王立斌 王軍乾 趙 凌 黃振華 王 萌 王靖雷 余四九，2 潘陽(yáng)陽(yáng)，*

（1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2甘肅省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730070）

抑制素A（inhibin A，INHA）是由卵泡顆粒細(xì)胞分泌的一種調(diào)節(jié)卵泡生長(zhǎng)發(fā)育、卵子生成和配子形成的內(nèi)分泌激素。雌性動(dòng)物和雄性動(dòng)物不同器官產(chǎn)生不同的抑制素（inhibin，INH）。雌性動(dòng)物既能產(chǎn)生INHA 也能產(chǎn)生抑制素B（inhibin B，INHB），而雄性動(dòng)物只能產(chǎn)生INHB［1-2］，說(shuō)明INHA 在雌性生殖系統(tǒng)中發(fā)揮獨(dú)特的作用。INHA 和INHB 失活對(duì)雄性生殖系統(tǒng)沒(méi)有明顯影響，但會(huì)導(dǎo)致雌性動(dòng)物胚胎發(fā)育的吸收能力減弱及卵巢功能受損，而INHA 能增強(qiáng)雌性小鼠促卵泡素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）對(duì)卵泡發(fā)育的依賴(lài)性，并提高自然排卵率［3］。INH 的結(jié)合位點(diǎn)和受體位于垂體、卵泡膜細(xì)胞和卵泡顆粒細(xì)胞［4-5］。INH 可以通過(guò)內(nèi)分泌和局部作用的方式調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育［6-8］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，INH 免疫動(dòng)物能使垂體分泌的FSH 和促黃體素（luteinizing hormone，LH）減少［9］，用抑制劑處理綿羊卵丘細(xì)胞可以抑制細(xì)胞內(nèi)促卵泡素受體（follicle stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR）、促黃體素受體（luteinizing hormone receptor，LHR）的表達(dá)［10］，由此推測(cè)INHA 對(duì)牦牛（Bos grunniens）卵泡顆粒細(xì)胞中FSH和LH及其受體同樣會(huì)產(chǎn)生影響。

FSH 和LH 主要調(diào)節(jié)卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育、成熟和排卵。在哺乳動(dòng)物中，F(xiàn)SH和LH對(duì)卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂的作用機(jī)理是：二者通過(guò)激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）產(chǎn)生細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)［11-13］。MAPK 激活了顆粒細(xì)胞膜上的細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)，影響卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［14］，既提高顆粒細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）的水平，也降低卵母細(xì)胞中的cAMP 和環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）水平，使卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂，最終促進(jìn)卵泡完成排卵［15-16］。在雌性生殖系統(tǒng)中，F(xiàn)SH 調(diào)節(jié)小卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育，促進(jìn)卵泡成熟，并刺激卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞合成INHA［17-18］。LH是由垂體分泌的調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育的激素，通過(guò)與顆粒細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，誘導(dǎo)成熟卵泡排卵，促進(jìn)卵泡向黃體轉(zhuǎn)化［19］。說(shuō)明顆粒細(xì)胞中FSHR和LHR影響FSH和LH對(duì)卵泡的調(diào)節(jié)作用。

INH 可以通過(guò)cAMP 和三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3）的產(chǎn)生啟動(dòng)主要信號(hào)級(jí)聯(lián)，從而調(diào)節(jié)FSH 和LH 的分泌，這些由FSH 和LH 調(diào)節(jié)的顆粒細(xì)胞信號(hào)級(jí)聯(lián)在卵泡發(fā)育、排卵中起重要作用［20］。INHA作為雌性動(dòng)物特有的一種激素，目前關(guān)于INHA 對(duì)動(dòng)物卵泡發(fā)育和生殖功能影響的研究較少。為探究INHA對(duì)卵泡顆粒細(xì)胞的調(diào)控作用，本研究用不同濃度的INHA 處理牦牛卵泡顆粒細(xì)胞并檢測(cè)激素和受體的表達(dá)變化情況，以進(jìn)一步發(fā)掘INHA 對(duì)牦牛卵泡顆粒細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用機(jī)制，以期為探索抑制素對(duì)雌性牦牛生殖調(diào)控的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品處理 試驗(yàn)樣品取自青海省西寧市清源屠宰場(chǎng)，3～6 歲雌性牦牛，體況良好，無(wú)明顯臨床疾病。牦牛禁食8～10 h 后，頸動(dòng)脈放血屠宰，30 min 內(nèi)采集10 對(duì)牦牛卵巢，用含有青霉素和鏈霉素的生理鹽水清洗3次，3 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室做原代顆粒細(xì)胞培養(yǎng)。

