馬 寧 李興杰 姜鴻宇 徐國鋒 王 星 張宗德

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院炎癥與變態(tài)反應(yīng)實驗室，瀘州 646000）

CD83分子在許多細胞中均有表達，但主要由活化的免疫細胞，如樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）、B細胞和T細胞等表達和分泌。CD83是成熟DCs高度穩(wěn)定表達的Ⅰ型跨膜糖蛋白，被認為是DCs成熟的標(biāo)志物。DCs是體內(nèi)最重要的抗原呈遞細胞，DCs成熟后通過釋放特定細胞因子調(diào)控CD4+T細胞的分化，發(fā)揮其在抵抗病原感染引起免疫反應(yīng)中的核心作用。大量研究表示，不同病毒可以調(diào)節(jié)CD83的表達水平改變DCs的功能。皰疹病毒能夠通過靶向CD83形成獲得性免疫逃逸機制［1］。水痘帶狀皰疹病毒感染時可選擇性抑制DCs上CD83的表達［2-3］。相反，在前期研究中，本課題組發(fā)現(xiàn)禽流感病毒及其神經(jīng)氨酸酶能夠上調(diào)DCs和巨噬細胞表面CD83表達，進而促使小鼠產(chǎn)生急性肺部炎癥［4］。由此可見，CD83在病毒感染致病過程中發(fā)揮重要作用。

CD83通常以膜結(jié)合型和可溶性型兩種形式表達。在正常人類血清中能檢測到從活化的DC和B細胞中釋放的可溶性CD83（soluble CD83，sCD83），這種sCD83具有很強的免疫抑制功能［5］。有研究表明，sCD83可抑制單核細胞向DCs分化，改變DCs的細胞骨架，阻止DCs成熟，并降低DCs介導(dǎo)的T細胞增殖［6-8］。此外，sCD83可作為免疫抑制劑在自身免疫系統(tǒng)疾病及器官移植排斥反應(yīng)中發(fā)揮抗炎作用［9-10］。另有研究表明，CD83單克隆抗體能夠抑制DCs成熟發(fā)揮免疫抑制功能［11］。靶向CD83可以抑制小鼠自身免疫性疾病和過敏反應(yīng)［12-13］。此外，特異性抑制CD83可減輕單純皰疹病毒感染引起的小鼠全身炎癥反應(yīng)［14］。這些研究提示，在自身免疫系統(tǒng)疾病、過敏及病毒感染等條件下，使用sCD83或CD83抗體特異性靶向CD83處理，能夠發(fā)揮免疫抑制作用，展現(xiàn)抗炎、抗病毒效果。

本研究首先通過構(gòu)建鼠源CD83胞外結(jié)構(gòu)域（Met1-Arg133）的重組質(zhì)粒，將質(zhì)粒在TOP10F'原核表達系統(tǒng)中表達。其次，通過包涵體變性、復(fù)性純化獲得了CD83重組蛋白。最后，使用純化獲得的CD83重組蛋白及QuickAntibody-2W免疫佐劑免疫SD大鼠2周，獲得了滴度高、特異性強的CD83多克隆抗體。本研究為后續(xù)sCD83和CD83抗體在抗炎、抗病毒過程中的免疫抑制機制的研究提供了支持。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種、細胞株及表達質(zhì)粒 表達宿主菌TOP10F'感受態(tài)購自昂宇生物公司。肺巨噬細胞系Raw264.7購自中國科學(xué)院干細胞庫。pGEX-2TCD83（Met1-Arg133）表達質(zhì)粒由優(yōu)寶生物構(gòu)建。

1.1.2主要試劑LB肉湯、氨芐西林（Ampcillin，Amp）、Tris-HCl、NaCl、甘 油、EDTA、聚 乙 二 醇PEG6000、十二烷基肌氨酸鈉（SKL）、二硫蘇糖醇（DTT）、IPTG、氧化型谷胱甘肽（GSSG）、還原型谷胱甘肽（GSH）購自索萊寶科技有限公司；BeyoGoldTMGST-tag Purification Resin、考馬斯亮藍超快染色液、GST Mouse Monoclonal Antibody、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗大鼠IgG（H+L）、辣根過氧化物酶標(biāo)記驢抗山羊IgG（H+L）購自碧云天生物技術(shù)有限公司（Beyotime）；CD83 Polyclonal Antibody（PA5-47138）、山羊抗大鼠IgG（H+L）交叉吸附二抗Alexa Fluor 488（A-11006）購自Invitrogen公司；CD83-Fc重組蛋白購自Sino biological公司。

