雪貂食管黏膜下腺體在胃食管生理穩(wěn)態(tài)下清酸的作用機制

李 博，黃 河，王 磊，周海寧

根據(jù)癌癥統(tǒng)計報表顯示，胃食管連接部癌及食管癌發(fā)病率排惡性腫瘤第6位[1]。胃食管連接部(esophagogastric junction, EGJ)腫瘤是位于食管胃中間特殊部位的腫瘤，以腺癌為主，鱗癌發(fā)生率較低[2]。目前EGJ腫瘤發(fā)病機制尚不明確，可能與胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease，GERD)相關(guān)，而GERD是抗反流防御機制減弱和反流物對食管黏膜攻擊作用的結(jié)果[3]。食管的抗反流防御機制包括抗反流屏障、食管清酸作用、食管黏膜屏障，其中食管的清酸作用極其重要[4,5]，關(guān)于食管黏膜下腺體(esophageal submucosal glands, SMG)在清酸機制中的意義研究甚少。雪貂是一類哺乳動物，屬于鼬科[6,7]，其解剖學(xué)和生理學(xué)特性與人類相似，故用于各種人類疾病發(fā)病機制的研究[7]。本課題組前期實驗已證實雪貂食管中存在與人類食管類似的SMG結(jié)構(gòu)，所以本文基于雪貂SMG在胃食管生理穩(wěn)態(tài)下，通過檢測胃食管黏膜分泌含有黏蛋白的黏液及分泌囊性纖維化跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)器(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)對碳酸氫鈉調(diào)控，對胃食管清酸作用及對胃食管黏膜的保護進行了研究。同時探討發(fā)育情況下SMG中WNT信號LEF1的變化，為進一步研究胃食管反流模型下?lián)p傷修復(fù)機制干細(xì)胞的作用及與腫瘤的發(fā)生提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集 選取無錫珊瑚礁公司提供的6～8個月成年雪貂食管制成冷凍和石蠟組織。通過采集出生1 d、3 d、5 d、7 d和14 d的雪貂食管制作冷凍蠟塊組織進行形態(tài)學(xué)及分子標(biāo)記物觀察，實驗動物的飼養(yǎng)條件均保持一致。本研究通過寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會審批(2020-584)。

1.2 試劑 抗體生產(chǎn)廠家及濃度：抗小鼠MUC5A抗體(1∶150；Cat#MS-145-PO, thermofisher)和抗兔MUC5B抗體(1∶200；Cat#2223, Santa Cruz Biotechnology, INC)、抗兔LEF1(1∶500；AF647)。

1.3 制作石蠟切片 將石蠟切片組織送至寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院病理科進行包埋，橫斷面切成5 μm進行蘇木精-伊紅染色法(HE染色)、過碘酸雪夫染色(PAS)、免疫組化染色。

1.4 HE染色 二甲苯浸泡10 min，入濃度由高到低梯度乙醇浸泡各5 min，入水洗滌10 s，染色液浸泡8 min,流動水洗滌10 s，分化液分化2 s，流動水洗滌10 min，入伊紅染液浸泡1 min，依次入濃度由低到高梯度乙醇脫水各5 min，二甲苯透明10 min，封片劑封片。通風(fēng)，顯微鏡采圖。

1.5 PAS染色 脫蠟，流動水洗1次，超純水洗2次，氧化劑內(nèi)靜置4～9 min，流動水洗滌1次，超純水洗滌2次，將其放入Schiff染色液中，避光靜置，充分反應(yīng)20 min，流動水洗滌10 min，入蘇木精染色液充分浸泡2 min，分化液分化2～5 s，流動水洗滌10～15 min，使其返藍(lán)，依次入濃度由低到高梯度乙醇脫水各5 min，接著入二甲苯溶液進行透明，封片劑封片。通風(fēng)，顯微鏡采圖。

