雷笑霄， 閆香珍， 羅禮君

(同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周病科，上海牙組織修復(fù)與再生工程技術(shù)研究中心，上海 200072)

牙周炎是牙周組織慢性炎癥性疾病，其特征是牙齦的反復(fù)炎癥，牙槽骨、牙周膜等牙周組織被破壞。如不及時(shí)治療，牙周炎將引起牙周附著喪失，形成牙周組織缺損，最終牙齒松動(dòng)脫落。目前牙周炎的常規(guī)治療包括牙周非手術(shù)治療和手術(shù)治療。這些治療方法通?？梢詼p緩或阻止疾病進(jìn)一步發(fā)展，但獲得牙周組織再生仍是臨床難點(diǎn)。新的治療方法包括引導(dǎo)組織再生術(shù)以及各種基于生長(zhǎng)因子的療法等[1]。當(dāng)牙周缺損較大時(shí)，牙周組織再生受限，這可能與牙周組織中干細(xì)胞數(shù)量減少、功能受損等有關(guān)。隨著組織工程和干細(xì)胞治療技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)干細(xì)胞移植促進(jìn)牙周組織再生，成為新的研究方向，以克服現(xiàn)有療法的局限性[2]?；诩?xì)胞的牙周組織再生策略需要大量種子細(xì)胞，傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)環(huán)境異于細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)環(huán)境，所得產(chǎn)物也不同于體內(nèi)生長(zhǎng)細(xì)胞，使其難以實(shí)際應(yīng)用于牙周組織再生。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，三維多細(xì)胞球體不僅增強(qiáng)了細(xì)胞多向分化潛能，還有較強(qiáng)的抗炎能力。由此推測(cè)，將牙周再生細(xì)胞進(jìn)行三維培養(yǎng)可提升其干性并促進(jìn)其在炎癥微環(huán)境下的牙周再生。

1 干細(xì)胞在牙周組織再生中的應(yīng)用

1.1 牙周組織再生中干細(xì)胞的作用

干細(xì)胞是牙周組織再生的一個(gè)關(guān)鍵因素，在維持牙齒生理功能及牙周組織更新中起到了重要的作用[1]。

理想的干細(xì)胞增殖、傳代能力強(qiáng)，具有特定的分化潛能或表型；來(lái)源可靠，取材簡(jiǎn)便，性能穩(wěn)定，能適應(yīng)受植區(qū)的環(huán)境，對(duì)機(jī)體損傷小，無(wú)免疫排斥反應(yīng)等[3]。目前，用于牙周組織再生的細(xì)胞有胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞，其中對(duì)成體干細(xì)胞研究較多。

應(yīng)用于牙齒再生和牙周修復(fù)的干細(xì)胞包括: 牙髓干細(xì)胞、脫落乳牙干細(xì)胞、根尖牙乳頭干細(xì)胞、牙囊祖細(xì)胞(dental follicle cells, DFC)、牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells, PDLSC)、口腔上皮干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSC)、脂肪干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞等[4-5]。不同干細(xì)胞對(duì)于牙周組織再生的效果不盡相同，研究表明，牙源性干細(xì)胞效果優(yōu)于非牙源性干細(xì)胞，而牙髓干細(xì)胞與PDLSC效果相當(dāng)[4]。

為了明確細(xì)胞對(duì)牙周組織再生的效能，Yan等[6]對(duì)基于細(xì)胞治療策略的牙周組織再生動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)價(jià)，結(jié)果表明細(xì)胞對(duì)牙周組織再生的確有積極作用，其中PDLSC及MSC應(yīng)用最多，然而只有PDLSC能同時(shí)促進(jìn)牙周膜、牙骨質(zhì)與牙槽骨的再生。這可能是由于PDLSC中具有多種亞群細(xì)胞，而每種細(xì)胞亞群保留了不同的特定分化潛能，能夠共同促進(jìn)牙周軟硬組織生成。其他研究也發(fā)現(xiàn)，PDLSC可通過(guò)影響巨噬細(xì)胞向M2型極化，促進(jìn)牙周組織再生[7]；PDLSC在體外表現(xiàn)出血管生成，免疫調(diào)節(jié)和多系分化能力，是牙周再生理想的候選者[8]。

