張 龍， 古麗·庫爾班， 張紹會， 馬小麗

新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆生物資源基因工程重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830046

蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthurngiensis， Bt)在芽孢形成過程中產(chǎn)生殺蟲晶體蛋白(insecticidal crystal proteins， ICPs)和在對數(shù)生長中期分泌營養(yǎng)期殺蟲蛋白(vegetative insecticidal proteins， Vips)(Estruchetal.，1996)。ICPs分為Cry殺蟲蛋白和Cyt殺蟲蛋白2類，其中，Cry殺蟲蛋白是目前應(yīng)用最廣泛的Bt殺蟲蛋白，其亞組達(dá)79個(Clairmontetal.，1998； Schnepfetal.，1998； https:∥camtech-bpp.ifas.ufl.edu/old_name_new_name/)。Bt殺蟲蛋白只對靶標(biāo)害蟲(主要是鱗翅目、雙翅目和鞘翅目昆蟲)起作用，對人畜及生態(tài)環(huán)境無害(Sanahujaetal.，2011; Schnepfetal.，1998)。將Bt殺蟲蛋白基因轉(zhuǎn)到棉花GossypiumherbaceumLinn.、玉米ZeamaysL.、水稻OryzasativaL.、甘蔗SaccharumofficinarumL.,、茄子SolanummelongenaL.和大豆Glycinemax(Linn.) Merr.等農(nóng)作物中，可有效減少靶標(biāo)害蟲對農(nóng)作物的危害。然而，自1989年小菜蛾P(guān)lutellaxylostella(L.)被報道對Bt殺蟲蛋白產(chǎn)生抗性以來(Tabashniketal.,1990)，害蟲對Bt殺蟲蛋白的抗性呈逐年增長的趨勢。

目前,Bt殺蟲蛋白殺蟲機(jī)制和鱗翅目昆蟲對Bt殺蟲蛋白抗性機(jī)制尚未研究清楚。Bt殺蟲蛋白殺蟲機(jī)制主要有Bravo模型(Knowles & Ellar，1987)、Zhang模型(Zhangetal.，2005)及Jurat-Fuentes模型(Jurat-Fuentes & Adang，2006)等；昆蟲對Bt殺蟲蛋白抗性機(jī)制主要有促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase， MAPK)信號通路模型(康師，2018; Guoetal.，2015)和CAD錯誤定位(cadherin mislocalization)模型(Xiaoetal.，2017)等。

目前,普遍接受的Bt殺蟲蛋白殺蟲機(jī)制主要經(jīng)歷3個階段：

(1)活化。Bt原毒素(分子質(zhì)量130～140 ku)被昆蟲取食后以晶體形式進(jìn)入中腸，隨即被堿性消化液和相應(yīng)蛋白水解酶識別并水解為55～65 ku的活化殺蟲蛋白核心。N端測序表明,Bt殺蟲蛋白的酶切位點在結(jié)構(gòu)域I的螺旋α-1前端的Arg28處(Liu，2020)；

(2)結(jié)合?；罨臍⑾x蛋白穿過圍食膜(peritrophic membrane， PM)，并與昆蟲中腸刷狀緣膜囊泡(brush-border membrane vesicles, BBMV)受體結(jié)合。一種模型表明，Cry殺蟲蛋白單體與鈣黏蛋白(cadherin， CAD)結(jié)合后，會進(jìn)一步加工形成殺蟲蛋白低聚物(oligomer)，該低聚物與氨肽酶N(aminopeptidase N， APN)或堿性磷酸酶(alkaline phosphatase， ALP)結(jié)合(Arenasetal.，2010)，然后通過糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol， GPI)錨定結(jié)合到細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)。另一種模型認(rèn)為，Cry殺蟲蛋白低聚物與CAD結(jié)合后通過激活腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase， AC)信號傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death， PCD)(Zhangetal.，2006)。另外，ABC轉(zhuǎn)運蛋白(ATP-binding cassette transporter， ABC)也作為Bt受體而參與到鱗翅目昆蟲中毒過程中，小菜蛾P(guān)xABCC2促進(jìn)小菜蛾中Cry1Ac殺蟲蛋白的低聚(oligomerization)和低聚物插入細(xì)胞膜中(Ocelotletal.，2017)，且PxABC與PxCAD協(xié)同促進(jìn)小菜蛾Cry抗性水平(Maetal.，2019)。

(3)成孔。殺蟲蛋白寡聚物與受體結(jié)合后被插入中腸細(xì)胞膜形成膜孔，從而改變細(xì)胞滲透性使細(xì)胞裂解死亡，進(jìn)而導(dǎo)致昆蟲死亡。

