李 林

（廣西藝術(shù)學(xué)院 建筑藝術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530007）

翠云草（Selaginella uncinata）是卷柏科（Selaginellaceae）卷柏屬多年生觀賞蕨類；在蔭蔽的栽培環(huán)境下，其葉片呈藍(lán)色。翠云草的藍(lán)色葉與其葉片細(xì)胞壁有關(guān)，是由于其葉片上層表皮外側(cè)細(xì)胞壁內(nèi)的兩層薄膜干涉濾器，引發(fā)光的薄膜干涉[1]。細(xì)胞壁主要組分為纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)、木質(zhì)素、少量蛋白質(zhì)及礦物質(zhì)等，其分布和排列方式共同決定細(xì)胞壁特性[2-3]。在不同細(xì)胞類型甚至是同一細(xì)胞壁上不同部位，均存在細(xì)胞壁胞壁組成及尺寸厚度的差異[4]。近年來，為推動生物質(zhì)能源轉(zhuǎn)化，植物細(xì)胞壁作為可再生能源物質(zhì)，其基礎(chǔ)和應(yīng)用研究進(jìn)展很快。李豐成[5]利用收集到的大群體芒草（Miscanthus）材料，從生物質(zhì)降解轉(zhuǎn)化、能源植物選育及生物質(zhì)合成機(jī)理3個(gè)層面進(jìn)行植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)特征與生物質(zhì)高效利用分子機(jī)理的研究；韋鵬練[6]以毛竹（Phyllostachys edulis）為研究對象，利用現(xiàn)代光譜技術(shù)，從多細(xì)胞、雙細(xì)胞和單細(xì)胞3個(gè)層次，對毛竹細(xì)胞壁主要化學(xué)組分的分布展開研究。細(xì)胞壁作為植物細(xì)胞抵抗外界環(huán)境脅迫的第一道屏障，在細(xì)胞響應(yīng)外界逆境脅迫時(shí)具有重要作用[7]。細(xì)胞壁對逆境的響應(yīng)表現(xiàn)在很多方面，如細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變化、細(xì)胞壁多糖組分變化、結(jié)構(gòu)多糖的修飾變化、細(xì)胞壁蛋白和酶的變化及質(zhì)外體小分子物質(zhì)的動態(tài)變化等[8]。Houston等[9]研究發(fā)現(xiàn)，單子葉植物和雙子葉植物細(xì)胞壁相關(guān)基因?qū)Σ煌≡头巧锩{迫的應(yīng)答相似，細(xì)胞壁在脅迫中具有共同的重塑機(jī)制，即利用細(xì)胞壁相關(guān)基因?qū)?xì)胞壁結(jié)構(gòu)進(jìn)行多樣化修飾，并有一整套精確的脅迫應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子對其進(jìn)行調(diào)控。

翠云草屬蔭生植物，本課題組在項(xiàng)目前期研究中設(shè)計(jì)不同光強(qiáng)處理，利用全光照對翠云草形成脅迫，得到2種顏色差異較大的葉片（翠云草藍(lán)色葉和紅色葉），用于后續(xù)研究[10]。為得到更全面的細(xì)胞壁組成信息，選擇與翠云草同屬的小翠云（S.kraussiana）（葉片為綠色）進(jìn)行對比研究。前期研究通過離子色譜鑒定出翠云草細(xì)胞壁中的10種單糖成分，分別為甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖酸、半乳糖酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和巖藻糖，發(fā)現(xiàn)各單糖組分含量在3種葉片中均差異顯著[11]。造成因素（細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)多糖中的纖維素、半纖維素或果膠質(zhì)）尚不了解。本研究分別提取和測定3種材料細(xì)胞壁中的纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)和木質(zhì)素含量，采用高效液相色譜法（HPLC）測定3種材料中的木質(zhì)素單體，通過比較它們的含量差異，了解翠云草細(xì)胞壁組成特性，為進(jìn)一步挖掘翠云草藍(lán)色葉的關(guān)鍵基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為栽培于廣西大學(xué)林學(xué)院苗圃（108°22'E，22°48'N）3層遮蔭棚下（光強(qiáng)為65～105 μmol·m-2·s-1）的藍(lán)色葉翠云草和綠色葉小翠云、全光照下（光強(qiáng)為500～520 μmol·m-2·s-1）的紅色葉翠云草新鮮葉片。隨機(jī)采集各個(gè)方向正常生長的成熟葉片100 g，粉碎機(jī)粉碎后過40目篩。55℃烘干至恒重，50℃烘箱保存，備用。