1.1.2 儀器設(shè)備 T100TMThermal Cycler PCR 儀，德國(guó)Eppendorf公司；BIO-RAD酶標(biāo)儀，美國(guó)Biorad公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，上海Roche 生物科技公司；DP71 顯微照相系統(tǒng)、Olympus DSU 活細(xì)胞工作站，日本Olympus公司。

1.1.3 試驗(yàn)試劑 Inhibin A，美國(guó)R&D Systems；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基（basic cell culture medium）和磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered salina，PBS），上海Gibco 公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑（cell counting kit-8，cck-8），武漢菲恩生物科技有限公司；FSHR 抗體（AF-5242），江蘇親科生物研究中心有限公司；LHR 抗體（bs-6431R）、熒光二抗、山羊抗兔抗體（Goat Anti-Rabbit IgG）和免疫組化染色試劑盒，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；牛促卵泡素（FSH）、黃體生成素（LH）和雌二醇（estradiol，E2）酶聯(lián)免疫分析（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒，上海機(jī)純實(shí)業(yè)有限公司；胰蛋白酶，美國(guó)Sigma 公司；曲拉通X-100（Triton X-100），武漢卡諾斯科技有限公司；細(xì)胞核染料（4′，6-二脒基-2-苯基吲哚，4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI），北京索萊寶生物公司；TransZol RNA 提取試劑盒，北京全式金公司；GoscriptTMReverse Transcription System 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，美國(guó)Promega 公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA），上海碧云天生物公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 利用Primer Premier 6.0 設(shè)計(jì)7 對(duì)引物（表1），由生工生物工程（上海）有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 Primers sequence

1.2.2 牦牛卵泡顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng) 將牦牛卵巢置于37 ℃含有青霉素和鏈霉素的生理鹽水中清洗3 次，在3 h 內(nèi)用注射器抽取直徑為3～8 mm 卵泡中的卵泡液后注入15 mL 離心管，將混勻后的卵泡液用100 nm孔徑的細(xì)胞濾器過(guò)濾，然后以1 500 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心10 min，形成的沉淀即為所需的原代牦牛顆粒細(xì)胞。再用配制的10%細(xì)胞培養(yǎng)液（10%全培）［90 mL 細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基（DMEM/F12）+10 mL 胎牛血清+1 mL雙抗］清洗3 次后通過(guò)細(xì)胞板計(jì)數(shù)法調(diào)整密度接近5×105個(gè)·mL-1，并接種于25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，24 h 內(nèi)每隔8 h 按照半換液法（棄一半培養(yǎng)瓶中一半的細(xì)胞培養(yǎng)液，再加入等量配制的細(xì)胞培養(yǎng)液）換液，待細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后每36 h更換一次10%全培。

1.2.3 CCK-8 法測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 待第一代顆粒細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中長(zhǎng)滿(mǎn)以后，用0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行消化，顯微鏡觀察待細(xì)胞全部消化后加入10%全培中終止消化，再以1 500 r·min-1離心10 min，加入適量10%全培制成細(xì)胞懸液，再用活細(xì)胞計(jì)數(shù)法將細(xì)胞懸液濃度依次稀釋為0.5×104、1.5×104、2.5×104、3.5×104、4.5×104個(gè)·mL-1，將不同濃度的細(xì)胞懸液各加100 μL于96 孔板中，每個(gè)濃度重復(fù)加4 孔，并在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)4 h 使細(xì)胞完全貼壁，然后棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS 清洗3 次，每次3 min，之后每孔加入90 μL DMEM/F12 培養(yǎng)基和10 μL CCK-8 試劑，再置于細(xì)胞培養(yǎng)箱3 h 后以490 nm 波長(zhǎng)測(cè)光密度（optical density，OD）值，以細(xì)胞懸液濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)建立顆粒細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