根據(jù)目前普遍接受的Bt殺蟲蛋白殺蟲機(jī)制，鱗翅目昆蟲對Bt殺蟲蛋白的抗性機(jī)制主要分為3類：①鱗翅目昆蟲中腸蛋白酶活化Bt殺蟲蛋白的能力改變，主要是胰蛋白酶(trypsin)和胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)(Guoetal.，2019； Zhangetal.，2019)；②Bt活化殺蟲蛋白核心(Bt activated toxin core)與鱗翅目昆蟲中腸Bt受體的結(jié)合能力及結(jié)合位點數(shù)量的改變(Bravoetal.，2011； Wangetal.，2018a)；③鱗翅目昆蟲信號調(diào)控通路改變。目前,普遍認(rèn)為第二類是鱗翅目昆蟲產(chǎn)生Bt抗性的最主要原因。在鱗翅目昆蟲中，研究最為透徹的Bt受體是Cry受體，位于鱗翅目昆蟲中腸BBMV細(xì)胞膜上，已經(jīng)被證實的鱗翅目昆蟲中腸Cry受體有APN、CAD、ALP、ABC等。

1 鱗翅目昆蟲Bt殺蟲蛋白受體

1.1 氨肽酶N

氨肽酶N是最早發(fā)現(xiàn)的鱗翅目昆蟲中腸Bt受體(Knightetal.，1994)。據(jù)研究，鱗翅目昆蟲中腸APN在系統(tǒng)發(fā)育上分為8個族，依次命名為APN1～8(Weietal.，2016)，這些APNs都具有以下常見特征：(1)是一類可切割肽鏈N末端中性氨基酸的酶，常與內(nèi)肽酶和羧肽酶協(xié)同發(fā)揮作用(Wangetal.，2005)；(2)C端通過GPI識別并結(jié)合在鱗翅目昆蟲中腸BBMV細(xì)胞膜表面(Lu & Adang，1996； Takesueetal.，1992)；(3)多含有谷氨酸鋅化氨肽酶(gluzincinaminopeptidase)的保守元件GAMEN基序和鋅結(jié)合基序，成熟APN分子質(zhì)量在90～170 ku(Pigott & Ellar，2007)；(4)與Cry殺蟲蛋白的結(jié)合方式不盡相同，某些APN可與多種Cry殺蟲蛋白結(jié)合，而某些Cry殺蟲蛋白可與多個APNs結(jié)合。

APN各族之間存在結(jié)構(gòu)差異。APN5具有GAMEN基序的變化形式，其中甲硫氨酸被替換為蘇氨酸(Pigott & Ellar，2007)。APN1和APN3在GPI序列的下游為蘇氨酸富含區(qū)，該區(qū)域具有廣泛的O-連接糖基化，被認(rèn)為可能是Cry1Ac殺蟲蛋白的結(jié)合位點(Knightetal.，2003)，棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Hübner)的HaAPN1和HaAPN2雖然都含有一個O-連接糖基化位點富集區(qū)(高美靜，2017)，但分別敲除棉鈴蟲易感品系SCD中這2個APNs基因后，對Cry1A或Cry2A殺蟲蛋白的敏感性均無顯著變化(Wangetal.，2020b)。鱗翅目昆蟲APN主要通過與Cry殺蟲蛋白結(jié)合使易感昆蟲中腸細(xì)胞膜成孔而改變細(xì)胞膜的滲透性，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞裂解。APN作為Cry殺蟲蛋白的受體，含有與Cry殺蟲蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)域或結(jié)合位點，如美國白蛾Hyphantriacunea(Drury)中腸APN3的谷氨酸鋅化氨肽酶結(jié)構(gòu)域可與Cry1Ac殺蟲蛋白特異性結(jié)合(王翠蘋等，2016)。

APN作為Cry受體,在不同種類鱗翅目昆蟲中也不相同，有的鱗翅目昆蟲APN作為專一的Cry受體，有的鱗翅目昆蟲APN卻不與某種Cry殺蟲蛋白唯一結(jié)合。家蠶BombyxmoriL.BmAPN6 (林平等，2018)和二點委夜蛾AthetislepigoneMschler AlAPN5 (Wangetal.，2017)都僅作為Cry1Ac殺蟲蛋白的功能性受體，而水稻害蟲二化螟ChilosuppressalisWalker CsAPN6和CsAPN8都參與了Cry1Ac/Cry1Ab和Cry1Ca殺蟲蛋白的毒性作用(Sunetal.，2020)。

不同種類鱗翅目昆蟲在不同發(fā)育階段及不同部位、不同APNs的表達(dá)量也不盡相同。水稻二化螟CsAPN6在4齡期前腸中高表達(dá)，而CsAPN8在成蟲和蛹中高表達(dá)(Sunetal.，2020)；甘蔗二點螟ChiloinfuscatellusSnellen CiAPN1、CiAPN2、CiAPN3、CiAPN4、CiAPN7和CiAPN8在6齡期表達(dá)水平最高，而在5齡期的表達(dá)水平較低(Wangetal.，2019a)；在棉鈴蟲中，除HaAPN7等少數(shù)APN外，其他HaAPNs在中腸組織中均高表達(dá)(高美靜，2017)。