1.1.3實驗動物 體質(zhì)量約300 g的SD大鼠購自西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.2方法

1.2.1重組菌誘導(dǎo)表達 將pGEX-2T-CD83（Met 1-Arg 133）質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至TOP10F'感受態(tài)后，涂布至LB+Amp（100 μg/ml）培養(yǎng)平板上，O/N培養(yǎng)。挑取單個克隆接種至5 ml LB+Amp培養(yǎng)液中，37℃、150 r/min擴增培養(yǎng)。當(dāng)OD600nm達到0.6～0.9時，將5 ml培養(yǎng)液全部轉(zhuǎn)移至含有400 ml LB+Amp培養(yǎng)液的三角瓶中繼續(xù)培養(yǎng)至OD600nm約為0.8時，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，25℃誘導(dǎo)表達12～16 h。收集菌體，用無菌PBS懸浮洗滌沉淀3次后，保存于-80℃條件下。

1.2.2包涵體復(fù)性

1.2.2.1包涵體超聲破碎 稱重回收獲得菌體沉淀，按照1 g/35 ml的比例加入buffer A（50 mmol/L Tris-HCl，0.5 mmol/L EDTA，50 mmol/L NaCl，5%甘油，5 mmol/L DTT，pH7.9）重懸菌體，液氮反復(fù)凍融3次；在冰浴中超聲破碎菌體（功率200 W，工作8 s，間歇6 s）；超聲破碎5 min，4℃、10 000 r/min離心10 min，回收包涵體沉淀。

1.2.2.2包涵體洗滌 使用無菌PBS洗滌回收得到的包涵體沉淀，重復(fù)3次，4℃、10 000 r/min離心10 min，收集包涵體沉淀。

1.2.2.3包涵體變性 向1.2.2.2中回收得到的包涵體中按比例加入buffer A及20%SKL貯存液，使得SKL終濃度為0.3%，劇烈攪動使沉淀慢慢溶解，4℃靜置約6 h溶解；將溶解懸液4℃、10 000 r/min離心10 min，收集上清。

1.2.2.4包涵體復(fù)性 向1.2.2.3中回收得到的上 清 液 中 加 入20%PEG6000、50 mmol/L GSSG和100 mmol/L GSH至終濃度分別為0.2% PEG6000、1 mmol/L GSSG和2 mmol/L GSH；4℃、O/N靜 置復(fù)性。

1.2.2.5透析 將1.2.2.4中復(fù)性得到的溶液裝入MD44（3500D）透析袋中；在4℃條件下，使用無菌PBS進行攪拌透析，每12 h換液1次，24 h后回收復(fù)性液。

1.2.2.6蛋白結(jié)合及洗脫 回收1.2.2.5中得到的復(fù)性液，按500 μl/35 ml的比例加入BeyoGoldTMGST-tag Purification Resin，4℃旋轉(zhuǎn)結(jié)合3 h；將結(jié)合后的復(fù)性液加入親和層析柱空柱管進行流穿，PBS洗滌GST-resin后，用溶出液（buffer A+50 mmol/L Tris-HCl、12 mmol/L GSH），按2 min/滴的流速洗脫溶出。每500μl為1個溶出組分，回收至第4個溶出組分。

1.2.3SDS-PAGE、Western blot及ELISA檢測目的蛋白活性

1.2.3.1SDS-PAGE、Western blot將洗脫獲得的樣品進行SDS-PAGE，電泳完成后將凝膠用去離子水洗滌5 min，棄去離子水加入適量的考馬斯亮藍超快染色液，室溫水平搖動染色1 h；染色完成后回收染色液，加入適量去離子水洗滌5 min；棄去離子水，將冰乙酸∶乙醇∶去離子水按1∶4∶5混合配制洗脫液洗脫凝膠；當(dāng)?shù)鞍讞l帶清晰后拍照，使用Image J計算各蛋白條帶灰度值；以BSA相應(yīng)濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量洗脫樣品中CD83蛋白的濃度；或?qū)㈦娪就瓿珊竽z進行Western blot，檢測CD83目的蛋白的特異性。

