了新思路。

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Molecular Characteristics, Cloning and Expression Analysis ofGene in Maize in Response to Drought Stress

ZHANG Qian-jin, CAO Li-ru, MA Chen-chen, PANG Yun-yun, YE Fei-yu, LU Xiao-min*

450002,

Late embryogenesis abundant proteins is a kind of dehydrating protective protein enriched in late embryo development, which plays an important role in resistingdrought, high salt and other stresses. In this paper, we cloned a protein-rich genein late embryonic development. The gene contains an 876 bp open reading frame and codes 291 amino acids, which is a hydrophilic protein. The analysis of protein evolutionary tree showed that ZmLEA34 had the closest homology relationship with sorghum, and had the same conserved motif in the same location. Cis-acting element analysis showed that the gene contained multiple binding sites in response to stress, plant hormone signal transduction and light signal. The results of qRT-PCR showed thatwas a constitutive expression gene, with a high expression level in embryo, root and leaf. ZmLEA34 was significantly up-regulated in roots and leaves under drought stress, and the expression level of drought-resistant maize inbred line Zheng 36 was always higher than that in B73. It was speculated that the expression level of this gene was significantly and positively related to the drought tolerance of the materials. The results lay a foundation for further revealing the mechanism ofgene.

Maize; constitutive expression; drought tolerance

S513

A

1000-2324(2022)05-0665-08

2022-09-14

2022-12-10

河南省重大科技專項-子課題:玉米關(guān)鍵性狀優(yōu)異基因挖掘與新品種選育(221100110300);中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展資金:玉米抗旱遺傳機制解析與種質(zhì)創(chuàng)制(Z20221343040)

張前進(1973-),男,碩士研究生,副研究員,主要從事玉米遺傳育種研究. E-mail:zqjin@126.com

通訊作者:Author for correspondence. E-mail:luxiaomin2004@163.com