1.2 鈣黏蛋白

鈣黏蛋白是定位于昆蟲中腸BBMV上重要的Cry受體，CAD首次在煙草天蛾Manducasexta(L.)中被鑒定為Bt受體(Vadlamudietal.，1995)。CAD為單鏈糖蛋白，其糖基化對于Bt殺蟲蛋白與之結(jié)合至關(guān)重要。鱗翅目昆蟲CAD結(jié)構(gòu)相似，常以單跨膜結(jié)構(gòu)域錨定在細(xì)胞膜上，其結(jié)構(gòu)一般包括一個N末端信號肽(signal peptide， SIG)、8～12個鈣黏蛋白重復(fù)序列(cadherin repeats， CR)、一個膜近端細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(membrane-proximal extracellular domain， MPED)、一個跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane domain， TM)和一個細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(cytoplasmic domain， CYTO)，有的鱗翅目昆蟲CAD還有前蛋白區(qū)(proprotein region， PRO)，大多數(shù)鱗翅目昆蟲Cry殺蟲蛋白結(jié)合域(toxin binding domain， TBD)位于膜近端CR7-MPED附近。CAD至少有6個亞家族(Nolletetal.，2000)，最初被認(rèn)為是細(xì)胞黏附分子，現(xiàn)已知CAD參與細(xì)胞識別、細(xì)胞信號傳導(dǎo)、細(xì)胞通訊和形態(tài)發(fā)生等多個生物學(xué)過程(Angstetal.，2001)。

CAD與Cry殺蟲蛋白結(jié)合后通過促進(jìn)Cry殺蟲蛋白N末端區(qū)域的去除而誘導(dǎo)Cry殺蟲蛋白低聚，從而有利于Cry殺蟲蛋白低聚物與APN或ALP結(jié)合。Cad基因突變多為隱性等位基因遺傳，并導(dǎo)致CR區(qū)域內(nèi)發(fā)生變化，這種突變通常僅由幾個或幾十個氨基酸的取代、插入或缺失導(dǎo)致。棉紅鈴蟲Pectinophoragossypiella(Saunders)的Cry1Ac抗性與PgCAD 3個氨基酸取代(I1100V、I1107T和K1682R)(Fabricketal.，2019)，或PgCad基因中插入3370 bp (r15)堿基(Wangetal.，2019c)密切相關(guān)。煙芽夜蛾Heliothisvirescens(F.)和煙草天蛾的CAD氨基酸序列中的Leu (1425)和Phe (1429)對CAD與Cry1Ac殺蟲蛋白相互作用至關(guān)重要(Xieetal.，2005)。棉鈴蟲HaCad等位基因r15突變導(dǎo)致CYTO中55個氨基酸殘基缺失，體外表達(dá)的突變型HaCAD沒有Cry1Ac殺蟲蛋白的TBR，證明HaCAD賦予棉鈴蟲Cry1Ac抗性(Zhang，2017a)。

鱗翅目昆蟲可能通過CAD錯誤定位賦予其Bt抗性。棉鈴蟲抗性品系96CAD的HaCAD包含35個氨基酸取代，其中D172G取代將造成HaCAD定位錯誤，即易感品系96S的HaCAD位于細(xì)胞膜上，而96CAD的HaCAD保留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，說明HaCAD定位錯誤可能與Cry1Ac抗性有關(guān)(Xiaoetal.，2017)。棉紅鈴蟲PgCad1(r16)外顯子20中插入1545個堿基對的簡并轉(zhuǎn)座子后產(chǎn)生一個剪接錯誤的轉(zhuǎn)錄本(包含一個提前終止密碼子)，r16等位基因通過干擾CAD的定位導(dǎo)致棉紅鈴蟲產(chǎn)生Cry1Ac抗性(Wangetal.，2019b)。鱗翅目昆蟲還可能通過調(diào)控Cad的長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)的表達(dá)賦予其對Bt殺蟲蛋白產(chǎn)生抗性。棉紅鈴蟲可能通過破壞PgCAD等位基因內(nèi)含子20中的一個lncRNA (Lietal.，2019)的下調(diào)表達(dá)降低PgCAD基因(PgCad1)的轉(zhuǎn)錄，使得PgCAD的豐度明顯降低(Fabricketal.，2019)，從而增強棉紅鈴蟲對Cry1Ac殺蟲蛋白的抗性。

另外，鱗翅目昆蟲CAD還可通過其他方式賦予昆蟲Bt抗性。棉紅鈴蟲PgCad突變等位基因(具有207個堿基對缺失導(dǎo)致缺乏編碼其跨膜結(jié)構(gòu)域)通過破壞CAD的細(xì)胞運輸而賦予其Cry1Ac抗性(Wangetal.，2018b);棉鈴蟲HaCAD的胞外域和胞質(zhì)域均參與CrylAc殺蟲蛋白中毒(Zhang，2017);澳大利亞棉鈴蟲Helicoverpapunctigera(Wallengren)HpCad基因剪接位點的單核苷酸多態(tài)性導(dǎo)致內(nèi)含子的部分轉(zhuǎn)錄和過早產(chǎn)生終止密碼子，但Cry1Ac結(jié)合到澳大利亞棉鈴蟲BBMV不受HpCad基因破壞的影響(Walshetal.，2018)。

