譚萌萌，孫紹營(yíng)，王靜文，王依萍，燕 浩，張彥妮

(東北林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱，150040)

植物的生長(zhǎng)發(fā)育及進(jìn)化過(guò)程常常會(huì)受到干旱、低溫、高鹽等非生物脅迫的影響。DREB轉(zhuǎn)錄因子是植物中同非生物脅迫相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子之一，含有1個(gè)由60～70氨基酸殘基組成的保守結(jié)構(gòu)域，位于第14位的V(纈氨酸)和第19位的E(谷氨酸)對(duì)轉(zhuǎn)錄因子與順勢(shì)元件的結(jié)合至關(guān)重要[1-2]。DREB家族成員可以分為A1～A6亞族，A1成員主要參與冷脅迫反應(yīng)，A2成員主要參與干旱和高鹽應(yīng)激調(diào)節(jié)，A1～A2成員功能已在水稻(Oryzasativa)[3]、高粱(Sorghumbicolor)[4]、虎杖(Polygonumcuspidatum)[5]等研究中得到證實(shí)。A3～A6成員的功能與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和非生物脅迫都有一定關(guān)系，擬南芥(Arabidopsisthaliana)中屬于A5的DEAR4基因與葉片的衰老相關(guān)，可由ABA和干旱等誘導(dǎo)表達(dá)[6]；擬南芥中A6成員RAP2.4可以在干旱脅迫下激活葉片中表皮蠟的生物合成[7]，過(guò)表達(dá)菊花(Dendranthemamorifolium)A6亞族基因CmDREB6可提高菊花的耐熱性[8]。目前，已在草莓(Fragariaananassa)[9]、小麥(Triticumaestivum)[10]、油菜(Brassicanapus)[11]、水稻[12]、馬鈴薯(Solanumtuberosum)[13]等多種植物中鑒定出DREB家族成員，但對(duì)細(xì)葉百合DREB轉(zhuǎn)錄因子研究甚少。

細(xì)葉百合(Liliumpumilum)為百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)植物，花下垂，花被鮮紅，觀賞價(jià)值極高，具有較強(qiáng)的抗旱和抗病性，為百合抗性育種的重要親本[14]。目前，細(xì)葉百合的研究主要集中在雜交育種、組織培養(yǎng)等方面，關(guān)于細(xì)葉百合分子機(jī)制的研究初有進(jìn)展。近年來(lái)雖從細(xì)葉百合中鑒定出一些與非生物脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子WRKY[15]和MADS-box[16]等，但有關(guān)細(xì)葉百合DREB轉(zhuǎn)錄因子的研究鮮有報(bào)道。因此，篩選鑒定細(xì)葉百合DREB轉(zhuǎn)錄因子并分析細(xì)葉百合DREB基因在逆境下的表達(dá)模式，有助于對(duì)其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用。本研究從細(xì)葉百合轉(zhuǎn)錄組(根莖葉)中篩選出12個(gè)DREB轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并用qRT-PCR技術(shù)探究了DREB轉(zhuǎn)錄因子在干旱、低溫、ABA和高鹽脅迫下的組織表達(dá)模式，為篩選優(yōu)質(zhì)抗逆基因奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以細(xì)葉百合組培苗為研究材料，苗齡45 d，高度10 cm，具8～10個(gè)葉片，鱗莖長(zhǎng)2 cm，根部健壯，整體生長(zhǎng)狀態(tài)良好。DREB轉(zhuǎn)錄因子源自課題組已構(gòu)建的細(xì)葉百合(根莖葉)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)(未發(fā)表)。

1.2 方法

1.2.1 DREB轉(zhuǎn)錄因子的鑒定分析 以“DREB”為關(guān)鍵詞在細(xì)葉百合轉(zhuǎn)錄組“gene-expression.xlsx”文件中搜索獲得DREB基因 ID。通過(guò)基因ID在“Trinity-gene.fasta”文件中查找DREB基因序列。利用ORF finder確定DREB基因的ORF，并用CDD預(yù)測(cè)DREB基因的保守結(jié)構(gòu)域，選擇有完整的ORF和保守結(jié)構(gòu)域的DREB作為候選基因。