1.2.3.2ELISA檢測蛋白活性 將唾液酸凝集素SNA（20 μg/ml）包被于ELISA板上，4℃孵育過夜。經(jīng)1%BSA封閉后，將GST-CD83重組蛋白（10μg/ml）及CD83-Fc蛋白（10 μg/ml）加入到板孔中，與SNA在37℃孵育3 h。1×PBST洗平板2次，然后用CD83一抗在室溫孵育1 h。經(jīng)1×PBST洗滌后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記驢抗山羊IgG標(biāo)記的二抗。用TMB顯色液顯色，在450 nm下讀取吸光值。

1.2.4制備多克隆抗體

1.2.4.1免疫大鼠 將純化獲得的CD83重組蛋白與QuickAntibody-2W免疫佐劑等體積混合，通過后腿小腿肌肉注射免疫SD大鼠，每只SD大鼠左、右腿各注射1針，免疫劑量約為200μg/只；待免疫7 d后等劑量加強免疫1次；當(dāng)合計免疫14 d時尾靜脈采血，檢測血清效價；當(dāng)血清效價達1∶104～1∶105時，取大鼠腹主動脈血；4℃、O/N靜置后，3 000 r/min離心10 min回收血清。

1.2.4.2血清效價檢測 將純化得到的CD83重組蛋白稀釋后按100μg/ml與包被液混合，4℃、O/N包被于酶標(biāo)板中；經(jīng)1×PBST洗滌3次、1%BSA封閉后，將免疫所得血清用1×PBST按1∶10稀釋至1∶108后加入酶標(biāo)板中，37℃孵育1 h；以未免疫大鼠的血清作為陰性對照；經(jīng)1×PBST洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗大鼠IgG（H+L）二抗，37℃孵育1 h；經(jīng)1×PBST洗滌后加入TMB顯色液顯色，測定效價［28］。

1.2.4.3免疫熒光染色 將肺巨噬細胞Raw264.7在有蓋玻片的24孔板中培養(yǎng)至對數(shù)期，經(jīng)1×PBST洗滌后，用4%甲醛固定。經(jīng)1×PBST洗滌3次后，用1%BSA封閉。用免疫大鼠所得的CD83多克隆抗體進行孵育，4℃過夜。次日，用Alexa Fluor 488山羊抗大鼠IgG二抗孵育1 h。最后，運用DAPI進行細胞核染色后觀察。圖像采用奧林巴斯FV1000共焦顯微鏡在恒定曝光時間下獲得。

2 結(jié)果

2.1CD83載體的構(gòu)建 首先，經(jīng)NCBI檢索，本課題組比對了Human、Rat及Mouse CD83細胞外結(jié)構(gòu)域氨基酸序列，其中相同序列占總比的58.04%，相似序列占總比的92.26%（見圖1）。由于鼠源CD83胞外結(jié)構(gòu)域與人源CD83相似度較高，且鼠源CD83重組蛋白相關(guān)研究較少，因此選擇鼠源CD83的NM_009856轉(zhuǎn)錄本，將該轉(zhuǎn)錄本編碼CD83胞外結(jié)構(gòu)域的399個堿基作為模板。其次，課題組設(shè)計了含有限制性內(nèi)切酶BamHⅠ/EcoRⅠ基因序列的引物，通過PCR、限制性內(nèi)切酶酶切、T4 DNA連接酶連接，將CD83胞外結(jié)構(gòu)域399個堿基裝載到pGEX-2T載體上。最后，通過BamHⅠ/EcoRⅠ酶切電泳得到了約400 bp的條帶，如圖2所示。此外，測序結(jié)果顯示，裝載在pGEX-2T載體上的399個堿基為編碼CD83胞外結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)堿基且無突變位點（圖2）。表明CD83原核表達系統(tǒng)載體pGEX-2T-CD83（Met1-Arg133）構(gòu)建成功。

圖1 Human、Rat、Mouse CD83細胞外結(jié)構(gòu)域氨基酸序列對比圖Fig.1 Comparison of amino acid sequences in extracellular domain of Human，Rat，and Mouse CD83

圖2 CD83重組質(zhì)粒模式圖及電泳鑒定圖Fig.2 Model diagram and electrophoresis identification diagram of CD83 recombinant plasmid

