高壓二氧化碳對人冠狀病毒（hCoV-229E）的消殺效果

寧 鵬，楊 東，廖小軍，魏凡華 ，饒 雷, ，畢玉海

（1.寧夏大學農(nóng)學院，寧夏銀川 750021；2.中國科學院流感研究與預警中心，中國科學院微生物研究所，病原微生物與免疫學重點實驗室，北京 100101；3.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，國家果蔬加工工程技術研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果蔬加工重點實驗室，食品非熱加工北京市重點實驗室，北京 100083；4.中國科學院大學，北京 100049）

2019新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）自出現(xiàn)以來，至今仍在全球大流行[1]。截至2022年6月13日，造成全球約5.3億人感染，630余萬人死亡（https://covid19.who.int/）。隨著病毒的廣泛傳播，SARS-CoV-2不斷發(fā)生突變，德爾塔及奧密克戎等變異毒株層出不窮，病毒感染力和致病力不斷變化[2-5]，嚴重威脅人類健康及公共衛(wèi)生安全。

冠狀病毒是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，分為α、β、γ、δ四個屬。目前可以感染人的冠狀病毒有人冠狀病毒229E（human coronavirus 229E，hCoV-229E）、OC43（human coronavirus OC43，hCoV-OC43）、NL63（human coronavirus NL63，hCoV-NL63）、HKU1（human coronavirus HKU1，hCoV-HKU1）及嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）、中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）和SARS-CoV-2等7種冠狀病毒，其中hCoV-229E、hCoV-NL63為α屬，hCoV-OC43、hCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2為β屬[6-9]。所有冠狀病毒在復制、形態(tài)結(jié)構等方面都存在相似之處，但感染后的潛伏期和致病力有所差別[10]。

有研究表明，新冠肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）患者呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)均可排毒，且消化系統(tǒng)排毒時間更長[11]；而SARS-CoV-2可以通過消化系統(tǒng)感染實驗動物[12-13]，表明SARSCoV-2存在糞口傳播的風險。同時，在冷鏈溫度條件下（4 和-20 ℃），SARS-CoV-2可以在三文魚、牛肉和豬肉表面存活一段時間[14]；而在我國進口的冷鏈運輸食品包裝表面檢測出SARS-CoV-2核酸并分離到活病毒，提示SARS-CoV-2存在冷鏈傳播途徑[15-17]。此外，海洋中多種魚類血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（angiotensinconverting enzyme 2，ACE2）受體與人ACE2受體的氨基酸序列同源性較高，存在感染SARS-CoV-2的風險[18]。以上研究結(jié)果表明，在“新冠肺炎”疫情防控工作中不僅要防止“人傳人”，還要防止“物傳人”，需要加強對冷鏈食品及外包裝的消殺工作。

冠狀病毒結(jié)構較簡單，易受溫度、紫外線輻射、pH和滲透壓等環(huán)境因素影響，誘導病毒結(jié)構蛋白構象發(fā)生變化，破壞病毒囊膜或降解病毒核酸，影響病毒穩(wěn)定性或喪失感染性[19]。研究表明，冠狀病毒在56 ℃的條件下30 min即可滅活；在70%乙醇作用10 min、丙醇作用90 s或0.5%戊二醇作用2 min即可喪失感染性[20]。由于食品中嚴禁添加非食用成分，常規(guī)的消毒劑無法在食品表面使用，而傳統(tǒng)的巴氏殺菌、高溫殺菌等熱殺菌技術對冷鏈食品處理后，會引起食品中營養(yǎng)物質(zhì)流失、食品顏色改變，影響食品口感及風味[21-23]。高壓二氧化碳（high-pressure carbon dioxide，HPCD）是一種新型非熱殺菌技術，可有效克服傳統(tǒng)熱殺菌技術的弊端，在較低壓力（＜50 MPa）和較低溫度（5～60 ℃）條件下利用CO2對食品進行處理，可實現(xiàn)殺菌鈍酶效果，同時保留食品原有風味、口感及營養(yǎng)成分[24-26]。HPCD處理過程溫度低、殺菌效果好，泄壓過程CO2吸熱產(chǎn)生的冷凍效應可實現(xiàn)對冷凍產(chǎn)品品質(zhì)的維持，使其在冷鏈食品消殺方面具有較好的應用潛力。

