衰老細(xì)胞清除劑ABT-263聯(lián)合替莫唑胺治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增敏作用及機(jī)制

陳寅南，于田雨，郭曉龍，范 姝，白甜田，李昕沛*

0 引言

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Glioblastoma multiform，GBM)具有生長(zhǎng)迅速、侵襲性強(qiáng)等特性，是最常見(jiàn)和最致命的腦腫瘤之一[1]。替莫唑胺(Temozolomide，TMZ)作為新一代烷化劑是臨床治療GBM的標(biāo)準(zhǔn)一線化療藥，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，包括惡性膠質(zhì)瘤的化療中發(fā)揮了重要作用。然而，臨床研究表明,TMZ對(duì)GBM的有效率僅為45%[2]，對(duì)復(fù)發(fā)性膠質(zhì)瘤的療效更低，其中獲得性耐藥是治療失敗的主要原因[3]。盡管TMZ誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞死亡主要是由凋亡引起的，但腫瘤細(xì)胞也會(huì)發(fā)生自噬和衰老[4]，而衰老的腫瘤細(xì)胞可以繞過(guò)復(fù)制性衰老并恢復(fù)分裂，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展和獲得性耐藥[5]。ABT-263是B細(xì)胞淋巴瘤2(Bcl-2)蛋白家族抗凋亡蛋白的抑制劑，其對(duì)Bcl-2活性的抑制作用可誘導(dǎo)多種組織衰老細(xì)胞發(fā)生凋亡[6]。本研究將采用“two-hit”聯(lián)合療法[7]，探討衰老細(xì)胞清除劑ABT-263與TMZ聯(lián)合用藥方案對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響及作用機(jī)制，為克服TMZ在臨床治療GBM產(chǎn)生的耐藥性提供新的解決思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào)371，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(型號(hào)VARZOSKAN，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；熒光倒置顯微鏡(型號(hào)DMIL/DFC450C，德國(guó)Leica公司)；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀(型號(hào)Amersham ImageQuant 800，美國(guó)Cytiva公司)。

1.2 試劑 ABT-263，替莫唑胺均購(gòu)于上海陶術(shù)生物科技有限公司；SA-β-gal檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；EdU染色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；MTT試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；P53、P21、Caspase3、Bcl-2、Bax、PARP1、Gapgh、Tubulin以及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.3 細(xì)胞株 上皮細(xì)胞樣貼壁生長(zhǎng)星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U87MG購(gòu)自北京北納生物技術(shù)研究院。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) U87MG細(xì)胞解凍復(fù)蘇后，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)皿置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中。每2天更換1次培養(yǎng)液，待細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)皿底部70%～80%時(shí)，用胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行傳代，每次取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 SA-β-gal染色檢測(cè)U87MG細(xì)胞的衰老 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87MG細(xì)胞，以3×105個(gè)/孔細(xì)胞密度接種于24孔板中培養(yǎng)，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌1次，加入1 ml β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15 min。用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次3 min，然后每孔加入1ml染色工作液。37 ℃孵育過(guò)夜，光學(xué)顯微鏡下圖像放大200倍觀察，計(jì)數(shù)。設(shè)置對(duì)照組、TMZ組、TMZ+ABT組，每組3個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組細(xì)胞不進(jìn)行干預(yù)，TMZ組加入終濃度為200 μmol/L的TMZ處理細(xì)胞，TMZ+ABT組加入終濃度為2 μmol/L的ABT-263及終濃度為200 μmol/L的TMZ處理細(xì)胞。

2.3 MTT法檢測(cè)U87MG細(xì)胞存活情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87MG細(xì)胞，消化，重懸，以2.5×104個(gè)/ml的細(xì)胞密度接種于干凈無(wú)菌的96孔培養(yǎng)板中，每孔接種198 μl細(xì)胞懸液，待細(xì)胞貼壁且生存狀態(tài)良好時(shí)分組給藥。設(shè)TMZ組和TMZ+ABT組，將配制的不同濃度的待測(cè)樣品溶液分別加到96孔板中，每孔2 μl，使得每孔培養(yǎng)基總體積為200 μl，TMZ終濃度梯度為0、10、20、40、80、150、300、500、1 000 μmol/L，ABT終濃度為2 μmol/L，每個(gè)濃度下設(shè)6個(gè)復(fù)孔。處理結(jié)束后放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育72 h。取出96孔板，每孔加入3-(4，5)-2-噻唑-(2，5)-二苯基溴化四氮唑藍(lán)[3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-pheny-tetrazoliumromide，MTT] 20 μl，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μl二甲基亞砜(dimethyl-surfoxide，DMSO)，避光震蕩溶解，測(cè)定各孔490 nm處的吸光度(A)，計(jì)算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力=實(shí)驗(yàn)組A值/空白對(duì)照組A值。

