弓雪鈺，黃賢燕，陳正海，曹建國(guó)，戴錫玲

（上海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200234）

0 引言

披針新月蕨（Pronephrium penangianum）隸屬于金星蕨科（Thelypteridaceae）新月蕨屬（Pronephrium），主要分布于中國(guó)華南和西南地區(qū)，在印度、泰國(guó)等國(guó)家也有分布［1］.在形態(tài)學(xué)的研究方面，MA等［2］利用光學(xué)顯微鏡研究了金星蕨科8屬16種蕨類的葉表皮形態(tài)，為金星蕨科植物的系統(tǒng)演化及分類提供依據(jù).在金星蕨科配子體發(fā)育方面，BAO等［3］研究了東北地區(qū)金星蕨科的卵果蕨（Phegopteris connectilis）和沼澤蕨（Thelypteris palustris）的配子體發(fā)育過程，BLANCA等［4］研究了金星蕨科沼澤蕨屬（Thelypteris）的5種蕨類植物的配子體發(fā)育過程，并且對(duì)它們的發(fā)育過程進(jìn)行了比較.在生殖方面，ZHAN等［5］就金星蕨科針毛蕨屬（Macrothelypteris）的普通針毛蕨（Macrothelypteris torresiana）的卵發(fā)生過程進(jìn)行了研究.披針新月蕨還是一種重要的藥用植物，具有抗菌、消炎和抗腫瘤等生物活性［6-10］，然而，有關(guān)披針新月蕨配子體發(fā)育和有性生殖方面的研究尚未有報(bào)道.因此，本研究利用顯微觀察技術(shù)對(duì)披針新月蕨配子體發(fā)育和卵發(fā)生過程進(jìn)行了細(xì)胞學(xué)觀察，為完善蕨類植物生殖生物學(xué)積累資料.

1 材料與方法

本實(shí)驗(yàn)選取的材料披針新月蕨孢子于2019年7月采自貴州省荔波縣.憑證標(biāo)本保存于上海師范大學(xué)（SHNU）蕨類植物實(shí)驗(yàn)室.

披針新月蕨孢子為8—10月成熟時(shí)采收.制備Knop’s培養(yǎng)基，并將接種相關(guān)的各種器皿放于高壓滅菌鍋中滅菌，接種整個(gè)流程在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行，而后將培養(yǎng)皿置于ZGX-300C型智能培養(yǎng)箱中培養(yǎng).培養(yǎng)條件為光照18 h·d-1，光照強(qiáng)度2 000 lx，溫度26℃；黑暗6 h·d-1，溫度20℃.

利用解剖鏡（Nikon SMZ1500）觀察披針新月蕨配子體和頸卵器（archegonium）發(fā)育的各個(gè)階段，用光學(xué)顯微鏡（Nikon E800）拍照記錄.

2 觀察結(jié)果

2.1 配子體發(fā)育

披針新月蕨孢子為褐色，二面型，孢子大小為28 μm×37 μm.赤道面觀是半圓形，極面觀是橢圓形，孢子具單裂縫，表面具有脊?fàn)罴y飾（圖版I-1）.接種后12 d左右，孢子萌發(fā)，長(zhǎng)出初生假根（圖版I-2）.此后，長(zhǎng)出原葉體原始細(xì)胞.初生假根方向與原始細(xì)胞的長(zhǎng)軸方向垂直，孢子萌發(fā)方式是書帶蕨型（Vittaria-type）［11］.接種18 d后，原葉體原始細(xì)胞不斷橫分裂，形成4～7個(gè)細(xì)胞的單列絲狀體（圖版I-3～4），有時(shí)會(huì)縱向分裂，形成雙列絲狀體.接種22 d后，絲狀體細(xì)胞不斷的縱向分裂，形成片狀體，形狀不規(guī)則，頂部存在楔形分生細(xì)胞，片狀體邊緣細(xì)胞較小，含有豐富的葉綠體.此時(shí)，假根的數(shù)量也增多（圖版I-5）.

圖版I披針新月蕨配子體發(fā)育光學(xué)顯微鏡圖.