由于SARS-CoV-2需要在生物安全三級實驗室中進行操作，受試驗條件限制；而hCoV-229E的穩(wěn)定性等生物學特性與MERS-CoV、SARS-CoV等冠狀病毒較為相近[27]，并可以在生物安全二級實驗室進行操作。因此，本研究選用hCoV-229E作為SARSCoV-2的替代毒株，探究HPCD對冠狀病毒的消殺效果，為HPCD應用于冷鏈食品及包裝的消殺提供理論依據(jù)，為疫情常態(tài)化防控中冷鏈食品的消毒和管理措施提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三文魚肉、蝦殼、聚乙烯類包裝材料 中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院提供；人肝癌細胞（Huh-7） 中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所；人冠狀病毒229E（毒株名：VR-740） 趙金存教授惠贈，實驗室培養(yǎng)保存；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）GIBCO公司；青霉素鈉、硫酸鏈霉素 山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司；生理鹽水 山東華魯制藥有限公司；二氧化碳（純度≥99.5%） 河南沂之源氣體銷售有限公司。

CAU-HPCD-1間歇式HPCD殺菌裝置 中國農(nóng)業(yè)大學專利產(chǎn)品（專利號ZL200520132590.X）；5424R高速冷凍離心機 Eppendorf公司；ME-E渦旋儀大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司；MCO-170AICUVLPC CO2細胞培養(yǎng)箱 普和希株式會社；LEICA DMi1倒置顯微鏡 德國徠卡公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 hCoV-229E病毒增殖 取100 μL hCoV-229E病毒液加入Huh-7細胞中，置于5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h，孵育結(jié)束后對細胞培養(yǎng)瓶中補充細胞維持液（DMEM培養(yǎng)基中含終濃度為100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的鏈霉素、2% FBS），于5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。每24 h觀察細胞病變（cytopathic effect，CPE）情況；當細胞出現(xiàn)80%以上CPE時收獲病毒培養(yǎng)液[20]。

1.2.2 HPCD對hCoV-229E消殺條件的研究 50 mL離心管中加入5×103.5TCID50的hCoV-229E病毒液（總體積5 mL，生理鹽水稀釋）；在不同的消殺條件下（見表1）使用HPCD對hCoV-229E進行處理，每組進行三次重復試驗。消殺處理方法如下：試驗組標記后放入預熱（預冷）的間歇式HPCD殺菌裝置反應釜中，關閉反應釜通入CO2，加壓至預設壓力后進行保壓、保溫，到達保壓時間后對反應釜泄壓，完成后取出置于冰上；將不加壓、相同溫度處理的對照組放入反應釜，不通入CO2，使用間歇式HPCD殺菌裝置對樣品進行熱處理；所有樣品處理完成后進行TCID50測定。

表1 HPCD對hCoV-229E的處理條件Table 1 Treatment conditions of HPCD for hCoV-229E

1.2.3 HPCD對食品及聚乙烯類包裝材料表面hCoV-229E的消殺效果 三文魚肉、蝦殼、聚乙烯類包裝材料表面滴加103.5TCID50的hCoV-229E病毒液（滴加病毒液的總體積為100 μL），根據(jù)1.2.2確定的HPCD最佳消殺條件，對三文魚肉、蝦殼、聚乙烯類包裝材料等樣品（三文魚肉邊長為1 cm×1 cm×1 cm，為塊狀；蝦殼、聚乙烯類包裝材料邊長為1 cm×1 cm，為片狀）進行消殺處理，同時設立相對應不加壓的相同溫度處理的對照組；每組三次重復試驗，試驗操作方法同1.2.2。HPCD對樣品消殺后，向盛放樣品的離心管中加入900 μL病毒稀釋液（DMEM培養(yǎng)基中含終濃度為100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的鏈霉素），渦旋振蕩2 min，回收上清液后在高速冷凍離心機中7000 r/min離心10 min，取離心后的上清液使用0.22 μm濾器過濾，然后滴定TCID50[18]。TCID50計算方法如下：