2.2CD83重組蛋白的表達 將構(gòu)建所得CD83質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至TOP10F'表達菌株中培養(yǎng)、IPTG誘導(dǎo)表達。使用裂解液裂解回收得到的菌體，通過SDSPAGE、考馬斯亮藍染色后分析發(fā)現(xiàn)，在上清液中并未檢測到GST-CD83蛋白或檢測到的表達量極少。調(diào)整IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時間（0.1 mmol/L、37℃、4 h，0.1 mmol/L、16℃、O/N，0.2 mmol/L、25℃、O/N）以及檢測裂解后回收的沉淀后發(fā)現(xiàn)，在沉淀中能檢測到大量GST-CD83蛋白（約39.5 kD）。表明在原核表達系統(tǒng)中GST-CD83蛋白大多以包涵體形式表達，而誘導(dǎo)表達的最佳條件為：0.2 mmol/L IPTG、25℃、O/N（12～16 h）（圖3）。

圖3 SDS-PAGE分析CD83表達情況Fig.3 Analysis expression of CD83 by SDS-PAGE

2.3CD83重組蛋白的包涵體復(fù)性及純化 首先，采用IPTG的最佳誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)得到菌體，經(jīng)PBS洗滌、裂解液裂解、超聲波超聲后回收得到菌體沉淀。其次，使用0.3%SKL將包涵體溶解變性，利用透析法進行包涵體復(fù)性。最后，使用GST親和層析純化獲得GST-CD83蛋白，通過SDS-PAGE、考馬斯亮藍染色及Western blot分析CD83蛋白的純化情況及特異性。使用BSA定量GST-CD83的蛋白濃度。如圖4A、圖5所示，GST-tag resin能夠結(jié)合絕大部分復(fù)性液中的GST-CD83蛋白，且通過洗脫液洗脫下的GST-CD83蛋白特異性較高。因此表明，使用SKL溶解、透析復(fù)性、GST親和層析純化以及BSA定量，能夠獲得高效、穩(wěn)定及高濃度的CD83重組蛋白。CD83是一種唾液酸糖蛋白，因此通過檢測其與唾液酸凝結(jié)素SNA的結(jié)合情況檢測蛋白活性。結(jié)果顯示，GST-CD83與SNA的結(jié)合效果與商品化CD83-Fc相近（圖4B）。

圖4 CD83重組蛋白的活性測定Fig.4 Activity determination of CD83 recombinant protein

圖5 Western blot分析CD83表達特異性Fig.5 Analysis specificity of CD83 by Western blot

2.4CD83多克隆抗體的制備及鑒定 以純化得到的GST-CD83蛋白作為抗原，使用QuickAntibody-2W免疫佐劑與既定劑量抗原進行混合后免疫SD大鼠。在第1次免疫7 d后使用相同劑量抗原進行加強免疫1次。在免疫開始后的第14天進行采血回收血清，使用ELISA法檢測血清中的抗體效價。如圖6A所示，以未免疫的大鼠血清為陰性對照做對比后觀察到，CD83多克隆抗體的效價約為1∶104～1∶105。此外，運用免疫熒光染色檢測CD83多克隆抗體的活性（圖6B）。結(jié)果顯示，該多克隆抗體免疫結(jié)合肺巨噬細胞Raw264.7細胞表面CD83，與已發(fā)表論文中商品化CD83抗體的免疫染色結(jié)果一致［4］。表明從該原核表達系統(tǒng)中獲得的GST-CD83蛋白能夠作為穩(wěn)定抗原免疫動物；而與傳統(tǒng)免疫佐劑相比，QuickAntibody-2W免疫佐劑的抗體產(chǎn)生快、抗體滴度高等優(yōu)點，縮短了抗體的制備周期，為免疫動物、抗體制備提供新的思路。

圖6 ELISA檢測CD83抗體的抗體效價及免疫活性Fig.6 Antibody titer and immunoactivity of CD83 antibody were detected by ELISA