不同鱗翅目昆蟲CAD與Bt殺蟲蛋白結(jié)合能力不同，如小菜蛾P(guān)xCAD和棉鈴蟲HaCAD都被證實為Cry1Ac受體，但小菜蛾P(guān)xCAD與Cry1Ac的結(jié)合水平較棉鈴蟲HaCAD低(Gaoetal.，2019)。有的鱗翅目昆蟲CAD與Cry殺蟲蛋白專一性結(jié)合；有的鱗翅目昆蟲CAD雖可與多種Cry殺蟲蛋白結(jié)合，但CAD所起的作用可能不同。體外表達(dá)的二化螟CsCAD肽(CsCad-CR11-MPED)以高親和力特異性結(jié)合CrylAb殺蟲蛋白，但不與Cry1C殺蟲蛋白結(jié)合，敲除CsCAD降低了其幼蟲對Cry1Ab殺蟲蛋白的敏感性，但沒有降低其幼蟲對Cry1C殺蟲蛋白的敏感性，這表明CsCAD在二化螟幼蟲的Cry1Ab和Cry1C中毒過程中起著不同的作用(Duetal.，2019)。

有的鱗翅目昆蟲只表達(dá)一種CAD，有的鱗翅目昆蟲可表達(dá)多種CAD，且不同發(fā)育階段和作用方式不盡相同。小菜蛾P(guān)xCAD1可使幼蟲的死亡率上升，而PxCAD2則不能增強Cry1Ac殺蟲蛋白的殺蟲活性(龔莉君等，2016)。二化螟CsCAD1在5齡期和6齡期幼蟲中腸中高表達(dá)，而CsCAD2的表達(dá)水平在每個發(fā)育階段均相等(Zhang，2017)。

1.3 堿性磷酸酶

堿性磷酸酶是一組通過水解磷酸單酯，將底物分子中的磷酸基團(tuán)去除的同工金屬酶，水解底物包括核酸、氨基酸、蛋白、生物堿甚至生物殺蟲蛋白等，ALP在堿性環(huán)境中具有最佳活性(Vimalraj，2020)。完整的ALP分子呈現(xiàn)典型的α/β拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，與很多分泌蛋白一樣，ALP在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)合成N末端帶有信號肽的前體，信號肽引導(dǎo)前體跨內(nèi)膜運輸后被切除，形成同源二聚體(Renetal.，2017)。同一昆蟲中以不同形式存在的ALP具有不同的作用，如家蠶中腸中存在膜結(jié)合ALP (membrane bound ALP， m-ALP，通過GPI錨定在細(xì)胞膜上，參與營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收)和可溶性ALP (soluble forms ALP， s-ALP，位于杯狀細(xì)胞內(nèi)腔，參與離子平衡調(diào)控)2種ALP同工酶(何華偉等，2017； Yamamotoetal.，1991)。ALP已被證實存在于鱗翅目、同翅目、雙翅目、膜翅目和直翅目等昆蟲中，但目前鱗翅目昆蟲中ALP的研究較有限。

鱗翅目昆蟲m-ALP作為Bt受體，通過GPI錨定在昆蟲中腸BBMV細(xì)胞膜表面，m-ALP與被CAD誘導(dǎo)的Bt殺蟲蛋白低聚物結(jié)合有助于后者插入細(xì)胞膜導(dǎo)致細(xì)胞成孔死亡，m-ALP突變導(dǎo)致鱗翅目昆蟲對Bt殺蟲蛋白產(chǎn)生抗性(Renetal.，2017)。鱗翅目昆蟲體內(nèi)的m-ALP曾被認(rèn)為是Cry1Ac殺蟲蛋白的專一性受體，如美洲棉鈴蟲Helicoverpazea(Boddie) HzALP2是Cry1Ac殺蟲蛋白的受體(Weietal.，2019a)，亞洲玉米螟OstriniafurnacalisGuenee OfALP的一個37 ku片段(D173～D473殘基)能夠與Cry1Ac殺蟲蛋白結(jié)合(Jinetal.，2015)。但有研究表明，鱗翅目昆蟲體內(nèi)m-ALP也可與其他Bt殺蟲蛋白結(jié)合，異源表達(dá)的草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda(J.E.Smith) Sfm-ALP可與Cry1Fa殺蟲蛋白特異性結(jié)合，且Sfm-ALP下調(diào)表達(dá)與Cry1Fa抗性有關(guān)(Jakkaetal.，2016)，甜菜夜蛾SpodopteraexiguaHübner SeALP1、SeALP2和SeALP4參與了Cry1Ca殺蟲蛋白中毒過程(Renetal.，2017)。

棉鈴蟲HaALP的Cry1Ac殺蟲蛋白結(jié)合片段(HaALP1f)能增加易感品系和抗性品系在Cry1Ac殺蟲蛋白處理下的死亡率，首次證明ALP的殺蟲蛋白結(jié)合片段與Bt殺蟲蛋白間存在協(xié)同作用(Chenetal.，2015)。Cry1Ac殺蟲蛋白可與棉鈴蟲HaALP上的N-乙酰半乳糖胺(N-acetyl-β-D-galactosamine，GalNAc)特異性結(jié)合，并且可以通過糖基化的改變或GalNAc的存在來防止Cry1Ac殺蟲蛋白結(jié)合(Ningetal.，2010)，這為棉鈴蟲的防治提供了一種方案。