接種39 d后，由于分生細(xì)胞分裂的速度較慢且體積小，而周邊由分生細(xì)胞衍生的細(xì)胞體積大，從而使生長(zhǎng)點(diǎn)兩側(cè)凸出，生長(zhǎng)點(diǎn)下陷，發(fā)育為心臟形的幼原葉體，生長(zhǎng)點(diǎn)附近的細(xì)胞較小，排列緊密（圖版I-6）.接種后約46 d，幼原葉體繼續(xù)發(fā)育，體積增大成為成熟原葉體（圖版I-7～8），周圍有大量的假根，在成熟原葉體邊緣具有毛狀體，多為單細(xì)胞圓柱狀，上窄下寬，圓柱頂端具帽狀腺體，大小不一，通常長(zhǎng)約30～40 μm，寬約15 μm（圖版I-9）.成熟原葉體長(zhǎng)度為0.3～0.5 cm，寬度為0.3～0.4 cm.披針新月蕨的原葉體發(fā)育類型是槲蕨型（Drynaria-type）［11］.在成熟原葉體生長(zhǎng)點(diǎn)下方，中肋附近長(zhǎng)出頸卵器，一般有6～10個(gè)處于不同發(fā)育階段的頸卵器（圖版I-10），越靠近生長(zhǎng)點(diǎn)附近的頸卵器越幼小.發(fā)育成熟的頸卵器側(cè)面觀一般由4～5層細(xì)胞構(gòu)成，頂面觀是“銅錢形”（圖版I-11）.在頸卵器附近，靠近原葉體基部或原葉體邊緣產(chǎn)生精子器（antheridium）.精子器為圓球形，由基細(xì)胞、環(huán)細(xì)胞和蓋細(xì)胞組成，精子器內(nèi)包含有許多精子（圖版I-12）.

待精子成熟，蓋細(xì)胞破裂，精子從精子器溢出，借助水進(jìn)入頸卵器，完成受精，形成合子.合子發(fā)育為胚，胚暫時(shí)寄生在配子體上，長(zhǎng)大后配子體死亡，孢子體獨(dú)立生活.

2.2 幼卵階段

披針新月蕨的頸卵器起源于生長(zhǎng)點(diǎn)附近的原始細(xì)胞.原始細(xì)胞經(jīng)過一次不等的平周分裂形成上下2個(gè)細(xì)胞，下方細(xì)胞較大，下方細(xì)胞再經(jīng)過一次不等的平周分裂，最后形成3個(gè)細(xì)胞，分別是頂細(xì)胞、初生細(xì)胞和基細(xì)胞.其中位于最上層的頂細(xì)胞經(jīng)過2次垂周分裂，最終發(fā)育成為4列頸卵器壁細(xì)胞（jacket cell of the neck）.處于下方的細(xì)胞為基細(xì)胞，含有較多液泡，經(jīng)過發(fā)育成為頸卵器底部壁細(xì)胞.處于中間的細(xì)胞是初生細(xì)胞（PC）（圖版Ⅱ-1），初生細(xì)胞繼續(xù)發(fā)育，體積增大，細(xì)胞向上隆起（圖版Ⅱ-2）.初生細(xì)胞經(jīng)過一次不等平周分裂形成上下2個(gè)細(xì)胞，上方細(xì)胞比較小，是頸溝細(xì)胞（NCC）（圖版Ⅱ-3），細(xì)胞核較大，含有較多的囊泡，圍繞在細(xì)胞核周圍.下方細(xì)胞繼承了大部分的細(xì)胞質(zhì)，體積較大，為中央細(xì)胞（CC），細(xì)胞核較大，核仁明顯（圖版Ⅱ-3）.此時(shí)，頸卵器壁細(xì)胞含有較多大囊泡.頸卵器壁細(xì)胞經(jīng)過多次分裂形成明顯的頸部（圖版Ⅱ-4）.隨著頸卵器的發(fā)育，單核頸溝細(xì)胞的細(xì)胞核先分裂，細(xì)胞質(zhì)不分裂，形成雙核頸溝細(xì)胞.接著，中央細(xì)胞開始不均等的分裂，形成上下兩個(gè)細(xì)胞，上方細(xì)胞繼承的細(xì)胞質(zhì)較少，體積較小，被稱作腹溝細(xì)胞（VCC）.腹溝細(xì)胞剛形成時(shí)，位于頸卵器中間，呈凸形，質(zhì)體位于腹溝細(xì)胞的兩側(cè).下方細(xì)胞繼承了大部分的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器，細(xì)胞體積大，被稱作卵細(xì)胞（EC）.卵細(xì)胞橫切面的形狀近似“倒梯形”，細(xì)胞內(nèi)含有豐富的囊泡和細(xì)胞器.幼卵階段的頸溝細(xì)胞、腹溝細(xì)胞和卵細(xì)胞是緊密聯(lián)系在一起的，之后隨著發(fā)育頸卵器壁細(xì)胞逐漸液泡化.