3 討論

CD83是免疫球蛋白超家族成員之一。CD83有兩種蛋白質(zhì)類型，一種是膜結(jié)合形式（membrane CD83，mCD83），另 一 種 是 可 溶 性 形 式（soluble CD83，sCD83）［5］。膜結(jié)合蛋白mCD83由胞漿結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞外結(jié)構(gòu)域組成。在哺乳動物中，mCD83表達于多種免疫細胞表面，被認為是免疫細胞表面的激活標(biāo)志，包括T細胞、B細胞、DCs及巨噬細胞等。其中，mCD83在活化的DCs和其他抗原呈遞細胞表面的表達使其成為一個有吸引力的治療靶點，實現(xiàn)選擇性免疫抑制。有研究顯示，皰疹病毒能夠靶向mCD83形成獲得性免疫逃逸，建立潛伏期［1］。此外，水痘帶狀皰疹病毒感染時可選擇性抑制DCs上mCD83的表達［2-3］。相反，有研究發(fā)現(xiàn)EB病毒（epstein-barr virus，EBV）能夠促進B細胞上mCD83的表達［15］。同時，本課題組前期研究顯示，禽流感病毒H9N2突變體強毒株能夠上調(diào)DCs和巨噬細胞等免疫細胞表面mCD83的表達，進而促使小鼠產(chǎn)生急性肺部炎癥［4］。

關(guān)于sCD83，有研究發(fā)現(xiàn)在健康人血清中可檢測到低水平的sCD83，但在造血系統(tǒng)惡性腫瘤或自身免疫性疾病患者血清中可檢測到較高水平［16-18］。另外，在健康小鼠血清中檢測到的sCD83水平極低，但在孕期小鼠或誘導(dǎo)自身免疫小鼠血清中檢測到sCD83的水平將會升高［13，19］。細胞培養(yǎng)實驗則證實，大多數(shù)sCD83是由活化的B細胞和DC細胞，以及小鼠的Treg細胞分泌產(chǎn)生［19-21］。小鼠CD83與人類CD83的細胞外結(jié)構(gòu)部分均包含一個V型免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，且有63%的氨基酸同源性。雖然，這兩物種天然sCD83的序列仍未被證實，目前還不清楚該產(chǎn)物是否來源于mCD83或CD83剪接變異體細胞外部分的剪切［22］。但有研究顯示，重組可溶性CD83胞外結(jié)構(gòu)域（recombinant soluble extracellular CD83，rsCD83）能夠模仿天然sCD83變體，在自身免疫性疾病的動物模型和移植中顯示了強大的免疫抑制特性［23-25］。

由于mCD83在多種免疫細胞表面表達且sCD83在惡性腫瘤及自身免疫性疾病中高分泌、高表達等特性，CD83將成為一個有效的治療靶點，特異性靶向CD83將能為多種疾病的治療提供手段。研究顯示，在移植物抗宿主病（graft-vs-host disease，GVHD）的臨床前模型中CD83特異性抗體具有清除CD83+細胞的能力［26］。另有研究表明，特異性抑制CD83可減輕單純皰疹病毒感染引起的小鼠全身炎癥反應(yīng)［14］。此外，抗CD83抗體在其他炎癥環(huán)境中也能夠呈現(xiàn)免疫抑制效果，如在巨細胞動脈炎（giant cell arteritis，GCA）的異種小鼠模型中得到了證明［27］。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)抗CD83多克隆抗體能夠降低禽流感病毒H9N2突變株引起的細胞因子風(fēng)暴，進而降低小鼠肺部急性炎癥反應(yīng)［4］。

本研究通過將鼠源CD83胞外結(jié)構(gòu)域399個堿基裝載到含有GST融合蛋白的pGEX-2T載體上，成功構(gòu)建了CD83的原核表達質(zhì)粒。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至TOP10F'原核表達菌株并優(yōu)化IPTG的誘導(dǎo)條件，明確了GST-CD83的包涵體表達形式及最佳誘導(dǎo)條件。將誘導(dǎo)表達得到的菌體沉淀，利用包涵體變性、復(fù)性及GST親和層析獲得了CD83重組蛋白。最后，將獲得的重組CD83蛋白與QuickAntibody快速免疫佐劑免疫SD大鼠，快速、高效地獲得了CD83的多克隆抗體。因此，本研究獲得CD83重組蛋白及CD83多克隆抗體的方法，不僅能夠為sCD83和CD83抗體的制備提供新思路，還能夠為后續(xù)sCD83和CD83抗體在抗炎、抗病毒過程中免疫抑制機制的相關(guān)研究提供支持。