1.2 細(xì)胞應(yīng)用種類和方式及其優(yōu)缺點(diǎn)

目前，體外擴(kuò)增細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)是傳統(tǒng)的二維貼壁培養(yǎng)。這種培養(yǎng)環(huán)境與體內(nèi)生存環(huán)境差距大，培養(yǎng)的細(xì)胞生物性能等方面異于體內(nèi)細(xì)胞。首先，在二位環(huán)境中細(xì)胞被拉伸，缺乏細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用。此外，二維培養(yǎng)的細(xì)胞骨架重排，獲得人工極性，導(dǎo)致正常生理行為改變。二維培養(yǎng)數(shù)次傳代后，細(xì)胞干性降低[9]。最終細(xì)胞的生長(zhǎng)趨于單一化，許多生物學(xué)性狀難以維持，形態(tài)和功能發(fā)生改變，衰老、多能性降低以及旁分泌能力受損等，難以發(fā)揮治療潛能。故傳統(tǒng)體外培養(yǎng)的細(xì)胞無(wú)法與體內(nèi)的細(xì)胞完全等同。

于是，學(xué)者提出三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。三維培養(yǎng)技術(shù)包括將細(xì)胞嵌入到生物支架材料中和細(xì)胞本身聚集形成多細(xì)胞球體[10]。

三維培養(yǎng)的細(xì)胞具備以下幾點(diǎn)優(yōu)勢(shì): 三維微環(huán)境更能保留細(xì)胞的生理表型；細(xì)胞-細(xì)胞產(chǎn)生更好的接觸作用；細(xì)胞外基質(zhì)充斥在細(xì)胞周圍，有利于細(xì)胞局部停留；核心部分相對(duì)低氧的環(huán)境有利于分泌營(yíng)養(yǎng)因子[11]。但是，三維培養(yǎng)無(wú)法對(duì)良莠不齊的細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)量異質(zhì)性篩選。且在尺寸不可控的三維細(xì)胞球中，不同部位的細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)不均衡，如在細(xì)胞球中心的細(xì)胞，因缺少營(yíng)養(yǎng)、低氧和失巢凋亡而衰老、凋亡或變異等。

二維培養(yǎng)與三維培養(yǎng)主要特點(diǎn)比較見(jiàn)表1。

表1 二維培養(yǎng)與三維培養(yǎng)主要特點(diǎn)比較Tab.1 Comparison of the main characteristics of two-dimensional culture and three-dimensional culture

2 三維培養(yǎng)技術(shù)

2.1 現(xiàn)有三維培養(yǎng)體系及其局限性

細(xì)胞三維培養(yǎng)方法有懸滴法[12]、基于光刻和微圖案化技術(shù)法[13]、低黏附培養(yǎng)皿法[14]、生物反應(yīng)器動(dòng)態(tài)懸浮法[15]、微流體法[16]、殼聚糖膜培養(yǎng)法[17]、微孔芯片法[18]等。

盡管上述方法可獲得三維多細(xì)胞球體，但仍存在局限性。如懸滴法可收獲大小均勻的球體，但體積調(diào)節(jié)受限，平均尺寸相對(duì)較小[19]，且產(chǎn)量低；懸浮法雖產(chǎn)量大，并可以控制大小[20]，但是此方法需特殊設(shè)備，混合產(chǎn)生的剪切流會(huì)損壞細(xì)胞；低黏附培養(yǎng)皿法無(wú)法控制球體大?。晃⒘黧w法產(chǎn)生的球體很難收集并進(jìn)一步分析[21]。未來(lái)應(yīng)尋求一種操作簡(jiǎn)單、成球效率高、成本低，易于推廣的三維多細(xì)胞成球法。