2.4 EdU染色檢測(cè)U87MG細(xì)胞增殖能力 調(diào)整細(xì)胞密度為3×105/孔并接種于24孔板上，培養(yǎng)72 h后，按照EdU染色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色、固定、封片，用LAS AF Lite圖像處理軟件放大40倍觀察，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。設(shè)置對(duì)照組，TMZ組、TMZ+ABT組，每組3個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組細(xì)胞不進(jìn)行干預(yù)，TMZ組加入終濃度為200 μmol/L TMZ處理細(xì)胞，TMZ與ABT聯(lián)用組加入終濃度為2 μmol/L的ABT-263及終濃度為200 μmol/L的TMZ處理細(xì)胞。

2.5 劃痕試驗(yàn)檢測(cè)U87MG細(xì)胞遷移能力 將細(xì)胞重懸以1×105個(gè)/孔接種于6孔板中，待每孔細(xì)胞融合度達(dá)90%以上，用10 μl白色槍頭卡著直尺垂直6孔板底部橫平豎直劃十字。用PBS洗去脫落的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。設(shè)置對(duì)照組、TMZ組、TMZ+ABT組，每組3個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組細(xì)胞不進(jìn)行干預(yù)，TMZ組加入終濃度為200 μmol/L的TMZ處理細(xì)胞，TMZ+ABT組加入終濃度為2 μmol/L的ABT-263及終濃度為200 μmol/L的TMZ處理細(xì)胞。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育，倒置顯微鏡采集給藥30 h時(shí)的圖像，圖像放大100倍觀察。

2.6 蛋白印跡法檢測(cè)U87MG細(xì)胞中P53、P21、Bcl-2、Bax、PARP1和Caspase3蛋白的表達(dá) U87MG細(xì)胞分為8組：對(duì)照組、TMZ(10 μmol/L)低劑量組、TMZ(50 μmol/L)中劑量組、TMZ(200 μmol/L)高劑量組、ABT-263(2 μmol/L)組、TMZ(10 μmol/L)+ABT(2 μmol/L)低劑量組、TMZ(50 μmol/L)+ABT(2 μmol/L)中劑量組、TMZ(200 μmol/L)+ABT(2 μmol/L)高劑量組。細(xì)胞裂解法提取各組細(xì)胞總蛋白，利用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量后，沸水變性蛋白，于-20 ℃保存。將各組蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗(P53、P21、Caspase3、PARP1、Bcl-2、Bax、Gapdh，Tubulin稀釋比例為1∶1 000)4 ℃過(guò)夜孵育，TBST漂洗，加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h，DAB顯色。全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀中曝光，進(jìn)行灰度分析。蛋白表達(dá)水平均為目的蛋白條帶灰度值與相應(yīng)內(nèi)參條帶灰度值的比值。