將上述顆粒細(xì)胞以0.5×104個(gè)·mL-1細(xì)胞密度接種于96 孔板中，每孔加100μL 混有顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞完全貼壁后選擇其中4 孔棄去培養(yǎng)液，用PBS 清洗3 次，每次3 min，加入90 μL DMEM/F12 培養(yǎng)基和10 μL CCK-8 試劑，培養(yǎng)3 h 后在490 nm 波長(zhǎng)下測(cè)OD 值，其余孔棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗3次，每次3 min，然后加入10%的全培，24 h后再選擇4 孔按照上述方法以490 nm 波長(zhǎng)測(cè)OD 值，連續(xù)測(cè)8 d 后，以培養(yǎng)天數(shù)為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)繪制顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 FSHR、LHR 在顆粒細(xì)胞的定位檢測(cè) 通過(guò)免疫熒光化學(xué)方法檢測(cè)牦牛卵泡顆粒粒細(xì)胞上FSHR、LHR 的表達(dá)。先用0.25%胰酶消化第一代顆粒細(xì)胞，待細(xì)胞全部消化后1 500 r·min-1離心10 min，用10%全培制成細(xì)胞懸液，用活細(xì)胞計(jì)數(shù)法將細(xì)胞密度調(diào)至5×105個(gè)·mL-1，然后接種到2 個(gè)放有蓋玻片的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后取出爬片，用PBS清洗3次，每次3 min，然后用4%多聚甲醛固定，再用PBS 清洗3 次，每次3 min，并加入0.1%TritonX-100 室溫條件下透化40 min，再用PBS 清洗3 次，每次5 min，用牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）室溫封閉1 h，棄去封閉液并用PBS 清洗3 次×5 min，加入稀釋的FSHR、LHR 抗體（1∶100），4 ℃孵育12 h，再用PBS 清洗5 次，每次3 min，用熒光二抗（1∶200）孵育1 h，用PBS 清洗5 次，每次3 min 后，用DAPI 染色液染核5 min，再用PBS 清洗5 次，每次3 min后用抗熒光猝滅劑封片，在活細(xì)胞工作站觀察并拍照。

1.2.5 不同濃度INHA 處理顆粒細(xì)胞 將第一代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的牦牛卵泡顆粒細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化，全部消化后加入適量的10%全培以1 500 r·min轉(zhuǎn)速離心10 min，再用10%全培把細(xì)胞密度調(diào)至2.0×104個(gè)·mL-1，接種在6 孔板中，顯微鏡下觀察至細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)到60%左右時(shí)，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS 清洗3 次，每次3 min，再加入無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h 進(jìn)行饑餓處理，然后添加不同濃度INHA 的細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)其進(jìn)行處理：INHA 濃度分別為0、1.25、2.5、5、10、20 ng·mL-1，培養(yǎng)12 h后各收集1 mL 6個(gè)不同濃度INHA的細(xì)胞培養(yǎng)液，并棄去剩余的細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS清洗3次，每次3 min，用0.25%胰酶消化細(xì)胞，完全消化后1 500 r·min-1離心10 min，將6 組處理的細(xì)胞加入1 mL PBS 中震蕩并在-80 ℃下反復(fù)凍融6 次（每次60 min，室溫條件下溶解后渦旋），完成6 次凍融后即可提取細(xì)胞內(nèi)容物。以同樣的方法用不同濃度的INHA 處理顆粒細(xì)胞后，分別提取細(xì)胞總RNA。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）檢測(cè)FSHβ、LHβ、FSHR、LHR基因的表達(dá) 用TransZol 試劑盒提取6 組INHA處理的顆粒細(xì)胞RNA，再參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，置于-20 ℃條件下保存。qRT-PCR 反應(yīng)體系共20μL：SYBR Premix Ex TaqⅡ10μL、cDNA 2μL、上下游引物各0.5 μL、H2O 7 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次，利用2-ΔΔct法分析基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）檢測(cè)FSH、LH 含量 將提取的顆粒細(xì)胞上清液和內(nèi)容物在4 ℃、1 500 r·min-1條件下離心15 min，取上清液作為樣品待測(cè)。然后依次參照牛促卵泡素、牛促黃體素酶聯(lián)免疫分析試劑盒的操作步驟進(jìn)行：加標(biāo)準(zhǔn)品、加樣品、加酶、溫育、配液、洗滌、顯色、終止，以450 nm 波長(zhǎng)測(cè)定OD 值。再以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，將樣品OD 值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得出相應(yīng)濃度，再乘以稀釋倍數(shù)即為樣品的實(shí)際濃度。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 單因素方差分析4 種基因的相對(duì)表達(dá)水平，利用SPSS 19.0處理數(shù)據(jù)，用Graphpad prism 7.0制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛卵泡顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)結(jié)果