1.6 免疫組化染色 65 ℃溫箱烤片2 h，梯度二甲苯乙醇脫蠟，蒸餾水沖洗，EDTA 9.0高壓修復(fù)，噴氣后計時3 min，自然冷卻，3%過氧化氫水溶液10 min，PBS溶液浸泡10 min，PBS洗滌3次，加入一抗試劑,移至37 ℃恒溫箱反應(yīng)90 min，PBS洗滌3次，加入一抗相對應(yīng)的二抗，移至37 ℃恒溫箱反應(yīng)30 min，PBS洗滌3次，加入適量DAB顯色10 min，流動水沖洗結(jié)束顯色，入蘇木精染液浸泡1 min，流動水沖洗，分化液分化2 s，流動水洗滌，放入氨水中返藍(lán)，流動水洗滌，依次入濃度由低到高梯度乙醇進行脫水，入二甲苯透明，封片劑進行封片通風(fēng)。

1.7 免疫熒光染色 冷凍切片用10%、15%、20%的糖梯度處理過夜。將OCT(最佳切割溫度)與20%葡萄糖溶液依次混合入食管腔，OCT包埋，-80 ℃保存，進行免疫熒光和原位雜交。染色前將OCT組織切片放置室溫30 min充分干燥，放入4% PFA再次固定5 min，后于DBB封閉1 h，加一抗過48 h，再次取出后放置室溫加入二抗1 h，后封片固定，每步操作之間使用PBS 處理5 min。LEF1染色需要抗原修復(fù)，將枸櫞酸鹽(pH6)放入水浴鍋預(yù)熱至95 ℃以上，放入切片開始計時20 min取出，放置至室溫，加一抗過夜，復(fù)溫后加Biotin將其信號再次擴大放置1 h，最后加Avidin放置1 h，封片。

1.8 LECTIN染色 染色前將OCT組織切片放置室溫30 min充分干燥，用3%BSA封片通透，加BIOTIN，主要包括雙花扁豆凝集素(dolichos biflorus, DBA)、雞冠珊瑚樹凝集素(erythrina cristagalli lectin，ECL)、非偶聯(lián)西非單葉豆凝集素Ⅰ(unconjugated griffonia simplicifolia lectin Ⅰ, GSLⅠ)、非偶聯(lián)西非單葉豆凝集素Ⅱ(GSL Ⅱ)、大豆凝集素(soybean agglutinin，SBA)、他卡林生物化合物凝集素(tacalin biotylated)、荊豆凝集素(ulex)、麥胚凝集素(wheat germ agglutinin, WGA)、花生凝集素(peanut agglutinin，PNA)、凝集素伴刀豆凝集素(concanavalin A, ConA)、紅腰果E型凝集素(phytohaemagglutinin E, PHA-E)和紅腰果L型凝集素(PHA-L)，陰性對照室溫放置1 h，AVIDIN室溫放置40 min，封片。

1.9 原位雜交

1.9.1 探針變性 將探針在75 ℃恒溫水浴中溫育 5 min，立即置 0 ℃，5～10 min，使探針變性。

1.9.2 標(biāo)本變性 (1)烤片2～3 h；(2)標(biāo)本浸在 70～75 ℃的體積分?jǐn)?shù)70%甲酰胺/2×SSC的變性液中變性2～3 min；(3)立即按順序?qū)?biāo)本經(jīng)體積分?jǐn)?shù) 70%、體積分?jǐn)?shù) 90%和體積分?jǐn)?shù) 100%冰乙醇系列脫水，干燥。

1.9.3 雜交 將已變性或預(yù)退火的 DNA 探針 10 μl 滴于已變性并脫水的玻片標(biāo)本上，蓋上玻片，封片，置于潮濕暗盒中 37 ℃雜交過夜(約 16 h)。

1.9.4 洗脫 (1)用刀片輕輕將蓋玻片揭掉；(2)將已雜交的玻片標(biāo)本放置于已預(yù)熱 42～50 ℃的體積分?jǐn)?shù) 50%甲酰胺/2×SSC中洗滌3 次；(3)在已預(yù)熱42～50 ℃的 1×SSC中洗滌3次；(4)在室溫下，將玻片標(biāo)本于2×SSC中輕洗一下；(5)自然干燥；(6)取200 μl 復(fù)染溶液(DAPI 染液)滴加在玻片標(biāo)本上，蓋上蓋玻片。