待滴定樣品的不同稀釋度稀釋液加入96孔板細胞后，培養(yǎng)至120 h，顯微鏡觀察并記錄96孔細胞培養(yǎng)板中的細胞病變情況，按照Reed-Muench法[28]計算病毒的TCID50，計算公式如下：

Log10TCID50=高于50%感染率的病毒稀釋度對數(shù)+相應距離比×稀釋系數(shù)的對數(shù)

1.3 數(shù)據(jù)處理

本試驗所有數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 8進行統(tǒng)計，使用T-test對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，當P＜0.05時具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 hCoV-229E在Huh-7細胞中增殖

如圖1所示，接種病毒24 h后，與對照Huh-7細胞（圖1a）相比，接種hCoV-229E的細胞（圖1b）無明顯細胞形態(tài)差異；接種病毒96 h后，與對照Huh-7細胞（圖1c）相比，接種hCoV-229E的Huh-7細胞（圖1d）出現(xiàn)細胞皺縮、脫落等典型細胞病變。

圖1 hCoV-229E接種Huh-7細胞后細胞病變觀察結(jié)果（200×）Fig.1 Cytopathic effects of the hCoV-229E infected Huh-7 cells (200×)

2.2 HPCD對hCoV-229E的最佳消殺條件

HPCD在6.3 MPa壓力和不同的溫度（10、25及37 ℃）條件下，分別對5×103.5TCID50的hCoV-229E病毒液處理15 min。由圖2可知：試驗組A、試驗組B及試驗組C1之間病毒滴度無顯著差異（P＞0.05），與對應的相同溫度處理對照組相比，各試驗組經(jīng)HPCD處理后hCoV-229E病毒滴度有下降趨勢，但無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；在6.3 MPa壓力、10 ℃條件下（試驗組D）對5×103.5TCID50的hCoV-229E病毒液進行30 min處理，發(fā)現(xiàn)試驗組與對照組差異顯著（P＜0.05）；在相同壓力和相同溫度（10 ℃）消殺條件下，試驗組A（處理15 min）和試驗組D（處理30 min）之間的病毒滴度沒有顯著差異（P＞0.05），提示在10 ℃低溫條件下延長HPCD處理時間不是HPCD消殺hCoV-229E的主要因素；在37 ℃處理15 min條件下，提高HPCD處理壓力，由6.3 MPa（試驗組C1）提升至10 MPa（試驗組C2），結(jié)果顯示提高壓力后試驗組C2的病毒滴度較試驗組C1顯著下降（P＜0.05），較對照組C相比極顯著下降（P＜0.01）。試驗結(jié)果表明，提高CO2的壓力會提升HPCD對hCoV-229E的消殺效果。綜上，HPCD對hCoV-229E的最佳消殺條件為37 ℃、10 MPa消殺15 min。

圖2 不同的HPCD處理條件對hCoV-229E滴度的影響Fig.2 Effects of different HPCD treatment conditions on virus titers of hCoV-229E

2.3 HPCD對食品及包裝材料表面hCoV-229E消殺效果

HPCD在37 ℃、10 MPa的條件下，對表面含103.5TCID50hCoV-229E的三文魚肉、蝦殼及聚乙烯類包裝材料處理15 min。結(jié)果如圖3所示：與不加壓的溫度處理對照組相比，三文魚肉試驗組的病毒滴度顯著下降（P＜0.05），蝦殼及聚乙烯類包裝材料試驗組病毒滴度極顯著下降（P＜0.01）。說明HPCD在37 ℃、10 MPa的條件下對表面含有hCoV-229E的三文魚肉、蝦殼和聚乙烯類包裝材料處理15 min后，對hCoV-229E具有一定的消殺效果；同時，相同HPCD的處理條件對蝦殼及包裝材料表面hCoV-229E的消殺效果要強于對三文魚肉表面病毒的消殺效果，原因可能是由于三文魚肉蛋白質(zhì)含量較高[29]，影響HPCD對三文魚肉中hCoV-229E病毒的消殺效果。

