薛亞琪，沙寧，武怡

1 徐州醫(yī)科大學(xué)附屬淮安醫(yī)院 淮安市第二人民醫(yī)院兒科，江蘇淮安 223002；2 徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒科

呼吸道合胞病毒（RSV）是全球范圍內(nèi)引起5 歲以下兒童急性下呼吸道感染的主要病原體［1］。RSV感染后可引起患兒反復(fù)喘息發(fā)作，如不及時(shí)治療可導(dǎo)致感染性肺炎或細(xì)支氣管炎，嚴(yán)重者甚至死亡［2］。目前，臨床尚無疫苗或有效的抗病毒藥物治療RSV感染。因此，尋找能夠早期診斷RSV 感染的血清生物標(biāo)志物具有重要意義。干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白3（IFITM3）是一種干擾素刺激因子，能夠阻止甲型流感病毒、埃博拉病毒等通過磷脂雙分子層進(jìn)入細(xì)胞，具有高效、廣譜抗病毒能力［3-4］。干擾素誘導(dǎo)蛋白27（IFI27）也是一種干擾素刺激因子，能夠激活RNA聚合酶Ⅱ的DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄活性，從而參與細(xì)胞蛋白質(zhì)代謝、病毒感染防御反應(yīng)及凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)等病理生理過程［5］。近年研究發(fā)現(xiàn)，RSV 肺炎患兒血清IFITM3、IFI27等基因表達(dá)差異顯著，這些差異表達(dá)基因有可能成為預(yù)測RSV 感染的血清生物標(biāo)志物［6-7］。本研究探討了RSV 肺炎患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞IFITM3、IFI27表達(dá)變化及其臨床意義?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2020年1月—2021年12月淮安市第二人民醫(yī)院收治的RSV 肺炎患兒90例（觀察組）。病毒性肺炎診斷依據(jù)《兒童病毒性肺炎中西醫(yī)結(jié)合診治專家共識(shí)（2019年制定）》［8］，具有咳嗽、氣喘、呼吸困難等臨床表現(xiàn)，肺部有中細(xì)濕啰音和呼氣相哮鳴音，胸片肺間質(zhì)浸潤影或斑片影，外周血白細(xì)胞總數(shù)多正常、中性粒細(xì)胞比例不高，經(jīng)鼻咽部或咽拭子等病原學(xué)檢查明確RSV 感染。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合RSV 肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡3～10歲；③臨床病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴自身免疫性疾病者；②合并哮喘、先天性氣道或肺結(jié)構(gòu)發(fā)育異常者；③合并肺結(jié)核或其他病原體導(dǎo)致的肺部感染者；④近3個(gè)月內(nèi)存在肺部急慢性感染性疾病者；⑤近2周內(nèi)使用類固醇激素者。其中，男50 例、女40 例，年齡（5.35 ±0.87）歲，BMI（17.47 ± 2.58）kg/m2，病程2～21（7.42 ±1.2）d，病情程度：低危［肺炎嚴(yán)重程度指數(shù)（PSI）評(píng)分［9］＜90分］28例、中危（RSI評(píng)分90～＜130分）30例、高危（RSI評(píng)分≥130分）32例。選擇同期淮安市第二人民醫(yī)院收治的腹股溝斜疝患兒40例（對(duì)照組），既往無免疫缺陷性疾病，近3個(gè)月內(nèi)無急慢性感染性疾病。其中，男24 例、女16 例，年齡（5.31 ± 0.89）歲，BMI（17.54 ± 2.64）kg/m2。兩組性別、年齡、BMI 具有可比性。本研究經(jīng)淮安市第二人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批文號(hào)：HEYLL202216），所有患兒監(jiān)護(hù)人知情同意并簽署書面知情同意書。