微孔芯片法和殼聚糖膜培養(yǎng)法是目前較新的2種三維培養(yǎng)方法。微孔芯片法可以獲得均勻并且可控大小的多細(xì)胞球體[18]。殼聚糖膜培養(yǎng)法簡(jiǎn)單易行，無(wú)需特殊設(shè)備。細(xì)胞在殼聚糖膜上先黏附，殼聚糖中的氨基螯合Ca2+，將其表面的鈣轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中，導(dǎo)致細(xì)胞運(yùn)動(dòng)活躍，細(xì)胞-殼聚糖黏附力小于細(xì)胞-細(xì)胞黏附力，最后細(xì)胞自組裝成多細(xì)胞球體[22-23]。

2.2 殼聚糖的性能及其應(yīng)用

殼聚糖無(wú)毒且可降解，具有獨(dú)特而有利的特性，如抗微生物[24]、抗腫瘤[25]、抗氧化[24]和止血[26]。殼聚糖用于組織修復(fù)或再生的另一優(yōu)勢(shì)是易于加工成多種形式，如薄膜，海綿和水凝膠。且其與細(xì)胞外基質(zhì)多糖成分結(jié)構(gòu)相似故具有高度生物相容性。另外，殼聚糖上參與球體形成過(guò)程的鈣信號(hào)相關(guān)基因的表達(dá)高于非黏附表面上的表達(dá)[27]。

3 三維多細(xì)胞球體在牙周組織再生中的應(yīng)用研究

用聚乙二醇標(biāo)記的微孔芯片培養(yǎng)PDLSC球體，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)MSC標(biāo)志物，這與單層培養(yǎng)PDLSC相似。與后者相比，PDLSC球體中干性相關(guān)因子的表達(dá)顯著增加；經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后礦化結(jié)節(jié)形成能力、堿性磷酸酶活性和成骨相關(guān)基因的表達(dá)增強(qiáng)。動(dòng)物模型中也有同樣的結(jié)果，PDLSC球體處理顯著增強(qiáng)小鼠顱骨缺損模型中新骨形成[28]。將人PDLSC和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)或共培養(yǎng)物接種到熱敏培養(yǎng)皿上制作細(xì)胞片。細(xì)胞片以3種不同的組合包裹在制備的人牙根片周圍，并將其植入小鼠體內(nèi)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，在術(shù)后2、4和8周，實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)牙周膜樣組織排列，在含HUVEC組中觀察到血管腔；且牙周膜再生、牙骨質(zhì)形成和成骨在第4周和第8周時(shí)明顯增強(qiáng)[29]。在聚丙烯管中沉淀培養(yǎng)PDLSC球體，與二維培養(yǎng)相比，球體培養(yǎng)顯著增加PDLSC抗炎效應(yīng)和血管生成能力[30]。

本課題組前期用殼聚糖膜法成功培養(yǎng)出PDLSC多細(xì)胞球體，細(xì)胞在球體內(nèi)具有良好活性，且該方法具有以下優(yōu)勢(shì): (1) 技術(shù)簡(jiǎn)單，成球效率高，重復(fù)性好；(2) 更高的多能性相關(guān)基因的表達(dá)；(3) 增殖、克隆形成和成骨分化能力增強(qiáng)[31]。因此，這些多細(xì)胞球體更適用于組織工程。

4 三維培養(yǎng)細(xì)胞促進(jìn)組織再生機(jī)制

基于PDLSC牙周組織再生的一個(gè)主要問(wèn)題是原代培養(yǎng)只產(chǎn)生少量的細(xì)胞，在臨床應(yīng)用前需大量擴(kuò)增。而PDLSC在體外擴(kuò)增極易老化，且牙周炎癥微環(huán)境抑制PDLSC增殖和分化，從而降低PDLSC牙周再生能力。牙周再生另一重要因素是血凝塊的穩(wěn)定[32]，血小板合成并釋放多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，如堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等[33-34]。

轉(zhuǎn)錄因子 Oct4、Sox2和Nanog對(duì)維持多能胚胎干細(xì)胞分化潛能至關(guān)重要[35]，這些干性標(biāo)志物基因同樣存在于成體干細(xì)胞中[36]。與單層培養(yǎng)人DFC相比，DFC球體中Sox2、Oct4和Nanog表達(dá)顯著增加[37]。同時(shí)，研究[31]也發(fā)現(xiàn)PDLSC球體中Oct4、Sox2和Nanog的表達(dá)上升。另有研究表明，三維培養(yǎng)的牙髓干細(xì)胞具有優(yōu)異的多向分化能力[38]。以上結(jié)果均證明三維成球培養(yǎng)可增強(qiáng)細(xì)胞的多向分化潛能。