1.2 研究方法

試驗(yàn)中用到的主要儀器為WATERS515泵液相色譜儀（515泵、2690分離單元、2470紫外檢測器）、多管架自動平衡離心機(jī)（湖南湘儀TDZ5-WS）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮RE-52AA）、循環(huán)水真空泵（上海東璽SHZ-D型）、SYP智能玻璃恒溫水浴鍋、分光光度計(jì)（Mapada V-1100D）、鼓風(fēng)干燥箱（DHG90A-101AS）、電子天平（島津AOY120）和恒溫?fù)u床（安徽中科HQL150B）。

試劑為纖維復(fù)合酶（寧夏和氏璧公司）、蒽酮和甲基咪唑（上海Sigma-Aldrich公司）。細(xì)胞壁測定相關(guān)試劑均購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2.1 細(xì)胞壁提取

稱取0.1 g左右樣品于研缽中，每份材料3個(gè)重復(fù)。加入1 mL pH 7.0的0.5 mol/L磷酸緩沖液，研磨至勻漿后，離心5 min（3 000×g），去掉上清液；沉淀加入5 mL 0.5 mol/L磷酸緩沖液淋洗2次，再用5 mL蒸餾水淋洗2次，去掉上清液；加入5 mL氯仿-甲醇（1∶1，V∶V），室溫（20～35℃）下150 r/min振蕩1 h后，離心5 min（3 000×g），去掉上清液；加入5 mL甲醇淋洗1次，5 mL丙酮淋洗1次，5 mL蒸餾水淋洗1次，去掉上清液；加入5 mL DMSO-H2O（9∶1，V∶V），室溫振蕩過夜（12 h），離心5 min（3 000×g），去掉上清液；加入5 mL DMSO-H2O淋洗2次，5 mL蒸餾水淋洗3次，去掉上清液，殘?jiān)鼮榇旨?xì)胞壁[5]。沉淀風(fēng)干至恒重，備用。

1.2.2 果膠質(zhì)提取和測定

稱取粗細(xì)胞壁2 mg，加入150 μL草酸銨緩沖液，在沸水中水浴l h，期間每隔10 min搖動1次，離心5 min（14 000×g），取上清液，重復(fù)3次；合并上清液至10 mL容量瓶，定容至刻度；取1 mL加入試管中，加入5 mL 0.012 5 mol/L H2SO4-硼砂，100℃沸水浴5 min；冷卻后，加入100 μL 0.15%間羥基聯(lián)苯溶液，振搖5 min[5]。524 nm處測定吸光度。

標(biāo)準(zhǔn)品處理：取1 mg/mL半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6 mL置于10 mL容量瓶中，加水定容；分別取上述溶液1 mL加入試管，加入5 mL 0.012 5 mol/L H2SO4-硼砂，100℃沸水浴5 min；冷卻后，加入100 μL 0.15%間羥基聯(lián)苯溶液，振搖5 min[5]。以1 mL水為對照。524 nm處測定吸光度。以半乳糖醛酸質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 堿溶半纖維素提取與測定