牦牛原代顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)速度較慢，形態(tài)呈多邊形；第二代顆粒細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰可辨，生長(zhǎng)速度較快，細(xì)胞貼壁較好，形態(tài)近似為梭形，細(xì)胞間出現(xiàn)接觸抑制，細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)到80%以上（圖1）。

圖1 牦牛顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)的生長(zhǎng)情況Fig.1 Growth of yak granulosa cells in vitro culture

2.2 牦牛顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

以第二代牦牛顆粒細(xì)胞培養(yǎng)天數(shù)為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)，繪制顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，結(jié)果生長(zhǎng)曲線呈“平穩(wěn)-上升-平穩(wěn)”的走勢(shì)（圖2）。細(xì)胞培養(yǎng)第1～第2 天為緩慢生長(zhǎng)的潛伏期，第3～第4 天為快速生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期，第5～第8 天細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，此階段為平臺(tái)期。

圖2 牦牛顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve of yak granulosa cells

2.3 FSHR和LHR在牦牛顆粒細(xì)胞中的分布

用FSHR、LHR 蛋白對(duì)牦牛顆粒細(xì)胞進(jìn)行免疫標(biāo)記（圖3），免疫熒光檢測(cè)顯示，DAPI主要在牦牛顆粒細(xì)胞的細(xì)胞核上顯色，F(xiàn)SHR 和LHR 的目的蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)均有表達(dá)，疊加后發(fā)現(xiàn)LHR 在細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)比FSHR強(qiáng)。

圖3 FSHR、LHR在牦牛顆粒細(xì)胞的定位Fig.3 Localization of FSHR，LHR in yak granulosa cells

2.4 不同濃度INHA處理后對(duì)顆粒細(xì)胞FSHβ、LHβ、FSHR、LHR表達(dá)的調(diào)節(jié)

用濃度為0（A）、1.25（B）、2.5（C）、5（D）、10（E）、20 ng·mL-1（F）的INHA 處理第二代牦牛顆粒細(xì)胞12 h，結(jié)果如圖4所示。適當(dāng)濃度的INHA 能明顯改變牦牛顆粒細(xì)胞FSHβ、LHβ、FSHR、LHR的表達(dá)水平。當(dāng)INHA 濃度小于5 ng·mL-1時(shí)，顆粒細(xì)胞中FSHβ的表達(dá)量隨著INHA 濃度的增大而降低；當(dāng)INHA 濃度大于5 ng·mL-1時(shí)，F(xiàn)SHβ的表達(dá)量顯著高于D 處理組。當(dāng)INHA 濃度小于10 ng·mL-1時(shí)，顆粒細(xì)胞中LHβ的表達(dá)量隨著INHA 濃度的增大而降低；當(dāng)INHA 濃度大于10 ng·mL-1時(shí)，LHβ的表達(dá)量顯著高于E處理組。A～F六個(gè)處理組結(jié)果均顯示，隨著INHA 濃度的增大，顆粒細(xì)胞中FSHR和LHR的表達(dá)量逐漸降低（圖4）。

圖4 不同濃度INHA作用牦牛顆粒細(xì)胞后FSHβ、FSHR、LHβ、LHR基因的相對(duì)表達(dá)水平Fig.4 Relative expression levels of FSHβ，F(xiàn)SHR，LHβ，LHR by yak granulosa cells treated with different concentrations of INHA