此外，多細(xì)胞球體可提升抗炎能力[39]，因此更加適合應(yīng)用于牙周炎癥微環(huán)境。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt3a可促進(jìn)PDLSC的增殖、遷移和成骨分化及牙槽骨再生[40]。與單層培養(yǎng)PDLSC相比，PDLSC球體抗炎相關(guān)基因腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白6(tumor necrosis factor α-induced protein 6, TSG6)、環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase2, COX2)、錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase, MnSOD)表達(dá)顯著上調(diào)[39]。研究發(fā)現(xiàn)TSG6與細(xì)胞干性及Wnt通路相關(guān): (1) 外源性應(yīng)用TSG6可以顯著提高肝星狀細(xì)胞干性相關(guān)基因的表達(dá)[41]；(2) TSG6敲除的MSC增殖能力下降，多向分化能力喪失，Wnt通路受到抑制[42]。MSC球體分泌更多數(shù)量和類型除白介素和干擾素外的細(xì)胞因子。此外，MSC球體有助于分泌免疫反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)，包括補(bǔ)體、免疫球蛋白和免疫細(xì)胞的眾多細(xì)胞表面分子，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，MSC球體激活神經(jīng)活性配體-受體相互作用，觸發(fā)下游PI3K-Akt信號(hào)通路，抑制炎癥反應(yīng)[43]。

多細(xì)胞球體血管生成相關(guān)基因的表達(dá)水平也有提高。PDLSC球體血管生成相關(guān)基因(VEGF、bFGF)表達(dá)水平較單層培養(yǎng)PDLSC提高[39]。與單層培養(yǎng)PDLSC相比，PDLSC球體和PDLSC與血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)球體中VEGF的表達(dá)都有所增高[44]。

已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)PDLSC球體成骨分化潛能增強(qiáng)。PDLSC球體成骨潛力的增強(qiáng)通過(guò)一種Wnt信號(hào)通路拮抗劑SFRP3(secreted frizzled-related protein 3)介導(dǎo)的堿性磷酸酶激活來(lái)調(diào)節(jié)[28]；三維培養(yǎng)特異性激活了MAPK和NF-κB信號(hào)通路并改善了細(xì)胞凋亡效應(yīng)，以促進(jìn)MSC的再生潛力[45]。

綜上所述，三維培養(yǎng)可以激活Wnt、PI3K-Akt、MAPK和NF-κB通路相關(guān)基因，增強(qiáng)細(xì)胞干性、多向分化潛能、提升其抗炎能力，并上調(diào)多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子。據(jù)此推測(cè)，三維培養(yǎng)可促進(jìn)組織再生。

5 展 望

迄今為止，學(xué)者們?yōu)閷で笠环N理想的方法來(lái)促進(jìn)牙周組織再生進(jìn)行了大量的研究。三維多細(xì)胞球體有望成為促進(jìn)牙周組織再生的可行性方法，但目前基于干細(xì)胞的牙周再生策略存在瓶頸: (1) 細(xì)胞在體外擴(kuò)增過(guò)程中干性衰退，牙周再生能力降低，使其難以在臨床推廣應(yīng)用；(2) 牙周炎癥微環(huán)境會(huì)降低PDLSC干性，抑制PDLSC增殖和分化，降低牙周再生能力。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)三維多細(xì)胞球體不僅增強(qiáng)了細(xì)胞多向分化潛能，還提升了抗炎能力。因此，進(jìn)一步研究PDLSC球體的干性維持、抗炎及免疫調(diào)控效應(yīng)促進(jìn)牙周組織再生，并探索相關(guān)機(jī)制，有望為炎癥微環(huán)境下牙周再生治療提供新的思路和策略。最后，PDLSC球體應(yīng)用于牙周再生的安全性及可靠性還需大量動(dòng)物模型研究和臨床試驗(yàn)來(lái)證明。