圖3 HPCD對表面含有hCoV-229E的食品及包裝材料的消殺效果Fig.3 Disinfection effects of HPCD against hCoV-229E virus on the surface of food and packaging materials

3 討論與結(jié)論

HPCD是一種綠色環(huán)保、無毒無害的殺菌方式，對微生物具有良好的殺菌作用，廣泛應用于食品中大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、芽孢桿菌及孢子等微生物的消殺[30-33]。溫度和壓力是影響HPCD消殺微生物的主要因素[34]。有研究發(fā)現(xiàn)，提高HPCD消殺的處理溫度、壓力及延長消殺時間可有效提高對微生物的消殺效果[35-36]。本研究發(fā)現(xiàn)，HPCD在6.3 MPa和處理15 min的條件下，提高處理溫度（10、25和37 ℃）并不能顯著提高消殺效果（P＞0.05），表明在6.3 MPa處理15 min條件下溫度不是影響HPCD對hCoV-229E消殺效果的主要因素。此外，在10 ℃、6.3 MPa的條件下，延長HPCD的保壓處理時間（由15 min延長至30 min）后發(fā)現(xiàn)，病毒滴度差異不顯著（P＞0.05），提示在該條件下處理時間也不是HPCD對hCoV-229E消殺的主要因素。

在本研究中，使用37 ℃和10 MPa的試驗條件對樣品處理15 min，獲得了較好的消殺效果。可能是由于相比氣態(tài)的CO2，超臨界狀態(tài)下（Tc=31.1 ℃；Pc=7.38 MPa）的CO2具有較低表面張力，可以更好地滲透到微孔中，對微生物具有更高的殺滅作用[21,37]。Werenr等研究也證實超臨界的CO2相比于氣態(tài)的CO2對牛奶中的微生物具有更好的殺滅作用[38]。此外，食品中蛋白質(zhì)含量也是影響HPCD消殺效果的另一個因素，對脂肪含量較高的食品的消殺效果較差[29]。本研究也發(fā)現(xiàn)，超臨界狀態(tài)的CO2對三文魚肉樣品表面的hCoV-229E有一定消殺效果，對蝦殼和聚乙烯類包裝材料表面病毒的消殺效果更佳。

冠狀病毒對pH敏感，不同的pH條件會影響冠狀病毒的刺突蛋白結(jié)構，進而影響刺突蛋白與受體結(jié)合能力。研究發(fā)現(xiàn)冠狀病毒在25 ℃、pH=1或37 ℃、pH=3條件下放置1 h 可完全被滅活[39]。而CO2可以在水中溶解形成碳酸，降低水溶液的pH[40]。Spilimbergo等研究發(fā)現(xiàn)，使用HPCD在8 MPa、30 ℃的條件下處理5 min，可以使枯草芽孢桿菌懸液的pH降低至3.3，表明含水溶液經(jīng)HPCD處理后，pH會明顯降低[41]；因此，HPCD引起水溶液中pH的降低是對冠狀病毒消殺的重要因素。

綜上，本研究以人冠狀病毒（hCoV-229E）為研究對象，優(yōu)化確定了HPCD對人冠狀病毒的最佳消殺條件為37 ℃、10 MPa處理15 min，發(fā)現(xiàn)消殺壓力是HPCD消殺冠狀病毒的重要因素。本研究得到的消殺參數(shù)可以應用于食品包裝表面的消殺。對于冷鏈食品消殺，可以考慮進一步提高處理壓力，一方面實現(xiàn)消殺效果的提升，另一方面利用泄壓過程CO2吸熱產(chǎn)生的冷凍效應實現(xiàn)對產(chǎn)品品質(zhì)的維持。此外，為應對實際生產(chǎn)應用需求，未來需要開發(fā)處理容積大、自動化程度高、穩(wěn)定性好的商業(yè)化設備，實現(xiàn)在中央廚房、大型食品生產(chǎn)工廠、生鮮食品集散地及海關進出口食品檢測等場景推廣應用，為疫情常態(tài)化防控形勢下保障冷鏈食品安全起到一定作用。在后續(xù)研究中，將繼續(xù)探究HPCD對冠狀病毒的消殺機制，進一步完善HPCD對病毒的消殺理論。