1.9.5 雜交信號的放大(適用于使用生物素標(biāo)記的探針) (1)在玻片的雜交部位加 150 μl 封閉液Ⅰ，用保鮮膜覆蓋，37 ℃溫育20 min；(2)去掉保鮮膜，再加 150 μl avidin-FITC 于標(biāo)本上，用保鮮膜覆蓋，37 ℃繼續(xù)溫育 40 min；(3)取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱 42～50 ℃的洗脫液中洗滌3次；(4)在玻片標(biāo)本的雜交部位加 150 μl 封閉液 II，覆蓋保鮮膜，37 ℃溫育 20 min；(5)去掉保鮮膜，加 150 μl antiavidin 于標(biāo)本上，覆蓋新的保鮮膜，37 ℃溫育40 min；(6)取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱 42～50 ℃的新洗脫液中，洗滌3次；(7)重復(fù)步驟(1)、(2)、(3)，再于2×SSC中室溫清洗一下；(8)取出玻片，自然干燥；(9)取 200 μl PI/antifade 染液滴加在玻片標(biāo)本上，蓋上蓋玻片，封片。

1.9.6 熒光顯微鏡觀察 FISH 結(jié)果：探針?biāo)诘奈恢冒l(fā)出紅色熒光。

2 結(jié) 果

2.1 采用HE、PAS染色對成年雪貂食管SMG形態(tài)學(xué)進行分析 HE染色結(jié)果顯示，成年雪貂食管SMG為食管黏膜肌層下方結(jié)締組織，其在食管中分布存在差異，食管近端和遠(yuǎn)端分布較中間多，SMG由單層柱狀細(xì)胞組成，細(xì)胞核位于基底部；PAS染色結(jié)果提示SMG中優(yōu)勢腺體細(xì)胞呈陽性表達(dá)并分泌中性黏多糖(圖1)。

圖1 采用HE、PAS染色對成年雪貂食管黏膜下腺體進行形態(tài)學(xué)分析

2.2 不同凝集素在成年雪貂食管SMG中與不同細(xì)胞結(jié)合特點 凝集素染色結(jié)果顯示，在成年雪貂食管SMG中不同類型細(xì)胞膜可特異性結(jié)合不同凝集素，黏液細(xì)胞結(jié)合DBA、ECL、GSL Ⅰ、GSL Ⅱ、SOYBEAN、tacalin biotylated、ules、Triticum vulgare Wheat germ agglutinin(WGA)，導(dǎo)管細(xì)胞結(jié)合GSL Ⅰ、GSL Ⅱ，上皮細(xì)胞結(jié)合ECL、PNA和WGA，漿液細(xì)胞結(jié)合ConA、PHA-E和PHA-L(圖2)。

圖2 免疫熒光檢測不同凝集素與成年雪貂食管黏膜下腺體中不同細(xì)胞的結(jié)合情況(×200)

2.3 分別使用免疫組化及免疫熒光染色分析MUC5B和MU5AC在成年雪貂食管SMG中表達(dá)情況 免疫組化Mucin染色結(jié)果顯示，雪貂食管SMG黏液細(xì)胞胞質(zhì)及腺體管腔內(nèi)呈棕黃色著色(陽性表達(dá))。MU5AC使用647 nm波長白光激發(fā)，可見腺體黏液細(xì)胞胞質(zhì)及腺體管腔內(nèi)呈白色(陽性表達(dá))。MUC5B使用555 nm波長紅光激發(fā)，可見腺體黏液細(xì)胞胞質(zhì)及腺體管腔內(nèi)呈紅色(陽性表達(dá)，圖3)。

圖3 MUC5B和MU5AC在成年雪貂食管黏膜下腺體中表達(dá)情況

2.4 免疫原位雜交檢測CFTR在成年雪貂食管SMG中表達(dá)情況 免疫原位雜交結(jié)果提示，在成年雪貂食管SMG中可見腺體中有紅色特異性染色，呈陽性表達(dá)(圖4)。