1.2 外周血單個(gè)核細(xì)胞IFITM3、IFI27表達(dá)檢測 觀察組入院當(dāng)日，對(duì)照組入院次日，采集肘靜脈血3 mL，置于肝素抗凝的采血管中，按體積比1∶1加入生理鹽水，充分振蕩混勻。取Ficoll 淋巴細(xì)胞分離液3 mL，置于15 mL滅菌離心管中，然后將離心管傾斜45°，將稀釋的血液緩慢疊加于淋巴細(xì)胞分離液上，室溫下3 000 r/min離心30 min、離心半徑10 cm，離心管由上至下分為四層。用吸管將單個(gè)核細(xì)胞層吸出，轉(zhuǎn)移至另一15 mL滅菌離心管中。然后向該離心管中加入清洗液10 mL，室溫下3 000 r/min 離心10 min、離心半徑10 cm。吸棄上清液，加入清洗液0.5 mL 重懸，-80 ℃冰箱保存。取單個(gè)核細(xì)胞懸液0.5 mL，采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)鑒定，提取的總RNA 濃度和純度合格。按逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說明，將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：25 ℃ 5 min，50 ℃ 45 min。以cDNA 為模板，按2×SYBR Green qPCR Master Mix熒光定量PCR試劑盒說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：IFITM3 上游引物5′-CCACATCATCCAACATCCTCC-3′、下游引物5′-TCATCTTCTTTAGCCTCGGGTT-3′，IFI27上游引物5′-CTGTGGTCGGAGGAGTTGTG-3′、下游引物5′-GGCGATTCCTACTGAGGTGAA-3′，β-actin 上游引物5′-TGCTCTCACCTCATCAGCAGT-3′、下游引物5′-CACAACTCCTCCAATCACAACT-3′。PCR 反應(yīng)體系共20 μL：cDNA 模板2 μL，上下游引物各1 μL，SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，雙蒸水4 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s、62 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min 共40 個(gè)循環(huán)。PCR 反應(yīng)結(jié)束，繪制熔解曲線，收集循環(huán)閾值（CT）數(shù)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算IFITM3、IFI27 相對(duì)表達(dá)量。

1.3 血清炎癥因子檢測 觀察組入院當(dāng)日，對(duì)照組入院次日，采集肘靜脈血3 mL，靜置30 min 后，3 000 r/min離心10 min、離心半徑10 cm，分離血清。采用ELISA 法檢測血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ。檢測儀器為ReadMax 1200 型光吸收全波長酶標(biāo)儀。ELISA 試劑盒購自上?？瓢┥锛夹g(shù)有限公司。所有操作嚴(yán)格按照儀器操作規(guī)程和試劑盒說明進(jìn)行。

1.4 肺功能檢查 所有研究對(duì)象入院次日，取端坐位，平靜狀態(tài)下5 min 后，采用AS-507 型肺功能檢測儀檢測肺功能，包括第1 秒用力呼氣容積占預(yù)計(jì)值的百分比（FEV1%pred）、FEV1/用力肺活量（FVC）。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析法。預(yù)測效能分析采用受試者工作特征（ROC）曲線。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血單個(gè)核細(xì)胞IFITM3、IFI27 表達(dá)比較 觀察組外周血單個(gè)核細(xì)胞IFITM3、IFI27 相對(duì)表達(dá)量分別為2.46 ± 0.38、2.29 ± 0.23，對(duì)照組分別為1.21 ± 0.30、0.91 ± 0.13。觀察組外周血單個(gè)核細(xì)胞IFITM3、IFI27 相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組（t分別為18.398、35.464，P均＜0.01）。不同病情程度RSV肺炎患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞IFITM3、IFI27表達(dá)比較見表1。

表1 不同病情程度RSV肺炎患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞IFITM3、IFI27相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表1 不同病情程度RSV肺炎患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞IFITM3、IFI27相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與低危比較，*P＜0.05；與中危比較，＃P＜0.05。

RSV肺炎病情程度高危中危低危n IFI27 2.46 ± 0.24*＃2.28 ± 0.23*2.15 ± 0.21 14.081＜0.01 32 30 28 F P IFITM3 2.83 ± 0.40*＃2.45 ± 0.36*2.14 ± 0.39 24.434＜0.01

2.2 兩組血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ 水平及FEV1%pred、FEV1/FVC 比較 觀察組血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ 水平均顯著高于對(duì)照組，F(xiàn)EV1%pred、FEV1/FVC 均顯著低于對(duì)照組（P均＜0.01），見表2。不同病情程度RSV 肺炎患兒血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平及FEV1%pred、FEV1/FVC比較見表3。

表2 兩組血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平及FEV1%pred、FEV1/FVC比較（±s）

表2 兩組血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平及FEV1%pred、FEV1/FVC比較（±s）