不同種類的ALPs在鱗翅目昆蟲不同發(fā)育階段差異表達(dá)，如甘蔗二點螟CiALP2和CiALP3在幼蟲2齡期和4齡期的表達(dá)量最高(Wangetal.，2019a)。甜菜夜蛾SeALP2可與活化的Cry1Ac殺蟲蛋白結(jié)合，且在整個幼蟲期均表達(dá)，但不同齡期的表達(dá)量差異顯著，在幼蟲4齡期表達(dá)量最高(袁向東等，2017)。

1.4 ABC轉(zhuǎn)運蛋白

ABC轉(zhuǎn)運蛋白，全稱ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白，是一類廣泛存在于原核生物和真核生物體內(nèi)的ATP能量驅(qū)動泵超家族，對離子、氨基酸、葡萄糖、多肽及殺蟲蛋白等小分子進(jìn)行主動跨膜轉(zhuǎn)運。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的ABC轉(zhuǎn)運蛋白種類很多，采用系統(tǒng)發(fā)育分析方法將ABC分為ABCA～H 8個不同的亞家族，ABCB家族的成員最初被稱為P-糖蛋白(P-glycoprotein， P-gp)(Heckel，2012； Jeongetal.，2015)。

ABC是膜整合蛋白，其完整結(jié)構(gòu)包括高度保守的2個跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane domain， TMD)和2個胞質(zhì)側(cè)核苷酸結(jié)合域(nucleotide-binding domain， NBD)2部分。TMD形成水性通道，含有底物結(jié)合位點，通常包含幾個跨膜螺旋，如小菜蛾P(guān)xABCC2和PxABCC3的2個跨膜結(jié)構(gòu)域(TMD1和TMD2)都具有6個跨膜螺旋(Baxteretal.，2011； Liuetal.，2020b)，相鄰跨膜螺旋在胞外側(cè)形成胞外環(huán)(extracellular loops， ECLs)。NBD將ATP的結(jié)合水解與物質(zhì)運輸相偶聯(lián)，具有幾個保守基序：walker A基序、Q環(huán)、signature基序和walker B基序(Heckel，2012； Liuetal.，2020b)。每種ABC都有底物特異性，ABC各成員之間既存在共性，又存在差異。另外，有的ABC僅由一個TMD和一個NBD組成，但依然能行使完整ABC功能。

自2011年小菜蛾P(guān)xABCC2首次被報道作為Cry1Ac殺蟲蛋白的受體以來(Baxteretal.，2011)，鱗翅目昆蟲ABC家族被認(rèn)為是Bt殺蟲蛋白的受體而受到越來越多的關(guān)注。棉紅鈴蟲PgABCA2與Cry2Ab抗性有關(guān)(Mathewetal.，2018)；草地貪夜蛾SfABCC2是Cry1Fa殺蟲蛋白和Cry1A.105殺蟲蛋白的受體(Flageletal.，2018)；亞洲玉米螟Cry1Ab和Cry1Ac抗性品系中OfAbcg基因的轉(zhuǎn)錄顯著下調(diào)(Zhang，2017b)；棉鈴蟲HaABCC1跨膜區(qū)TMD1和TMD2片段蛋白均能與活化的Cry1Ac殺蟲蛋白在體外結(jié)合，且抗性品系HaABCC1的表達(dá)量顯著降低(陳琳等，2019)。

已知ABC主要存在于鱗翅目昆蟲中腸BBMV中，其作用機(jī)制尚有許多不明之處。在小菜蛾中，PxABCC2促進(jìn)Cry1Ac殺蟲蛋白的低聚并促進(jìn)低聚物插入細(xì)胞膜中(Ocelotletal.，2017)。在鱗翅目昆蟲中研究較為深入的是ABCC2和ABCC3，可能主要作為各種Cry1殺蟲蛋白的受體(Endoetal.，2017)，ABCC2和ABCC3的ECLs起到關(guān)鍵作用。一些鱗翅目昆蟲ABCC2的ECL1的單個氨基酸殘基的不同[草地貪夜蛾SfABCC2的氨基酸Q(125)、斜紋夜蛾Spodopteralitura(Fab.) SlABCC2的氨基酸E(125)及棉鈴蟲HaABCC2氨基酸Q(122)]導(dǎo)致其對Cry1Ac殺蟲蛋白的敏感性不同(Liuetal.，2018)，SfABCC2也作為Cry1F的功能性受體(Jinetal.，2021)。家蠶BmABCC2的ECL2上的234位的酪氨酸插入賦予家蠶Cry1Ab殺蟲蛋白和Cry1Ac抗性(Tanakaetal.，2013)；BmABCC2突變體的ECL4的(DYWL773)-D-770包含與CrylAa的假定結(jié)合位點(Tanakaetal.，2017)。構(gòu)建的BmABCC3突變體(其中包含家蠶Cry1Ab易感品系A(chǔ)BCC2的胞外環(huán)ECL1或ECL3 3個氨基酸殘基的插入)對Cry1Aa殺蟲蛋白和Cry1Ab殺蟲蛋白的活性增加，而在家蠶Cry1Ab抗性品系A(chǔ)BCC2的ECL2插入一個Tyr殘基后，與Cry1Ab殺蟲蛋白的親和力降低，但對Cry1Aa的結(jié)合力卻顯著升高，這表明BmABCC的ECL結(jié)構(gòu)決定了其對Cry殺蟲蛋白的特異性(Endoetal.，2018)。