在提取果膠質(zhì)后的沉淀中加入5 mL 4 mol/L KOH（含1 mg/mL NaHB4），在室溫下提取1 h，期間每10 min輕輕搖動，離心5 min（14 000×g）；沉淀加入5 mL 4 mol/L KOH淋洗1次，5 mL蒸餾水淋洗2次，收集上清液，重復(fù)3次；采用蒽酮比色法測五碳糖（C5）和六碳糖（C6）[5]。620 nm比色，繪制以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)樣品的C6標(biāo)準(zhǔn)曲線；660 nm比色，繪制以木糖為標(biāo)準(zhǔn)樣品的C5標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 酸溶半纖維素提取與測定4 mol/L KOH提取后的殘?jiān)谜麴s水洗滌至中性，將殘?jiān)D(zhuǎn)移至5 mL螺口玻璃瓶，定容至2.5 mL，加入TFA裂解堿不溶半纖維素后，收集上清液，測C5和C6[5]。重復(fù)3次。

1.2.5 纖維素提取與測定

4 mol/L KOH提取后的殘?jiān)谜麴s水洗滌至中性；將殘?jiān)D(zhuǎn)移至100 mL螺口玻璃瓶，加入4 mL 72%（ω/ω）濃硫酸，25℃搖床中150 r/min震蕩1 h；取出玻璃瓶，用蒸餾水定容至10 mL，終止該反應(yīng)；再定容至100 mL，取10 mL上清離心，測C5和C6[5]。

1.2.6 木質(zhì)素含量提取與測定

稱取0.5 g烘干后的樣品，用苯-乙醇（67∶33，V∶V）抽提4 h；抽提的粉末風(fēng)干后，放入250 mL三角瓶中，加入10 mL 72%（ω/ω）濃硫酸，30℃搖床中120 r/min震蕩1.5 h；加入200 mL蒸餾水水解1 h[5]。將水解液用過濾器過濾，蒸餾水沖洗三角瓶3次，獲得濾液；殘?jiān)谜麴s水洗至中性。將殘?jiān)瓦^濾器80℃干燥至恒重，冷卻至室溫，稱重；將殘?jiān)瓦^濾器以575℃灰化4 h，冷卻30 min，稱重。將濾液用2.88%的硫酸稀釋10倍（視樣品而定），紫外分光光度計(jì)比色，測定吸光值，光波長205 nm，空白為2.88%的硫酸。

計(jì)算酸溶木質(zhì)素（ASL，%）、酸不溶木質(zhì)素含量（AIL，%）和總木質(zhì)素含量（%）。計(jì)算公式為[5]：

式中，A為吸收值；D為稀釋倍數(shù)；V為濾液總體積；K為酸溶木質(zhì)素的吸收系數(shù)，取110；W1為樣品質(zhì)量；W2為殘?jiān)瓦^濾器80℃干燥至恒重的重量；W3為殘?jiān)瓦^濾器灰化后的重量。

1.2.7 木質(zhì)素單體提取與測定

稱取0.05 g細(xì)胞壁粉末，加入5 mL 2 mol/L NaOH溶液、0.5 mL硝基苯，加入30 mL二氯甲烷和乙酸乙酯的混合液（1∶1，V∶V）萃取3次，保留水相；用鹽酸將水相pH調(diào)至3～4，用30 mL二氯甲烷和乙酸乙酯的混合液萃取3次；收集有機(jī)相，旋蒸后的殘?jiān)? mL色譜甲醇重新溶解，用0.22 μm孔徑濾膜過濾，取濾液上機(jī)檢測[5]。HPLC檢測木質(zhì)素單體的條件為柱子類型universal C18反相柱（4.6 mm×250 mm）；流動相為甲醇∶水∶冰乙酸=25∶74∶1；流速為1.1 mL/min；波長為280 nm。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行方差分析和多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞壁物質(zhì)組成