圖4 原位雜交檢測CFTR在成年雪貂食管黏膜下腺體中的表達(dá)(CFTR染色)

2.5 免疫熒光檢測新生雪貂食管中LEF1的表達(dá) 免疫熒光結(jié)果顯示，LEF1的表達(dá)在不同出生時間段的雪貂食管中存在差異。使用波長為555 nm紅光激發(fā)，雪貂出生1 d食管上皮細(xì)胞中有紅色(陽性表達(dá))，出現(xiàn)在一個或多個散在細(xì)胞，未見明確發(fā)育的腺體，在雪貂出生3～7 d可見發(fā)育腺體中有紅色，14 d時腺體中未見紅色(圖5)。

圖5 免疫熒光檢測新生雪貂食管中LEF-1的表達(dá)(10×)

3 討 論

人食管腺體是一種位于黏膜下層的外分泌腺[8]，SMG腺泡是由單層柱狀上皮細(xì)胞組成。本課題組前期研究顯示，在雪貂食管近端和遠(yuǎn)端存在SMG集中[9]。從HE染色看，SMG中有腺體細(xì)胞呈紅色，因為細(xì)胞質(zhì)中充滿黏原顆粒，是分泌物的前身。在固定染色的切片上，黏原顆粒被溶解，常呈現(xiàn)空泡狀，故細(xì)胞質(zhì)著色很淺。當(dāng)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)充滿黏原顆粒時，細(xì)胞核被擠到細(xì)胞基部的一側(cè)，被擠壓成半月狀或扁平形，著色較深。有些腺體細(xì)胞向深層凹陷形成管狀，這些腺細(xì)胞的分泌物是黏稠的液體，其化學(xué)成分主要是蛋白多糖，當(dāng)分泌物排出后，細(xì)胞核又變成圓形或橢圓形。PAS結(jié)果顯示雪貂SMG中有腺體細(xì)胞呈紅色，并且分泌蛋白多糖，說明了其對食管有清酸作用。

淋巴細(xì)胞結(jié)合增強因子(LEF1)是 Wnt 通路關(guān)鍵基因之一，在多種腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，可促進癌細(xì)胞的增殖、侵襲[14-17]。本研究通過對LEF1的追蹤發(fā)現(xiàn)，隨著雪貂食管發(fā)育成熟，LEF1的表達(dá)顯著降低。在胃食管結(jié)合部中多潛能干細(xì)胞，可能位于黏膜下腺，在沒有損傷情況的穩(wěn)態(tài)下，SMG參與到上皮細(xì)胞的維持。Wnt 信號在發(fā)育過程中必不可少，但受到嚴(yán)格調(diào)控，在健康成人組織該通路基本被封閉。LEF1參與到Wnt信號通路的細(xì)胞增殖，所以，通過觀察雪貂食管早期發(fā)育過程中LEF1的表達(dá)追蹤其發(fā)展。在雪貂出生1 d可以看到上皮中1個或更多細(xì)胞LEF1表達(dá)陽性，出生3～7 d可以看到LEF1在腺體發(fā)育中的表達(dá)，當(dāng)腺體的分化成熟LEF1的表達(dá)消失。所以其可能在上皮更新時可再次被激活，調(diào)控形成新的上皮細(xì)胞。顯然我們對于其機制了解有限，其轉(zhuǎn)化的過程需要進一步譜系追蹤。LEF1隨著出生發(fā)育表達(dá)明顯下降，但大量研究表明，在很多腫瘤或腫瘤細(xì)胞株中檢測到了 LEF-1 的表達(dá)，甚至高表達(dá)。LEF1 參與的 Wnt 信號通路不僅與細(xì)胞增殖和癌變的調(diào)控有關(guān)，而且也與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。這將會成為本課題組后續(xù)研究的重點，SMG對穩(wěn)態(tài)的維持及損傷有應(yīng)答，存在一種假說，其可能機制是在修復(fù)過程中通過WNT信號LEF1調(diào)控的異常最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。