2.7 轉(zhuǎn)錄組基因測(cè)序分析不同藥物治療組中U87MG細(xì)胞基因的表達(dá)差異 U87MG細(xì)胞用Trizol溶液裂解，加入氯仿，將RNA提取至水相。將水相取出，用異丙醇沉淀回收RNA。70%的乙醇漂洗RNA沉淀后棄去液體，將RNA沉淀晾干至半透明，最后加30 μl ddH2O復(fù)溶。設(shè)置4個(gè)治療組，分別為：對(duì)照組、TMZ(100 μmol/L)組、TMZ(100 μmol/L)+ABT(1 μmol/L)低劑量組、TMZ(100 μmol/L)+ABT(2 μmol/L)高劑量組。各組細(xì)胞提取總RNA后，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)測(cè)定基因表達(dá)量。對(duì)照組和TMZ組重復(fù)2個(gè)樣本，TMZ+ABT高、低劑量組各1個(gè)樣本。利用fastQC對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，cutadapter去除接頭和低質(zhì)量的序列后，Salmon軟件進(jìn)行基因定量。根據(jù)DESeq2的建議，將4組共6個(gè)樣本一起使用負(fù)二項(xiàng)分布建模，通過(guò)改變r(jià)esults函數(shù)中的contrast參數(shù)來(lái)提取組間差異分析結(jié)果，解決TMZ+ABT高、低劑量組沒(méi)有重復(fù)的問(wèn)題。差異分析的統(tǒng)計(jì)分析使用Wald檢驗(yàn)完成。我們以log2 transformed fold-change>2且Benjamini-Hochberg adjusted P-values<0.1作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，得到差異表達(dá)基因。利用Metascape工具，將差異表達(dá)基因富集到不同的生物過(guò)程和通路中。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，作圖工具采用Graphpad Prism 6.0。正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 ABT-263對(duì)TMZ誘導(dǎo)U87MG細(xì)胞衰老的影響 與對(duì)照組相比，TMZ(200 μmol/L)組細(xì)胞衰老發(fā)生率升高(P<0.05)；與TMZ(200 μmol/L)組相比，TMZ(200 μmol/L)+ABT(2 μmol/L)組細(xì)胞衰老發(fā)生率降低(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 各組U87MG細(xì)胞衰老情況注：con：對(duì)照；TMZ：替莫唑胺；ABT：ABT-263。*P<0.05

3.2 ABT-263對(duì)TMZ抑制U87MG細(xì)胞增殖的影響 與TMZ組相比，TMZ+ABT組U87MG細(xì)胞存活能力顯著下降(P<0.05)，見(jiàn)圖2和表1。

圖2 各組U87MG細(xì)胞存活能力注：TMZ：替莫唑胺；ABT：ABT-263

與對(duì)照組相比，TMZ(200 μmol/L)組EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05)；與TMZ(200 μmol/L)組相比，TMZ(200 μmol/L)+ABT(2 μmol/L)組EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

表1 各組U87MG細(xì)胞IC50值

3.3 ABT-263對(duì)TMZ抑制U87MG細(xì)胞遷移的影響 與對(duì)照組相比，TMZ(200 μmol/L)組U87MG細(xì)胞遷移速率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與TMZ(200 μmol/L)組相比，TMZ(200 μmol/L)+ABT(2 μmol/L)組的U87MG細(xì)胞遷移速率顯著減慢(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

圖3 各組U87MG細(xì)胞增殖能力注：con：對(duì)照；TMZ：替莫唑胺；ABT：ABT-263。*P<0.05

圖4 各組U87MG細(xì)胞遷移情況注：con：對(duì)照；TMZ：替莫唑胺；ABT：ABT-263。*P<0.05

3.4 ABT-263聯(lián)合不同濃度TMZ對(duì)U87MG細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，TMZ(10 μmol/L)低劑量組、TMZ(50 μmol/L)中劑量組、TMZ(200 μmol/L)高劑量組3個(gè)單藥給藥組U87MG細(xì)胞中P21蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，P53蛋白的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與相同TMZ劑量單藥給藥組相比，低、中、高劑量TMZ與ABT(2 μmol/L)聯(lián)用后，P21蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，TMZ(10 μmol/L)+ABT(2 μmol/L)組的P53蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖5和表2。

圖5 各組U87MG細(xì)胞中P53和P21蛋白的表達(dá)水平注：TMZ：替莫唑胺

表2 各組U87細(xì)胞中P53和P21蛋白的表達(dá)水平的比較(n=6)

與對(duì)照組相比，TMZ(10 μmol/L)低劑量組、TMZ(50 μmol/L)中劑量組、TMZ(200 μmol/L)高劑量組3個(gè)單藥給藥組U87MG細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而PARP1和Caspase3蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與相同TMZ劑量單藥給藥組相比，中、高劑量TMZ與ABT(2 μmol/L)聯(lián)用處理后，U87MG細(xì)胞中PARP1剪切體蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；中、低劑量TMZ與ABT聯(lián)用處理U87MG細(xì)胞后，Bax蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；低、中、高劑量TMZ與ABT聯(lián)用處理后，U87MG細(xì)胞中Bcl-2和Caspase3蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖6和表3。

圖6 各組U87MG細(xì)胞中Bcl-2、Bax、PARP1和Caspase3蛋白的表達(dá)水平注：TMZ：替莫唑胺

表3 各組U87細(xì)胞中Bcl-2、Bax、PARP1和Caspase3蛋白表達(dá)水平比較(n=6)