3種植物中的細(xì)胞壁物質(zhì)組成相似，均為纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和果膠質(zhì)（表1）。纖維素含量差異顯著（P＜0.05），半纖維素、木質(zhì)素和果膠質(zhì)含量均差異極顯著（P＜0.01）。藍(lán)色葉翠云草中的纖維素、半纖維素含量均最高，木質(zhì)素、果膠質(zhì)含量均最低。

表1 細(xì)胞壁物質(zhì)組成含量Tab.1 Contents of substance compositions of cell walls

2.2 木質(zhì)素單體組成

木質(zhì)素單體H、單體G和單體S含量在3種葉片中均差異極顯著（P＜0.01）（表2）。小翠云木質(zhì)素單體G含量高于單體S，藍(lán)色葉和紅色葉翠云草木質(zhì)素單體組成均表現(xiàn)為單體S＞單體G＞單體H。

表2 木質(zhì)素單體組成Tab.2 Compositions of lignin monomers

小翠云的木質(zhì)素單體H、單體G和單體S含量均最少。木質(zhì)素單體H含量表現(xiàn)為藍(lán)色葉翠云草＞紅色葉翠云草＞小翠云，藍(lán)色葉翠云草的木質(zhì)素單體H含量是小翠云的4.09倍。木質(zhì)素單體G的含量表現(xiàn)為紅色葉翠云草＞藍(lán)色葉翠云草＞小翠云，紅色葉翠云草的木質(zhì)素單體G含量是小翠云的4.32倍。木質(zhì)素單體S含量表現(xiàn)為紅色葉翠云草＞藍(lán)色葉翠云草＞小翠云，紅色葉翠云草的木質(zhì)素單體S含量是小翠云的11.82倍。

2.3 強(qiáng)光脅迫后細(xì)胞壁物質(zhì)含量變化

紅色葉翠云草和藍(lán)色葉翠云草的纖維素含量差異顯著（P＜0.05），半纖維素、木質(zhì)素、果膠質(zhì)、木質(zhì)素單體H、木質(zhì)素單體G和木質(zhì)素單體S含量均差異極顯著（P＜0.01）（表1～2）。紅色葉翠云草的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素單體H含量均低于藍(lán)色葉翠云草，木質(zhì)素、木質(zhì)素單體G、木質(zhì)素單體S和果膠質(zhì)含量均高于藍(lán)色葉翠云草。

3 討論與結(jié)論

3.1 翠云草細(xì)胞壁物質(zhì)組成

纖維素是植物細(xì)胞壁中最主要的成分，含量可達(dá)40%～70%，約占植物干重的1/3[2]。半纖維素是植物細(xì)胞壁中僅次于纖維素的第2大類多糖，約占細(xì)胞壁總量的25%，其通過氫鍵與纖維素微纖絲交聯(lián)，并與木質(zhì)素、果膠質(zhì)通過共價(jià)鍵在細(xì)胞壁基質(zhì)中交聯(lián)形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，共同維持細(xì)胞壁的穩(wěn)定性與完整性[2，12]。木質(zhì)素在植物細(xì)胞壁中廣泛存在，在木本植物成熟的木質(zhì)部中，其含量達(dá)18%～38%，可加強(qiáng)細(xì)胞壁的機(jī)械支持力和抗壓強(qiáng)度,促進(jìn)機(jī)械組織的形成，增加細(xì)胞壁硬度等[13]。本研究中，3種葉片的細(xì)胞壁物質(zhì)組成均為纖維素＞半纖維素＞木質(zhì)素，這3種物質(zhì)之和均占細(xì)胞壁物質(zhì)的90%左右，符合一般規(guī)律。

果膠質(zhì)含量在初生細(xì)胞壁中約占30%，次生細(xì)胞壁中含量很少；其含有較多的多聚物，使細(xì)胞壁具有多孔性，有利于細(xì)胞壁的生長和細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的交流[14]。本研究中，與小翠云、紅色葉翠云草相比，藍(lán)色葉翠云草的纖維素和半纖維素含量均差異顯著或極顯著，果膠質(zhì)含量分別為小翠云和紅色葉翠云草的69.59%和68.75%，差異極顯著。前期研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)色葉和紅色葉翠云草的細(xì)胞壁單糖含量差異顯著[11]。細(xì)胞壁單糖主要由纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)等水解而來，這種差異顯著性可能與這3種成分含量變化有關(guān)。