ABCC2和ABCC3在鱗翅目昆蟲Bt殺蟲蛋白抗性機(jī)制中可能存在某種替代關(guān)系。棉鈴蟲HaAbcc2或HaAbcc3的單突變幾乎沒有影響其對Cry1Ac殺蟲蛋白的敏感性，而HaAbcc2和HaAbcc3的雙突變導(dǎo)致棉鈴蟲Cry1Ac抗性增強超過15000倍，說明HaABCC2或HaABCC3單獨存在就足以使棉鈴蟲對Cry1Ac殺蟲蛋白敏感(Wang，2020c)。在小菜蛾中也有相似的結(jié)果，小菜蛾敏感品系(G88)中同時發(fā)生PxAbcc2和PxAbcc3組合突變使得小菜蛾產(chǎn)生比PxAbcc2突變(PxAbcc2內(nèi)含子6的3′剪接點的點突變導(dǎo)致PxAbcc2錯接)或PxAbcc3突變(PxAbcc3的cDNA在2131處的點突變導(dǎo)致PxAbcc3過早終止)更高水平的Cry1Ac抗性(Liuetal.，2020b)。

鱗翅目昆蟲中腸ABC的表達(dá)受到多種因素的調(diào)控。小菜蛾的Cry1A抗性與MAPK信號通路上游的四級信號級聯(lián)放大(MAP4K4)基因轉(zhuǎn)錄激活后反式調(diào)控多個中腸Cry1Ac抗性基因差異表達(dá)相關(guān)，這些抗性基因包括PxAbcc1-3、PxAbcg1和Pxm-Alp等(康師，2018)。叉頭框蛋白A(forkhead box protein A， FoxA)可上調(diào)棉鈴蟲HaAbcc2基因和斜紋夜蛾SlAbcc3基因的表達(dá)，而較低的FoxA表達(dá)與鱗翅目昆蟲幼蟲Cry抗性相關(guān)(Lietal.，2017)。從棉鈴蟲、小菜蛾和斜紋夜蛾3種鱗翅目昆蟲的Abcc2的編碼序列(coding sequence， CDS)中鑒定出microRNA-998-3p(或miR-998-3p)的保守靶位點，注射microRNA-998-3p拮抗劑可以顯著降低3種鱗翅目昆蟲ABCC2的豐度，同時增加3種幼蟲的Cry1Ac抗性(Zhuetal.，2010)。

1.5 其他鱗翅目昆蟲Bt受體

類鈣黏蛋白(cadherin-like protein， CaLP)存在于多種鱗翅目昆蟲中，包括家蠶、小菜蛾、二化螟、棉鈴蟲、美洲棉鈴蟲、煙草天蛾等，CaLP參與Bt抗性的重要性可能因不同鱗翅目昆蟲而異(Stevensetal.，2017)，小菜蛾P(guān)xCaLP的CR7-CR11片段在變性和非變性條件下均顯示有與Cry1Ac殺蟲蛋白結(jié)合的能力(Huetal.，2017)。棉鈴蟲四跨膜蛋白(tetraspanin)基因中的一個點突變賦予棉鈴蟲Cry1Ac顯性抗性(Jinetal.，2018)。聚鈣蛋白(polycalin， pentadecacalin)首先在家蠶中被證實為一種載脂蛋白(Mauchampetal.，2006)，在許多鱗翅目昆蟲中，聚鈣蛋白已被證實是Cry殺蟲蛋白的結(jié)合蛋白，棉鈴蟲聚鈣蛋白可以與Cry1Ac特異性地相互作用(Wangetal.，2020a)。ABCG4、胰蛋白酶(trypsin)、熱休克蛋白70 (heat shock protein 70， HSP70)、肌動蛋白(actin)、糖基磷脂酰肌醇錨定附著蛋白1 (glycosylphosphatidylinositol anchor attachment 1 protein， GAA1)和溶質(zhì)載體家族30成員1(solute carrier family 30 member 1， SLC30A1)等可能與小菜蛾對Cry1Ac殺蟲蛋白的抗性有關(guān)(Xiaetal.，2016)。此外，同一Bt殺蟲蛋白可能與鱗翅目昆蟲中腸不同BBMV受體結(jié)合，如Cry1Ab1殺蟲蛋白與小菜蛾中腸液中胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶(trypsin-like serine proteases)和Dorsal蛋白結(jié)合，而在甜菜夜蛾中腸液中與過氧化物酶C (peroxidase-C， POX-C)結(jié)合(Luetal.，2017)。