1.2.2 DREB蛋白的生物信息學(xué)分析 使用在線分析軟件Protparam、ProtScal、Cell-PLoc 2.0、SOPMA[17]、MEME對(duì)細(xì)葉百合DREB蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)、親/疏水性、亞細(xì)胞定位、二級(jí)結(jié)構(gòu)及保守基序分析。運(yùn)用MEGA 7.0軟件對(duì)細(xì)葉百合和擬南芥的DREB蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1.2.3 非生物脅迫下DREB基因的表達(dá)模式分析 將細(xì)葉百合幼苗置于150 μmol·L-1ABA溶液、20% PEG6000溶液、200 mmol·L-1NaCl溶液和4 ℃光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行脅迫處理。各處理于0、2、6、12 h時(shí)分別取細(xì)葉百合的根尖、鱗莖、葉片，液氮速凍并保存于 -80 ℃冰箱中。每個(gè)處理進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，每次重復(fù)3棵植株。

用OMEGA公司的提取試劑盒提取RNA，TOYOBO公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以百合的LilyActin作為內(nèi)參基因，引物序列見(jiàn)表1。qRT-PCR反應(yīng)利用Roche Light Cycer96系統(tǒng)和UltraSYBR Mixture，反應(yīng)體系為：2×UltraSYBR Mixture 10 μL，引物0.4 μL，cDNA模板為0.8 μL，用雙蒸餾水調(diào)至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 6 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 35 s，45個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算，Heatmapper在線軟件繪制熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 DREB轉(zhuǎn)錄因子的鑒定及分析

經(jīng)初步篩選，從細(xì)葉百合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中得到51個(gè)細(xì)葉百合DREB轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)剔除序列重復(fù)、無(wú)完整ORF和保守結(jié)構(gòu)域殘缺的轉(zhuǎn)錄因子，最終篩選出12個(gè)DREB轉(zhuǎn)錄因子，命名為L(zhǎng)pDREB1-LpDREB12(表1)。通過(guò)對(duì)細(xì)葉百合DREB蛋白序列的理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)(表2)：細(xì)葉百合DREB蛋白的序列長(zhǎng)度在363～648 bp，理論等電點(diǎn)在4.55～10.96，其中LpDREB2和LpDREB3為堿性蛋白質(zhì)；不穩(wěn)定系數(shù)在35.85～90.51，其中LpDREB5為穩(wěn)定性蛋白，其余為不穩(wěn)定性蛋白；脂肪系數(shù)在55.12～75.7，蛋白質(zhì)的親水指數(shù)在-0.116～-0.803，親水性最強(qiáng)的為L(zhǎng)pDREB3蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析表明(表2)，7個(gè)基因定位在細(xì)胞核內(nèi)，5個(gè)基因定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，說(shuō)明這12個(gè)DREB轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞核內(nèi)行使一定的功能。

SOPMA對(duì)細(xì)葉百合DREB蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明(表3)：12個(gè)細(xì)葉百合DREB蛋白的結(jié)構(gòu)主要由α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，延伸鏈和β轉(zhuǎn)角占比較少。所有蛋白中，LpDREB2蛋白的無(wú)規(guī)則卷曲占比最大，為64.16%；LpDREB8的α螺旋占比最大，為44.87%；除LpDREB2外，其他蛋白的α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲占比都大于25%，表明α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲對(duì)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的形成有一定影響。

2.2 DREB轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)進(jìn)化分析

為揭示細(xì)葉百合DREB轉(zhuǎn)錄因子家族的進(jìn)化關(guān)系，以61個(gè)擬南芥DREB轉(zhuǎn)錄因子家族成員作為參考，與12個(gè)細(xì)葉百合LpDREB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行系統(tǒng)的進(jìn)化分析。由圖1可見(jiàn)，細(xì)葉百合DREB轉(zhuǎn)錄因子和擬南芥DREB轉(zhuǎn)錄因子聚類(lèi)到一起，說(shuō)明細(xì)葉百合和擬南芥的DREB轉(zhuǎn)錄因子具有較高的保守性。擬南芥AT1G75490轉(zhuǎn)錄因子屬于DREBA-2亞組的成員，A-2亞組的成員都參與干旱響應(yīng)，說(shuō)明細(xì)葉百合LpDREB5、LpDREB9、LpDREB8和LpDREB7基因可能都與干旱脅迫相關(guān)。其余細(xì)葉百合DREB轉(zhuǎn)錄因子的功能也可與擬南芥等模式植物中功能明確的DREB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2.3 DREB蛋白保守基序分析