圖Ⅱ披針新月蕨頸卵器發(fā)育及卵發(fā)生光學(xué)顯微鏡圖.1.初生細(xì)胞時(shí)期；2.初生細(xì)胞向上隆起；3.中央細(xì)胞時(shí)期；4.幼卵細(xì)胞時(shí)期：頸溝細(xì)胞、腹溝細(xì)胞和幼卵細(xì)胞；5～6.發(fā)育卵階段：分離腔和孔區(qū)形成；7～8.發(fā)育卵階段：卵膜和受精孔形成；9.成熟卵階段

2.3 發(fā)育卵階段

2.3.1 分離腔和孔區(qū)的形成

幼卵繼續(xù)發(fā)育，其頸卵器壁細(xì)胞數(shù)量增多，有4～5層細(xì)胞，液泡化更明顯.發(fā)育卵最明顯的特征是卵細(xì)胞與腹溝細(xì)胞之間開始出現(xiàn)分離腔，分離腔最開始是在2個(gè)細(xì)胞的邊緣先形成的（圖版Ⅱ-5），卵細(xì)胞繼續(xù)發(fā)育，分離腔不斷地向中心擴(kuò)大，最后只剩下一處與腹溝細(xì)胞相連，連接處稱為孔區(qū)（圖版Ⅱ-6）.腹溝細(xì)胞與頸溝細(xì)胞之間還是緊密聯(lián)系的（圖版Ⅱ-5～6），但腹溝細(xì)胞與頸卵器壁細(xì)胞開始出現(xiàn)間隙，腹溝細(xì)胞有輕微退化的趨勢(shì)，頸溝細(xì)胞質(zhì)體豐富，開始液泡化（圖版Ⅱ-5～6）.

2.3.2 卵膜和受精孔的形成

卵細(xì)胞發(fā)育過程中的另外一個(gè)明顯的特征是卵細(xì)胞表面有一層嗜鋨性物質(zhì)包裹著卵細(xì)胞，即卵膜.卵細(xì)胞發(fā)育過程中細(xì)胞核由橢圓形變成“碗狀”，整個(gè)細(xì)胞中均勻分布著小囊泡和染色較深的質(zhì)體.分離腔不斷擴(kuò)大，卵細(xì)胞與頸卵器壁細(xì)胞也逐漸分離.腹溝細(xì)胞細(xì)胞核周圍有小囊泡分布.腹溝細(xì)胞與頸溝細(xì)胞還緊密聯(lián)系著，與卵細(xì)胞只通過孔區(qū)相連.腹溝細(xì)胞邊緣退化，與頸卵器壁細(xì)胞分離，兩細(xì)胞之間有染色較深的絮狀物質(zhì)（圖版Ⅱ-7～8）.在卵細(xì)胞上表面一側(cè)未被卵膜覆蓋的區(qū)域是受精孔（圖版Ⅱ-8）.受精孔兩邊的卵膜較厚，遠(yuǎn)離受精孔兩側(cè)的卵膜較薄.頸溝細(xì)胞進(jìn)一步伸長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)一般含有2～3個(gè)較大的囊泡，細(xì)胞器退化（圖版Ⅱ-7～8），在卵細(xì)胞發(fā)育后期，頸溝細(xì)胞明顯退化，與頸卵器壁細(xì)胞分離，有絮狀物質(zhì)，頸溝細(xì)胞周圍染色加深.