3.5 不同濃度ABT-263聯(lián)合TMZ對(duì)U87MG細(xì)胞基因表達(dá)的影響 與TMZ(100 μmol/L)組相比，TMZ(100 μmol/L)與高、低劑量ABT(1 μmol/L、2 μmol/L)聯(lián)合處理U87MG細(xì)胞后,能夠顯著改變的差異表達(dá)基因(Differentially expressed genes,DEGs)共有312個(gè)，其中上調(diào)基因141個(gè)，下調(diào)基因171個(gè)。通過(guò)富集分析各組DEGs，發(fā)現(xiàn)TMZ+ABT組顯著上調(diào)的DEGs有：CC趨化因子(CCL2、CCL3、CCL20)、炎癥因子(IL1A、IL1B、IL12A)、CXC趨化因子(CXCL1、CXCL5)、凋亡調(diào)節(jié)因子(BCL2L1)、集落刺激因子3(CSF3)等；顯著下調(diào)的DEGs有膠原原纖維組織相關(guān)基因(COL1A1、COL1A2、COL3A1、COL5A1)、ADM、ADCY8、SERPINH1等，富集分析涉及多條炎癥反應(yīng)以及與調(diào)控細(xì)胞過(guò)程相關(guān)的通路，見(jiàn)圖7。

4 討論

腦膠質(zhì)瘤起源于腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，是最常見(jiàn)的原發(fā)性腦腫瘤[8]。腦膠質(zhì)瘤中50%以上是惡性程度最高的多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[1]。依據(jù)世界衛(wèi)生組織中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類，腦膠質(zhì)瘤分為I、II級(jí)低級(jí)別腦膠質(zhì)瘤，III、IV級(jí)高級(jí)別腦膠質(zhì)瘤。GBM屬于IV級(jí)，具有生長(zhǎng)迅速、侵襲性強(qiáng)等特性，雖可通過(guò)手術(shù)切除但極易復(fù)發(fā)，預(yù)后差，因此，臨床迫切需要探明GBM有效的治療方式。

圖7 各組轉(zhuǎn)錄組基因分析結(jié)果注：A.各組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的PCA分析;B.各組差異基因火山圖分析;C.差異表達(dá)基因的維恩圖分析;D.部分差異表達(dá)基因富集分析。ABT(Low)：ABT 1 μmol/L，ABT(High)：ABT 2 μmol/L

目前對(duì)GBM的治療采用手術(shù)和放化療的綜合治療方式。TMZ是臨床治療惡性腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤的標(biāo)準(zhǔn)一線化療藥。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤術(shù)后放療聯(lián)合TMZ化療可以提高惡性腦膠質(zhì)瘤患者的生存率和生存時(shí)間。然而，TMZ治療有限，即使經(jīng)過(guò)積極系統(tǒng)的綜合治療，GBM中位生存期僅12～15個(gè)月，只有4.7%的患者生存期超過(guò)5年[4]。TMZ(分子量為194.15)作為新一代烷化劑，生物利用度為100%,抗腫瘤活性廣，可引起DNA上O6-烷基鳥(niǎo)嘌呤發(fā)生甲基化。該藥進(jìn)入體內(nèi)不經(jīng)肝臟代謝,廣泛分布于全身，可透過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦脊液，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)達(dá)到有效的藥物濃度。許多體外研究表明，在TMZ誘導(dǎo)下的膠質(zhì)瘤細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡、自噬和衰老[9]，而細(xì)胞衰老一方面導(dǎo)致了生物的衰老，另一方面還可作為抑癌機(jī)制發(fā)揮機(jī)體保護(hù)作用[10]。研究發(fā)現(xiàn)，在TMZ誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生衰老后，衰老的腫瘤細(xì)胞在TMZ停止刺激1周后，恢復(fù)了增殖能力，重新開(kāi)始生長(zhǎng)[11]。治療誘導(dǎo)的癌細(xì)胞衰老(Therapy-induced senescence，TIS)有時(shí)通過(guò)抑制增殖來(lái)提高治療效果，有時(shí)卻為存活的腫瘤干細(xì)胞創(chuàng)造了一個(gè)有利的生長(zhǎng)微環(huán)境，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤復(fù)發(fā)[12-13]。因此，采用衰老細(xì)胞裂解法與TMZ聯(lián)合，清除TMZ誘導(dǎo)后衰老的腫瘤細(xì)胞，可以增強(qiáng)TMZ的治療效果。本研究顯示，ABT-263聯(lián)合TMZ處理U87MG細(xì)胞后,細(xì)胞衰老發(fā)生率顯著降低，提示ABT-263可有效清除TMZ誘導(dǎo)產(chǎn)生的衰老細(xì)胞，防止腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)衰老細(xì)胞表型逃避細(xì)胞凋亡[14-15]。同時(shí)，ABT-263聯(lián)合TMZ處理U87MG細(xì)胞可顯著抑制U87MG細(xì)胞的增殖以及遷移能力。