3.2 翠云草木質(zhì)素單體組成

木質(zhì)素是苯丙烷類的衍生物，是由苯丙烯鹽基醇轉(zhuǎn)化形成的香豆醇（單體G）、松柏醇（單體S）和芥子醇（單體H）等酚類單體聚合形成的多聚物，主要出現(xiàn)在次生壁中[15]。木質(zhì)素單體組成隨產(chǎn)地、樹種、部位、細(xì)胞類型和細(xì)胞壁層不同而變化[16]。針葉木主要含有木質(zhì)素單體G，闊葉木主要含有木質(zhì)素單體G和單體S，兩種木材均含有少量的木質(zhì)素單體H；禾本科（Gramineae）類植物的木質(zhì)素主要由木質(zhì)素單體G、單體S和單體H組成[17]。王健等[18]研究發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛（Dendrobium officinale）莖中主要含有木質(zhì)素單體G和單體S及微量的單體H。Weng等[19]發(fā)現(xiàn)與翠云草同屬的江南卷柏（S.moellendorffii）細(xì)胞壁中含有大量木質(zhì)素單體S。本研究結(jié)果表明，翠云草細(xì)胞壁木質(zhì)素以木質(zhì)素單體S為主，含微量的木質(zhì)素單體H。同屬的小翠云細(xì)胞壁以木質(zhì)素單體G和單體S為主，木質(zhì)素單體G含量比單體S稍高，含微量木質(zhì)素單體H。說明同屬的植物，其木質(zhì)素單體組成存在差異。

3.3 翠云草逆境響應(yīng)

研究表明，植物細(xì)胞壁中的纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)和結(jié)構(gòu)蛋白等大分子物質(zhì)中含有較多負(fù)電基團(tuán)，可與金屬陽離子發(fā)生各種物理、化學(xué)反應(yīng)，將其固定于細(xì)胞壁中，減少重（類）金屬對植物的毒害[20]。Zhan等[21]發(fā)現(xiàn)，在Pb和Cd脅迫下，華中蹄蓋蕨（Athyrium wardii）為緩解毒性，其細(xì)胞壁會產(chǎn)生更多的果膠質(zhì)和半纖維素1，提高重金屬離子固定能力。Yang等[22]發(fā)現(xiàn)，給大豆（Glycine max）根系施加0.2～1.0 mmol/L的Cd，其根系細(xì)胞壁中的木質(zhì)素含量增加。本研究中，紅色葉翠云草受到強(qiáng)光脅迫，與藍(lán)色葉翠云草相比，其纖維素、半纖維素和木質(zhì)素單體H的含量均下降，果膠質(zhì)、木質(zhì)素、木質(zhì)素單體S和單體G含量分別為藍(lán)色葉翠云草的1.45、1.32、2.84和2.52倍。說明果膠質(zhì)和木質(zhì)素（單體S和單體G）在逆境響應(yīng)中發(fā)揮更大的作用，可能與緩解重金屬對植物的毒害作用相似，但還需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

本研究對翠云草細(xì)胞壁組成特性進(jìn)行初步探究，為進(jìn)一步挖掘翠云草藍(lán)色葉的關(guān)鍵基因奠定基礎(chǔ)。但研究還缺乏相應(yīng)的分子基礎(chǔ)，下一步工作可以結(jié)合前期研究中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從苯丙烷代謝途徑中尋找相應(yīng)的分子基礎(chǔ)，挖掘翠云草藍(lán)色葉的細(xì)胞壁合成關(guān)鍵基因。