2.5 不同濃度INHA 處理后對(duì)顆粒細(xì)胞分泌FSH、LH的調(diào)節(jié)

用濃度為0（A）、1.25（B）、2.5（C）、5（D）、10（E）、20 ng·mL-1（F）的INHA 處理第二代牦牛顆粒細(xì)胞12 h，結(jié)果如圖5所示。當(dāng)INHA 濃度為5 ng·mL-1時(shí)，細(xì)胞內(nèi)外FSH 含量均最低；INHA 濃度為10 ng·mL-1時(shí)，細(xì)胞內(nèi)外LH 含量均最低。在細(xì)胞內(nèi)容物中，D 處理組的FSH 含量顯著低于E 處理組，而E 處理組的FSH 含量顯著低于A、B、C、F 處理組；E 處理組的細(xì)胞內(nèi)LH 含量顯著低于D 處理組，而D 處理組的LH 含量顯著低于A、B、C、F 處理組。在細(xì)胞上清液中，D處理組的FSH 含量顯著低于A、B、C、E、F 處理組，而B(niǎo)、C、E、F 處理組的FSH 含量顯著低于A 處理組；細(xì)胞外E 處理組的LH 含量顯著低于A、B、C、D、F 處理組，而B(niǎo)、C、D、F 處理組的LH 含量顯著低于A 處理組。

圖5 不同濃度INHA作用牦牛顆粒細(xì)胞后分泌FSH、LH的激素水平Fig.5 Hormone levels of FSH and LH secreted by yak granulosa cells treated with different concentrations of INHA

3 討論

顆粒細(xì)胞是卵巢中的主要細(xì)胞類(lèi)型，為卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)提供微環(huán)境和物理支持［21］。研究發(fā)現(xiàn)，在不同的細(xì)胞模型中，INHA 被認(rèn)為與細(xì)胞增殖和凋亡有關(guān)，即能促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖并抑制顆粒細(xì)胞凋亡［22］；顆粒細(xì)胞可以維持卵巢的正常功能，當(dāng)顆粒細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)會(huì)導(dǎo)致卵泡閉鎖［23］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，適當(dāng)濃度的INHA 可以降低牦牛卵泡顆粒細(xì)胞中FSH、LH 及其受體的表達(dá)，說(shuō)明INHA 作為雌性動(dòng)物特有的一種激素，對(duì)調(diào)控牦牛生殖機(jī)理具有重要影響。用濃度為0、1.25、2.5、5、10、20 ng·mL-1的INHA 處理牦牛卵泡顆粒細(xì)胞12 h，發(fā)現(xiàn)FSH、LH 在顆粒細(xì)胞內(nèi)容物和細(xì)胞上清液中的含量存在顯著差異，且二者通過(guò)與顆粒細(xì)胞膜上的受體結(jié)合調(diào)節(jié)卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育和排卵［24］，證明INHA對(duì)雌性牦牛的生殖調(diào)控具有重要影響。

哺乳動(dòng)物卵泡的發(fā)育和排卵主要受促性腺激素的調(diào)控，尤其是FSH 和LH 在卵泡不同發(fā)育階段發(fā)揮重要作用［25］。FSH主要促進(jìn)有腔卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育，LH能夠觸發(fā)成熟卵泡排卵，且二者協(xié)同促進(jìn)卵泡中雌激素的分泌［19］。INH 對(duì)卵泡顆粒細(xì)胞中的FSH 和LH 具有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，INH 可以抑制垂體分泌FSH 和LH，而FSH 可以刺激卵泡顆粒細(xì)胞分泌INHA［17］，由此推斷INHA 對(duì)牦牛卵泡顆粒細(xì)胞有重要影響。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，牦牛卵泡顆粒細(xì)胞中FSHβ和LHβ基因的表達(dá)與INHA 呈劑量依賴(lài)性關(guān)系，其表達(dá)量隨INHA 濃度的增大呈先下降后上升的趨勢(shì)，且FSHβ和LHβ表達(dá)量最低時(shí)，INHA 濃度分別接近5 ng·mL-1和10 ng·mL-1，證明INHA 能夠影響FSHβ和LHβ在顆粒細(xì)胞中的表達(dá)，而是顆粒細(xì)胞中兩種基因的表達(dá)量受INHA 濃度變化的影響。