通過(guò)對(duì)細(xì)葉百合LpDREB蛋白保守基序和保守結(jié)構(gòu)域分析得出(圖2)，12個(gè)細(xì)葉百合DREB轉(zhuǎn)錄因子均有一個(gè)完整的AP2保守結(jié)構(gòu)域，所含保守基序有一定差異。其中所有基因均識(shí)別到motif 1和motif 3，表明這2個(gè)基序高度保守。LpDREB4和LpDREB11蛋白含有相同的motif，LpDREB1和LpDREB12含有相同的motif，說(shuō)明兩者氨基酸序列結(jié)構(gòu)最為相似。細(xì)葉百合DREB轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)化關(guān)系和各自的基序表明，同一進(jìn)化分支的LpDREB蛋白保守基序種類(lèi)和位置大致相同，而不同進(jìn)化分支的蛋白保守基序差異較大，由此推斷同一進(jìn)化分支的LpDREB轉(zhuǎn)錄因子的功能相似。

表1 qRT-PCR 引物序列

表2 細(xì)葉百合DREB轉(zhuǎn)錄因子的理化性質(zhì)

圖1 LpDREB轉(zhuǎn)錄因子和AtDREB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)化分析

圖2 LpDREB基因家族保守基序和保守結(jié)構(gòu)域分析

表3 細(xì)葉百合DREB蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)

2.4 非生物脅迫下DREB基因的表達(dá)分析

2.4.1 干旱脅迫下DREB基因的表達(dá)模式 細(xì)葉百合在20% PEG6000模擬干旱脅迫下(圖3A)，根中6個(gè)LpDREB基因，脅迫 12 h后表達(dá)量上調(diào)；LpDREB1基因在所有脅迫時(shí)間下表達(dá)量均低于正常水平；LpDREB12和LpDREB6基因表達(dá)量為先上升后下降。鱗莖中，3個(gè)LpDREB基因在12 h脅迫后表達(dá)量上調(diào)，2個(gè)基因在所有時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量均低于CK；LpDREB12、LpDREB2和LpDREB9基因在脅迫2 h表達(dá)量達(dá)到最高水平后隨時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)量降低至正常水平之下。葉中，5個(gè)LpDREB基因在脅迫12 h后表達(dá)量上調(diào)；LpDREB8和LpDREB9基因表達(dá)量隨時(shí)間的延長(zhǎng)表現(xiàn)為波動(dòng)變化，且波動(dòng)趨勢(shì)相似。LpDREB1基因在各部位各時(shí)間處理下表達(dá)量均下調(diào)，推測(cè)其與干旱脅迫呈負(fù)相關(guān)；LpDREB10基因在根莖中表達(dá)量無(wú)明顯變化，僅在葉中表達(dá)量上調(diào)，表明LpDREB10基因在不同組織中表達(dá)的特異性。

2.4.2 低溫脅迫下DREB基因的模式分析 細(xì)葉百合在4 ℃低溫處理下(圖3B)，根中除LpDREB3、LpDREB2和LpDREB1基因在2 h或12 h脅迫下基因表達(dá)量略高于正常水平，其余基因均無(wú)明顯變化。鱗莖中， 4個(gè)LpDREB基因表達(dá)量無(wú)明顯變化，7個(gè)LpDREB基因均在12 h脅迫后表達(dá)量高于正常水平，LpDREB12基因表達(dá)量先下降后逐漸升至上調(diào)水平。葉中，LpDREB6基因隨脅迫時(shí)間增長(zhǎng)，表達(dá)量逐漸升高，且都高于CK；LpDREB9和LpDREB12基因表達(dá)量先升高后降低；除LpDREB9和LpDREB12基因外，共10個(gè)基因在2 h或12 h 處理下上調(diào)表達(dá)。低溫處理下，LpDREB2和LpDREB3基因在所有部位都上調(diào)表達(dá)，推測(cè)LpDREB2和LpDREB3與低溫脅迫正相關(guān)。