組別對(duì)照組觀察組n 40 90 t P IL-1β（pg/mL）11.02 ± 3.93 34.39 ± 5.44 24.458＜0.01 IL-6（pg/mL）21.32 ± 4.47 65.58 ± 7.98 32.819＜0.01 TNF-α（pg/mL）7.42 ± 1.61 18.61 ± 3.91 17.425＜0.01 IFN-γ（pg/mL）230.41 ± 22.81 280.14 ± 21.18 12.066＜0.01 FEV1%pred（%）96.81 ± 17.30 81.46 ± 15.32 5.065＜0.01 FEV1/FVC（%）93.51 ± 26.60 72.21 ± 23.29 4.604＜0.01

表3 不同病情程度RSV肺炎患兒血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平及FEV1%pred、FEV1/FVC比較（±s）

表3 不同病情程度RSV肺炎患兒血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平及FEV1%pred、FEV1/FVC比較（±s）

注：與低危比較，*P＜0.05；與中危比較，＃P＜0.05。

RSV肺炎病情程度高危中危低危n 32 30 28 F P FEV1/FVC（%）60.87 ± 23.29*＃71.55 ± 23.40*85.87 ± 24.20 8.394＜0.01 IL-1β（pg/mL）52.22 ± 5.14*＃33.27 ± 5.30*24.18 ± 5.96 208.531＜0.01 IL-6（pg/mL）71.00 ± 7.60*＃66.56 ± 7.84*58.33 ± 8.12 19.834＜0.01 TNF-α（pg/mL）21.94 ± 3.71*＃19.06 ± 3.86*14.32 ± 4.25 28.313＜0.01 IFN-γ（pg/mL）295.75 ± 23.15*＃279.06 ± 20.25*267.49 ± 21.20 130.028＜0.01 FEV1%pred（%）72.83 ± 14.85*＃82.17 ± 15.21*90.56 ± 16.24 9.931＜0.01

2.3 RSV 肺炎患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞IFITM3、IFI27 表達(dá)與血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ 水平及FEV1%pred、FEV1/FVC 的關(guān)系 Pearson 相關(guān)分析顯示，RSV 肺炎患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞IFITM3 表達(dá)與血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平均呈正相關(guān)關(guān)系（r分別為0.472、0.503、0.401、0.662，P均＜0.01），與FEV1%pred、FEV1/FVC 均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r分別為-0.536、-0.479，P均＜0.05）；外周血單個(gè)核細(xì)胞IFI27 表達(dá)與血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平均呈正相關(guān)關(guān)系（r分別為0.428、0.397、0.458、0.634，P均＜0.01），與FEV1%pred、FEV1/FVC 均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r分別為-0.527、-0.603，P均＜0.05）。

2.4 外周血單個(gè)核細(xì)胞IFITM3、IFI27 表達(dá)對(duì)RSV肺炎的預(yù)測價(jià)值 ROC 曲線分析顯示，外周血單個(gè)核細(xì)胞IFITM3 表達(dá)預(yù)測RSV 肺炎的曲線下面積（AUC）為0.756（95%CI：0.658～0.853），其最佳截?cái)嘀禐?.30，此時(shí)其預(yù)測RSV 肺炎的靈敏度為64.2%、特異度為78.2%、約登指數(shù)為0.424；外周血單個(gè)核細(xì)胞IFI27 表達(dá)預(yù)測RSV 肺炎的AUC為0.763（95%CI：0.710～0.925），其最佳截?cái)嘀禐?.15，此時(shí)其預(yù)測RSV 肺炎的靈敏度為55.9%、特異度為82.3%、約登指數(shù)為0.382；外周血單個(gè)核細(xì)胞IFITM3、IFI27 表達(dá)聯(lián)合預(yù)測RSV 肺炎的AUC為0.837（95%CI：0.750～0.927），其預(yù)測RSV 肺炎的靈敏度為85.5%、特異度為78.0%、約登指數(shù)為0.635。外周血單個(gè)核細(xì)胞IFITM3、IFI27 表達(dá)聯(lián)合預(yù)測RSV 肺炎的AUC高于外周血單個(gè)核細(xì)胞IFITM3、IFI27 表達(dá)單獨(dú)（Z分別為2.096、2.115，P均＜0.05）。