本研究以牦牛卵泡顆粒細(xì)胞為模型進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)，經(jīng)牦牛卵泡顆粒細(xì)胞原代培養(yǎng)后進(jìn)行傳代，獲得了細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定、形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰的第二代牦牛卵泡顆粒細(xì)胞。IF 檢測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)SHR 和LHR 在牦牛顆粒細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)均有表達(dá)，而LHR 在細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)比FSHR 強(qiáng)，說(shuō)明LHR 的作用部位以細(xì)胞質(zhì)為主，F(xiàn)SHR 在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均發(fā)揮作用。由于受體在細(xì)胞內(nèi)需要與相應(yīng)的配體結(jié)合發(fā)揮其作用［26-27］，由此推斷FSH 和LH 對(duì)卵巢發(fā)揮的作用主要由受體決定。

本試驗(yàn)用0、1.25、2.5、5、10、20 ng·mL-1INHA 處理第二代牦牛卵泡顆粒細(xì)胞12 h后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHR和LHR基因在牦牛卵泡顆粒細(xì)胞中的表達(dá)水平隨著INHA 濃度的增大而降低。INHA 明顯抑制FSHR、LHR在顆粒細(xì)胞中的表達(dá)，且抑制作用隨INHA 濃度增大而增強(qiáng)。FSHR 和LHR 能夠與相應(yīng)的配體結(jié)合發(fā)揮作用，INHA的抑制作用明顯降低了FSH、LH 與受體的結(jié)合率，最終導(dǎo)致FSHβ和LHβ基因在顆粒細(xì)胞中的表達(dá)量升高，由此推斷INHA可以降低FSH、LH與其受體的結(jié)合率。

INHA由卵泡顆粒細(xì)胞產(chǎn)生，該物質(zhì)可以對(duì)顆粒細(xì)胞內(nèi)的激素發(fā)揮協(xié)調(diào)作用［28-29］，其中FSH 和LH 直接影響動(dòng)物的發(fā)情、排卵、妊娠等過(guò)程［30］。本研究通過(guò)ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，A～F六個(gè)處理組中，D處理組的顆粒細(xì)胞內(nèi)外FSH 含量顯著低于其他5 個(gè)處理組，而E 處理組的顆粒細(xì)胞內(nèi)外LH 含量顯著低于其他5 個(gè)處理組，說(shuō)明適當(dāng)濃度的INHA 可以減少顆粒細(xì)胞中FSH和LH 的含量，以此證明INHA 可以抑制顆粒細(xì)胞分泌FSH 和LH［9］。將細(xì)胞內(nèi)容物中FSH 和LH 的含量與細(xì)胞上清液中FSH 和LH 的含量相比發(fā)現(xiàn)，除對(duì)照組A外，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)容物中FSH 和LH 含量下降時(shí)，細(xì)胞上清液中FSH 和LH 含量呈上升趨勢(shì)，由此說(shuō)明INHA 對(duì)調(diào)控顆粒細(xì)胞內(nèi)外FSH 和LH 的含量有濃度適應(yīng)性，從而維護(hù)卵巢功能的穩(wěn)定。本試驗(yàn)還需要驗(yàn)證相關(guān)受體在牦牛卵巢和卵泡中的表達(dá)變化規(guī)律。

4 結(jié)論

INHA 對(duì)FSHR 和LHR 在牦牛卵泡顆粒細(xì)胞中的表達(dá)存在明顯的抑制作用，并且影響FSH 和LH 在卵泡中發(fā)揮的作用。研究表明INHA 能抑制牦牛卵泡顆粒細(xì)胞中FSH、LH與其受體的結(jié)合，同時(shí)INHA對(duì)顆粒細(xì)胞內(nèi)外FSH和LH的含量有重要調(diào)節(jié)作用。