2.4.3 鹽脅迫下DREB基因的模式分析 細(xì)葉百合在200 mmol·L-1NaCl脅迫下(圖3C)，根中LpDREB10、LpDREB4、LpDREB12、LpDREB6和LpDREB2基因表達(dá)量無(wú)明顯變化，其他基因在2 h或12 h時(shí)上調(diào)表達(dá)。莖中，LpDREB6和LpDREB12基因的表達(dá)水平呈現(xiàn)先升高后降低再升高的趨勢(shì)；除LpDREB10、LpDREB4、LpDREB7和LpDREB5基因外，所有基因在12 h處理下表達(dá)量均高于CK。葉中，LpDREB1基因表達(dá)量始終低于CK；LpDREB3、LpDREB12和LpDREB2基因表達(dá)量無(wú)明顯變化；LpDREB6基因在6 h時(shí)表達(dá)量上調(diào)，其余7個(gè)基因12 h脅迫后上調(diào)表達(dá)。鹽脅迫下，LpDREB9和LpDREB11基因在根莖葉中均上調(diào)表達(dá)，推斷LpDREB9和LpDREB11基因與植物耐鹽性正相關(guān)。

圖3 細(xì)葉百合LpDREB基因表達(dá)水平熱圖

2.4.4 ABA脅迫下DREB基因的模式分析 細(xì)葉百合在150 μmol·L-1ABA脅迫下(圖3D)，根中LpDREB3基因在各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量都低于CK；LpDREB11基因表達(dá)量隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)量逐漸增加，6 h時(shí)增至上調(diào)水平；LpDREB4和LpDREB5基因脅迫 12 h時(shí)表達(dá)量升至上調(diào)水平。莖中，除LpDREB5基因表達(dá)量無(wú)明顯變化，其余基因在6 h脅迫后表達(dá)量均有不同程度提高，且4個(gè)基因在12 h脅迫后表達(dá)量持續(xù)高于正常水平。葉中，4個(gè)基因表達(dá)量無(wú)明顯變化，8個(gè)基因分別在2、6 h或12 h時(shí)，表達(dá)量有不同程度上調(diào)。脫落酸脅迫下，LpDREB4和LpDREB11基因在各部位不同脅迫時(shí)間點(diǎn)下均上調(diào)表達(dá)，表明這2個(gè)基因與脫落酸脅迫調(diào)節(jié)機(jī)制正相關(guān)。

3 結(jié)論與討論

從細(xì)葉百合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中最終得到12個(gè)細(xì)葉百合LpDREB轉(zhuǎn)錄因子，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，7個(gè)LpDREB轉(zhuǎn)錄因子定位在細(xì)胞核中，5個(gè)LpDREB轉(zhuǎn)錄因子定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。轉(zhuǎn)錄因子主要在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮作用，所以一般多定位在細(xì)胞核內(nèi)。有研究表明，一些轉(zhuǎn)錄因子可分布在細(xì)胞質(zhì)中作為結(jié)構(gòu)蛋白參與細(xì)胞質(zhì)的重要反應(yīng)[18]，針對(duì)這一現(xiàn)象可以開(kāi)展關(guān)于細(xì)葉百合DREB轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)研究。蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲是細(xì)葉百合DREB蛋白二級(jí)機(jī)構(gòu)的主要組成部分。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明 ，12個(gè)細(xì)葉百合DREB轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥DREB家族聚類(lèi)在一起，表明2個(gè)家族成員具有較高的同源性。通過(guò)對(duì)細(xì)葉百合DREB轉(zhuǎn)錄因子的研究，豐富了細(xì)葉百合基因家族的信息，為進(jìn)一步研究細(xì)葉百合DREB轉(zhuǎn)錄因子奠定了理論基礎(chǔ)。