2.4 成熟卵階段

卵細(xì)胞的卵膜染色加深，受精孔兩側(cè)的卵膜較其他地方的卵膜更厚，核仁明顯（圖版Ⅱ-9），卵細(xì)胞與腹溝細(xì)胞之間的分離腔進(jìn)一步增大，與周圍的頸卵器壁細(xì)胞分開.網(wǎng)狀的卵膜進(jìn)一步加厚，卵膜的下方有嗜鋨性的囊泡，囊泡主要集中于卵細(xì)胞上方（圖版Ⅱ-9）.此時(shí)，腹溝細(xì)胞已經(jīng)完全退化，細(xì)胞核和細(xì)胞器消失，細(xì)胞內(nèi)只有染色較深的絮狀物質(zhì)，且與頸溝細(xì)胞分開，頸卵器的壁細(xì)胞液泡化.與腹溝細(xì)胞一樣，頸溝細(xì)胞也已經(jīng)完全退化，細(xì)胞核和細(xì)胞器消失，只剩下大量的不定型物質(zhì)（圖版Ⅱ-9），頸卵器壁細(xì)胞已經(jīng)完全液泡化，等到時(shí)期成熟，頸卵器壁細(xì)胞會(huì)裂開，不定型物質(zhì)溢出頸卵器，頸卵器頸部形成空腔，為精子進(jìn)入頸卵器做準(zhǔn)備.

3 討論

對(duì)披針新月蕨的配子體發(fā)育的研究結(jié)果表明，其孢子為褐色，二面體型孢子，具單裂縫和脊?fàn)罴y飾［12］，與DAI等［12］的研究結(jié)果一致.披針新月蕨孢子萌發(fā)的方式是書帶蕨型，原葉體發(fā)育類型是槲蕨型，且原葉體邊緣有毛狀體形成，成熟原葉體是對(duì)稱的心形等，這些特征都表明其處于較為進(jìn)化的蕨類植物［13］.

披針新月蕨的頸卵器發(fā)育過程經(jīng)歷了初生細(xì)胞、中央細(xì)胞、幼卵、發(fā)育卵和成熟卵時(shí)期，這與普通針毛蕨、瘤足蕨（Plagiogyria adnata）、多羽鳳尾蕨（Pteris decrescens）［14］、闊葉鱗蓋蕨（Microlepia platyphylla）［15］等的卵發(fā)育過程一致，表明同型孢子蕨類植物頸卵器的發(fā)育都經(jīng)歷了這幾個(gè)時(shí)期.其中，在卵發(fā)生的過程中，比較特殊的是單核頸溝細(xì)胞細(xì)胞核分裂先于中央細(xì)胞分裂形成腹溝細(xì)胞，這與對(duì)普通針毛蕨［5］和闊鱗瘤蕨（Phymatosorus hainanensis）［16］的研究結(jié)論相同.披針新月蕨單核頸溝細(xì)胞細(xì)胞核分裂先于腹溝細(xì)胞形成，且只有一個(gè)頸溝細(xì)胞，這表明金星蕨科應(yīng)該位于真水龍骨類當(dāng)中，這為金星蕨科的分類增添生殖發(fā)育方面的佐證，因此，支持PPG-2016系統(tǒng)對(duì)于金星蕨科的劃分，將金星蕨科放置于真水龍骨類當(dāng)中［17］.