鱗翅目昆蟲中與Vip殺蟲蛋白和Cyt殺蟲蛋白結(jié)合的受體研究較有限，總體而言,Vip殺蟲蛋白與鱗翅目昆蟲中腸受體的結(jié)合方式與Cry殺蟲蛋白相似，但結(jié)合位點與Cry殺蟲蛋白不同(張謙，2010； Chenetal.，2017； Leeetal.，2006)。Vip3Aa殺蟲蛋白可使海灰翅夜蛾Spodopteralittoralis(Boisduval)幼蟲的中腸組織細(xì)胞質(zhì)空泡化、BBMV破壞和細(xì)胞解體等(Abdelkefi-Mesratietal.，2011)。研究表明，Vip3Aa殺蟲蛋白的C末端結(jié)構(gòu)域(從510氨基酸到C端)是賦予Vip3蛋白質(zhì)特異性的區(qū)域(Gomis-Cebollaetal.，2020)。Vip3Aa18殺蟲蛋白的C端536～667區(qū)段氨基酸殘基可能與昆蟲中腸受體結(jié)合，而N端272～292區(qū)段氨基酸殘基可能與Vip3Aa18殺蟲蛋白形成穿孔有關(guān)(蔡峻等，2007)。Vip3Aa11殺蟲蛋白的C端543～784區(qū)段部分氨基酸對其殺蟲特異性以及殺蟲毒力均具有重要作用，且不同的害蟲受體所結(jié)合的Vip3Aa11殺蟲蛋白氨基酸位點也不盡相同(雒國興，2017)。

2 鱗翅目昆蟲Bt受體間的相互作用

在Bt殺蟲蛋白殺蟲機(jī)制的模型中，位于昆蟲中腸BBMV上的Bt受體發(fā)揮了重要作用。在鱗翅目昆蟲幼蟲中，Bt殺蟲蛋白與不同的腸道蛋白(包括GPI錨定蛋白APN/ALP和跨膜蛋白CAD和ABC)順序結(jié)合形成孔前結(jié)構(gòu)(pre-pore structures)，CAD通過促進(jìn)Bt殺蟲蛋白N末端區(qū)域的去除而誘導(dǎo)殺蟲蛋白的低聚，而APN/ALP結(jié)合則有助于低聚物插入細(xì)胞膜中，各受體之間有序排列，協(xié)同完成Bt殺蟲蛋白中毒過程。某些Bt殺蟲蛋白可與鱗翅目昆蟲體內(nèi)多種Bt受體結(jié)合，Cry1Ac殺蟲蛋白可以結(jié)合昆蟲中腸APNs、ALP、CaLP、ABCC2、肌動蛋白、ATPase、聚鈣蛋白和一些其他以前未鑒定為Cry殺蟲蛋白結(jié)合分子的蛋白，如二肽基肽酶(dipeptidyl peptidase)或羧基/膽堿酯酶(carboxyl/choline esterase)和一些絲氨酸蛋白酶(serine proteases)等(Zhouetal.，2016)。草地貪夜蛾Cry1F抗性與中腸SfALP、SfAPN、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性降低有關(guān)(Zhuetal.，2015)。

鱗翅目昆蟲中腸ABC與其他Bt受體間存在協(xié)同作用，共同賦予昆蟲Bt抗性，小菜蛾的Cry1Ac抗性與PxALP、PxABCC2和PxABCC3的下調(diào)表達(dá)緊密相關(guān)(Guoetal.，2015)。在Hi5細(xì)胞中，棉鈴蟲HaCAD與HaABCC2共表達(dá)時可顯著增強Cry1Ac殺蟲蛋白對細(xì)胞的毒性，然而，斜紋夜蛾SlCAD與HaABCC2在Hi5細(xì)胞中共表達(dá)時，必須有HaCAD的TBD(特別是CR11)的參與才能使HaABCC2增強Cry1Ac殺蟲蛋白的細(xì)胞毒性，由此可以推斷CAD的TBD使Cry1Ac殺蟲蛋白定位在與ABCC2相互作用的關(guān)鍵位置，從而有助于ABCC2與Cry1Ac殺蟲蛋白結(jié)合(Maetal.，2019)。在Sf9細(xì)胞中，甜菜夜蛾SeABCC2b與SeCAD1b共表達(dá)時可增強Cry1Ca殺蟲蛋白的細(xì)胞毒性(Renetal.，2016)，煙芽夜蛾HvCaLP12和HvABCC2共表達(dá)時產(chǎn)生高Cry1A殺蟲蛋白(Cry1Aa、Cry1Ab或Cry1Ac)的細(xì)胞毒性(Bretschneideretal.，2016)。這些結(jié)果都表明不同受體間的協(xié)同作用可使Bt殺蟲蛋白的毒性增強，這為農(nóng)業(yè)鱗翅目害蟲防治提供了一種策略。