細(xì)胞衰老的標(biāo)志是DNA損傷反應(yīng)的激活和細(xì)胞周期的停滯。有研究表明，TMZ通過(guò)激活A(yù)TR/CHK1、P53/P21和NF-κB途徑誘導(dǎo)GBM發(fā)生G2-M細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞衰老,從而避免凋亡[16-17]。P21是一種重要的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白。它參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、衰老及死亡過(guò)程，同時(shí)又與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，可作為細(xì)胞衰老的標(biāo)志。本研究顯示，TMZ+ABT組中具有DNA復(fù)制能力的細(xì)胞顯著減少，各聯(lián)合給藥組細(xì)胞中P21蛋白表達(dá)水平顯著降低，即U87MG細(xì)胞中衰老細(xì)胞減少，提示ABT-263聯(lián)合TMZ可有效抑制U87MG細(xì)胞的DNA復(fù)制過(guò)程并減少衰老細(xì)胞的產(chǎn)生。

衰老細(xì)胞通過(guò)上調(diào)Bcl-2家族基因(Bcl-xL、Bcl-2、Bcl-w、Mcl-1等)的表達(dá)來(lái)避免凋亡，抑制Bcl-2家族基因的表達(dá)能夠恢復(fù)細(xì)胞程序性死亡的自然過(guò)程。ABT-263是一種Bcl-2家族基因抑制劑，能夠破壞Bcl-2/Bcl-xL對(duì)促死亡蛋白的鰲合作用，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[18]。本研究顯示，ABT-263聯(lián)合TMZ一定劑量下促使Bax蛋白的表達(dá)水平顯著升高，同時(shí)Bcl-2蛋白的表達(dá)水平也隨之升高，提示ABT-263聯(lián)合TMZ處理U87MG細(xì)胞后，可提高TMZ單藥處理U87MG細(xì)胞中Bax蛋白的蓄積量，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。作為一種負(fù)反饋調(diào)節(jié)，Bcl-2蛋白的蓄積量也有所上升。Caspase3作為細(xì)胞凋亡核心成員，是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末剪切酶。PARP是DNA修復(fù)酶，在DNA損傷修復(fù)與細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用。PARP是Caspase3主要的切割底物，PARP剪切被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要指標(biāo)。本研究顯示，TMZ(10、50、100 μmol/L)與ABT(2 μmol/L)聯(lián)合組處理U87MG細(xì)胞后可提高TMZ單藥處理U87MG細(xì)胞中Caspase3蛋白的蓄積量，而TMZ(50、100 μmol/L)聯(lián)合ABT(2 μmol/L)組U87MG細(xì)胞內(nèi)PARP1剪切體蓄積量顯著增加，提示ABT-263聯(lián)合TMZ處理細(xì)胞可促使由TMZ誘導(dǎo)的U87MG衰老細(xì)胞發(fā)生凋亡。此外，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析提示ABT-263聯(lián)合TMZ處理U87MG細(xì)胞后，多條參與炎癥反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)分化以及衰老相關(guān)的通路被激活。

綜上所述，ABT-263聯(lián)合TMZ可以抑制U87MG細(xì)胞的增殖和遷移，在一定程度上清除由TMZ誘導(dǎo)的U87MG衰老細(xì)胞，干擾處于生長(zhǎng)停滯的腫瘤細(xì)胞的恢復(fù)能力，防止疾病復(fù)發(fā)。本研究為解決TMZ耐藥提供一種新的策略，對(duì)衰老細(xì)胞裂解法聯(lián)合化療藥物應(yīng)用于臨床治療GBM提供理論支持和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。