在披針新月蕨發(fā)育卵階段，腹溝細(xì)胞與卵細(xì)胞并沒有完全分開，還有一個(gè)孔區(qū)連接著兩者，并且孔區(qū)處有胞間連絲存在，孔區(qū)形成的這些變化特征和較為進(jìn)化的多羽鳳尾蕨、普通針毛蕨、闊鱗瘤蕨、闊葉鱗蓋蕨等［5，14-16］一樣.這與處于原始地位的紫萁（Osmunda japonica）情況不一致，紫萁在卵發(fā)生過程中并未有孔區(qū)出現(xiàn)［18］，表明孔區(qū)是在蕨類植物演化過程中慢慢出現(xiàn)的，存在一個(gè)從無到有的過程，孔區(qū)結(jié)構(gòu)是較為進(jìn)化的蕨類植物所特有的結(jié)構(gòu).在披針新月蕨卵的發(fā)育過程中，頸溝細(xì)胞和腹溝細(xì)胞直到成熟卵時(shí)期才完全退化，只剩下大量的絮狀不定型物質(zhì).到卵成熟時(shí)，頸卵器壁細(xì)胞破裂，絮狀不定型物質(zhì)釋放出去，而頸溝細(xì)胞與腹溝細(xì)胞的退化起到了為精子提供通道的作用，使精子進(jìn)入到卵細(xì)胞中，完成受精作用.結(jié)合過往研究［19-26］，推測(cè)絮狀不定型物質(zhì)可能起著吸引精子的作用，但是關(guān)于絮狀不定型物質(zhì)的這一特性還需進(jìn)一步研究.

在披針新月蕨卵細(xì)胞發(fā)育過程中，分離腔中的不定型物質(zhì)在卵細(xì)胞外表面不斷堆積，加上卵細(xì)胞內(nèi)表面的嗜鋨性囊泡共同作用，形成卵膜，而在卵細(xì)胞上方偏離中心的孔區(qū)位置，沒有卵膜的覆蓋，進(jìn)而形成受精孔.處于系統(tǒng)演化中較高級(jí)的闊鱗瘤蕨［16］、普通針毛蕨［15］等的受精孔位于卵細(xì)胞上方，偏離中心的位置，這和本研究中的披針新月蕨的受精孔情況一致；而處于較為原始的蕨類金毛狗（Cibotium barometz）、烏蕨（Odontosoria chusana）等的受精孔位于卵細(xì)胞上方的正中央［27-28］，并且紫萁是無受精孔結(jié)構(gòu)的.而卵膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)在進(jìn)化的蕨類植物中各有不同，因此，還需要更為細(xì)致的透射電子顯微鏡來進(jìn)行觀察，以進(jìn)一步確定披針新月蕨的演化地位.

4 結(jié)論

本文采用顯微觀察技術(shù)，對(duì)披針新月蕨配子體發(fā)育和卵發(fā)生的過程進(jìn)行了觀察，結(jié)果如下.

1）配子體發(fā)育：孢子褐色，二面型，孢子萌發(fā)經(jīng)絲狀體和片狀體階段，發(fā)育成原葉體.孢子萌發(fā)是書帶蕨型，原葉體發(fā)育是槲蕨型，成熟原葉體是心形，接種46 d后產(chǎn)生頸卵器和精子器.

2）頸卵器發(fā)育：頸卵器起源于原葉體生長(zhǎng)點(diǎn)下方的原始細(xì)胞.原始細(xì)胞經(jīng)過2次不等的平周分裂，形成3個(gè)細(xì)胞，分別是頂細(xì)胞、初生細(xì)胞和基細(xì)胞.其中，初生細(xì)胞不等分裂，形成中央細(xì)胞和頸溝細(xì)胞.隨后，中央細(xì)胞不等分裂形成腹溝細(xì)胞和卵細(xì)胞.單核頸溝細(xì)胞細(xì)胞核分裂先于腹溝細(xì)胞形成，且只有一個(gè)頸溝細(xì)胞，這表明金星蕨科應(yīng)該位于真水龍骨類當(dāng)中.

3）卵發(fā)生：隨著卵細(xì)胞成熟，頸溝細(xì)胞和腹溝細(xì)胞逐漸退化，但腹溝細(xì)胞通過孔區(qū)與卵細(xì)胞相連.卵細(xì)胞成熟后，細(xì)胞上表面具有明顯的卵膜，其中央具有受精孔，孔區(qū)是較為進(jìn)化的蕨類植物所特有的結(jié)構(gòu).

本研究對(duì)于完善蕨類植物生殖生物學(xué)和探討蕨類植物的演化具有重要意義.