為探求細(xì)葉百合DREB轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫下的表達(dá)模式，對(duì)細(xì)葉百合進(jìn)行了干旱、低溫、高鹽和ABA脅迫處理。干旱脅迫下，LpDREB1基因在根莖葉中表達(dá)量都低于正常水平，推測(cè)其與干旱脅迫負(fù)相關(guān)；11個(gè)LpDREB基因在根莖葉中被不同程度的誘導(dǎo)表達(dá)，且具有一定時(shí)序性。前人研究發(fā)現(xiàn)，干旱頻發(fā)環(huán)境下，DREBs賦予作物多種非生物脅迫耐受性，并且DREBs可能具有提高作物水分利用效率的潛力[19]。因此，可以推測(cè)細(xì)葉百合DREB轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)控干旱脅迫的潛力。低溫處理下，LpDREB2基因在細(xì)葉百合根莖葉中均有不同程度上調(diào)，其中葉中表達(dá)量最高，根中表達(dá)量最低。研究結(jié)果表明，細(xì)葉百合相同基因在不同部位對(duì)于脅迫的應(yīng)答模式存在不同。鹽脅迫下，LpDREB12和LpDREB10基因在莖或葉中上調(diào)表達(dá)，在其他組織中無(wú)明顯變化。DREB轉(zhuǎn)錄因子的組織表達(dá)特異性已在大豆(Glycinemax)[20]、甘蔗(Saccharumspontaneum)[21]和菠蘿(Ananascomosus)[22]、側(cè)金盞花(Adonisamurensis)[23]等多種植物中報(bào)道，細(xì)葉百合LpDREB轉(zhuǎn)錄因子在根、莖、葉組織中的差異表達(dá)，暗示細(xì)葉百合在生長(zhǎng)發(fā)育中功能的多樣性以及應(yīng)對(duì)逆境的差異性。細(xì)葉百合在干旱、鹽和低溫脅迫下，部分LpDREB基因隨脅迫時(shí)間的變化表達(dá)量呈波動(dòng)狀態(tài)，這與苦蕎麥(Fagopyrumtataricum)中FtDREB1和FtDREB2[24]的變化趨勢(shì)相似。可能是非生物脅迫下，細(xì)葉百合LpDREB基因需要經(jīng)過(guò)一個(gè)啟動(dòng)期才能被誘導(dǎo)表達(dá)，而一個(gè)功能基因又受到多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，不同基因之間相互制約，表達(dá)量交替變化的結(jié)果。細(xì)葉百合LpDREB在應(yīng)對(duì)非生物脅迫時(shí)基因表達(dá)量均有顯著變化，說(shuō)明LpDREB基因在應(yīng)對(duì)逆境脅迫時(shí)發(fā)揮重要作用。

近年來(lái)的研究表明，植物對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)包括ABA依賴途徑和非ABA依賴途徑[25]。在擬南芥中過(guò)表達(dá)OsDREB1F，干旱脅迫能激活A(yù)BA依賴的脅迫響應(yīng)基因RD29B和RAB18的表達(dá)，同時(shí)ABA也可以直接誘導(dǎo)OsDREB1F的表達(dá)，說(shuō)明OsDREB1F通過(guò)2種途徑參與對(duì)干旱脅迫的調(diào)控[26]。麝香百合(L.longiflorum)LlDREB1G在低溫下被誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)LlDREB1G擬南芥植株的功能研究 ，推測(cè)其可能以ABA依賴途徑和非依賴途徑參與非生物脅迫表達(dá)[27]。熒光定量結(jié)果顯示，LpDREB4和LpDREB5基因能夠被ABA和干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)且變化趨勢(shì)相同，推測(cè)LpDREB4和LpDREB5可能通過(guò)2種途徑參與對(duì)干旱脅迫的應(yīng)答。干旱脅迫會(huì)引起植物體內(nèi)ABA的積累，從而使氣孔開(kāi)度和光合速率降低，進(jìn)而阻礙植物的生長(zhǎng)發(fā)育。因此，后續(xù)可繼續(xù)開(kāi)展試驗(yàn)闡明ABA與細(xì)葉百合干旱適應(yīng)性的關(guān)系，為合理應(yīng)用外源激素提供理論依據(jù)。植物應(yīng)對(duì)各種逆境脅迫誘導(dǎo)時(shí)，DREB轉(zhuǎn)錄因子參與植物應(yīng)答脅迫反應(yīng)的重要過(guò)程[28]。因此，研究細(xì)葉百合DREB轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)獲得抗性新品種具有重要意義。

本研究對(duì)篩選鑒定出的12個(gè)細(xì)葉百合LpDREB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了生物信息學(xué)和組織表達(dá)特異性分析，推測(cè)出部分基因的功能性。然而，僅憑表達(dá)分析模式判定個(gè)別基因的功能并不完全可信，影響其功能表達(dá)的因素較多。因此，今后可通過(guò)克隆細(xì)葉百合LpDREB基因并在細(xì)葉百合中過(guò)表達(dá)或抑制表達(dá)驗(yàn)證其功能性。