同一Bt殺蟲蛋白與鱗翅目昆蟲體內(nèi)的Bt受體并非專一性結(jié)合，且這種非專一性結(jié)合在不同鱗翅目昆蟲中也存在物種多樣性。Cry1Ac殺蟲蛋白與家蠶BmCaLP和BmCAD的結(jié)合位點都相同(都位于CR7、CR11和CR12)(Linetal.，2018)，Cry1Aa殺蟲蛋白與家蠶BmABCC2和BmCaLP受體(BtR175)的結(jié)合位點相同，但是家蠶BmABCC2突變對CrylAa殺蟲蛋白的抗性比BmCaLP突變高1000倍(Adegawaetal.，2017； Tanakaetal.，2013)。

3 展望

研究鱗翅目昆蟲Bt殺蟲蛋白受體對抗性機(jī)理研究具有重要意義，有助于為鱗翅目害蟲防治提供科學(xué)有效的措施，為農(nóng)業(yè)害蟲綠色防控提供參考。在Bt殺蟲蛋白殺蟲機(jī)制的模型中，位于鱗翅目昆蟲中腸BBMV上的Bt受體之間有序排列，協(xié)同完成Bt殺蟲蛋白中毒過程，整個過程受到昆蟲機(jī)體的精密調(diào)控(Gómezetal.，2014)，如棉鈴蟲GATA轉(zhuǎn)錄因子(HaGATAe)可以增強棉鈴蟲Cry1Ac受體基因的轉(zhuǎn)錄活性(Weietal.，2019)，但是，目前關(guān)于這方面的研究較為有限。需要強調(diào)的是，鱗翅目昆蟲體內(nèi)還存在其他物質(zhì)參與Bt殺蟲蛋白中毒過程，如棉鈴蟲鈣調(diào)磷酸酶(calcineurin，CAN)可能通過去磷酸酶活性調(diào)節(jié)免疫基因表達(dá)而增強Cry1Ac殺蟲蛋白對棉鈴蟲的殺蟲活性(Weietal.，2021)。建議在今后的研究中，以家蠶或小菜蛾等鱗翅目昆蟲為模式生物進(jìn)行深入研究，闡明其對Bt殺蟲蛋白產(chǎn)生抗性的機(jī)制，為研究其他鱗翅目昆蟲對Bt殺蟲蛋白產(chǎn)生抗性的機(jī)制提供參考。

鱗翅目昆蟲中腸受體的下調(diào)表達(dá)或錯誤表達(dá)可以降低其對Bt殺蟲蛋白的敏感性，從而阻止或減輕鱗翅目昆蟲對轉(zhuǎn)Bt基因作物的危害。在棉鈴蟲中，HaAPN1和HaCAD表達(dá)量的下降與其Bt抗性相關(guān)，且在不同幼蟲齡期表達(dá)量不同(張濤等，2011)。但鱗翅目昆蟲Bt抗性機(jī)制尚未完全闡釋清楚，每種模型都有待驗證或完善之處，隨著研究的深入，或許還有其他Bt抗性機(jī)制或Bt受體有待發(fā)現(xiàn)，且鱗翅目昆蟲Bt顯性抗性機(jī)制與Bt隱形抗性機(jī)制有區(qū)別(金琳，2017)。由于Bt殺蟲蛋白殺蟲機(jī)制和相應(yīng)的鱗翅目昆蟲Bt抗性機(jī)制復(fù)雜，即使采用先進(jìn)的分子生物學(xué)方法完全阻斷鱗翅目昆蟲中腸已知受體的表達(dá)，也不確定能取得效果，且在生產(chǎn)中是相當(dāng)復(fù)雜的工作。盡管如此，這一領(lǐng)域仍具有較大的研究價值和現(xiàn)實意義，闡明鱗翅目昆蟲的Bt抗性機(jī)理，可以為相關(guān)害蟲的防治提供理論基礎(chǔ)，為解決鱗翅目害蟲對轉(zhuǎn)Bt基因作物的危害提出建設(shè)性方案。

鱗翅目昆蟲Bt受體相關(guān)研究可為鱗翅目害蟲防治提供相應(yīng)策略，如同時使用多種Bt殺蟲蛋白的混合策略(或多基因組合策略)，該防治策略可明顯增強鱗翅目昆蟲對Bt殺蟲蛋白的敏感性。共表達(dá)Vip3AcAa殺蟲蛋白和Cry1Ac殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因棉花可有效防治抗Cry1Ac殺蟲蛋白的棉鈴蟲(Chenetal.，2017)。同時，鱗翅目昆蟲中也存在不同Bt受體間的協(xié)同作用以增強鱗翅目昆蟲對Bt殺蟲蛋白的抗性，如CAD和ABC(張丹丹，2019； Maetal.，2019)，但這些受體間是如何進(jìn)行協(xié)同作用，彼此間的作用機(jī)制存在怎樣的差別，還有待明確。盡管不同鱗翅目昆蟲間中腸Bt受體與Bt殺蟲蛋白結(jié)合存在差異，但無論如何，多基因組合策略依舊是今后一段時間Bt殺蟲蛋白應(yīng)用于田間鱗翅目昆蟲防治的發(fā)展方向。