3 討論

臨床上，大多數(shù)RSV 感染具有自限性，但仍有部分RSV 感染可引起肺炎或細(xì)支氣管炎，需住院治療。目前，RSV肺炎的發(fā)生機(jī)制尚不完全清楚，臨床亦無疫苗或有效的抗病毒藥物治療RSV 感染。因此，尋找能夠早期診斷RSV 感染的血清生物標(biāo)志物具有重要意義。

干擾素刺激基因是由干擾素誘導(dǎo)表達(dá)的基因，在宿主抵抗病毒感染過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［10］。既往有研究篩選了RSV 肺炎患兒外周血差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)IFITM3、IFI27 基因表達(dá)顯著上調(diào)，二者均能參與抗病毒感染免疫反應(yīng)，有可能成為RSV感染新的生物標(biāo)志物［7］。IFITM3基因定位于人11 號(hào)染色體，其編碼蛋白可參與干擾素調(diào)節(jié)以及免疫反應(yīng)、細(xì)胞周期等過程調(diào)控。近年研究發(fā)現(xiàn)，IFITM3 還具有廣譜抗病毒作用，如人類免疫缺陷病毒、埃博拉病毒等［3］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組外周血單個(gè)核細(xì)胞IFITM3相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，并且隨著病情程度加重，RSV 肺炎患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞IFITM3 相對(duì)表達(dá)量逐漸升高。結(jié)果提示IFITM3 可能參與RSV 肺炎的發(fā)生、發(fā)展。究其原因，RSV 感染后，病毒侵入氣道上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等，刺激其分泌IFN-γ，直接誘導(dǎo)干擾素刺激基因IFITM3表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)機(jī)體適應(yīng)性免疫反應(yīng)。此外，RSV 感染后可刺激機(jī)體免疫細(xì)胞產(chǎn)生大量趨化因子、細(xì)胞因子等，誘導(dǎo)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，加重肺組織炎癥損傷。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RSV肺炎患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞IFITM3 表達(dá)與血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平均呈正相關(guān)關(guān)系。有研究表明，IFITM3 能夠與囊泡膜相關(guān)蛋白A 相互作用，干擾囊泡膜相關(guān)蛋白A與膽固醇結(jié)合蛋白結(jié)合，將大量膽固醇遷移并聚集至晚期內(nèi)涵體和含病毒粒子的囊泡，阻止病毒包膜和內(nèi)涵體膜融合，抑制病毒入侵；IFITM3 過表達(dá)則可導(dǎo)致膜膽固醇含量增加，降低膜流動(dòng)性，從而影響病毒融合，抑制病毒通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞［11］。有研究還發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型干擾素能夠促進(jìn)IFITM3 表達(dá)，抑制吞噬體成熟和蛋白水解過程，促進(jìn)病原體的吞噬體逃逸和細(xì)胞間擴(kuò)散，抑制免疫細(xì)胞募集并誘導(dǎo)促炎癥細(xì)胞因子釋放，從而加重病情［12］。因此，隨著RSV 肺炎患兒病情加重，外周血單個(gè)核細(xì)胞IFITM3 表達(dá)逐漸升高。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，RSV 肺炎患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞IFITM3 表達(dá)與FEV1%pred、FEV1/FVC 均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示RSV 肺炎患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞IFITM3 表達(dá)與肺功能密切相關(guān)。其原因可能是外周血單個(gè)核細(xì)胞IFITM3 表達(dá)升高能夠通過促進(jìn)肺組織炎癥細(xì)胞因子分泌，引起肺部炎癥反應(yīng)和肺組織損傷，導(dǎo)致RSV肺炎患兒肺功能損傷［12］。

IFI27 又稱干擾素刺激基因12，可參與調(diào)節(jié)免疫、IFN-γ 信號(hào)傳導(dǎo)及脂質(zhì)代謝等生物學(xué)過程，具有抗病毒或細(xì)菌感染作用［13-14］。近年研究發(fā)現(xiàn)，IFI27能夠抑制人類自身免疫缺陷病毒、腸道病毒71等復(fù)制［6，15］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組外周血單個(gè)核細(xì)胞IFI27相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，并且隨著病情程度加重，RSV 肺炎患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞IFITM3 相對(duì)表達(dá)量逐漸升高。結(jié)果提示IFI27 亦能參與RSV肺炎的發(fā)生、發(fā)展。RSV感染可激活氣道上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞分泌IFN-γ，而IFN-γ 能夠直接促進(jìn)IFI27 表達(dá)［6］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RSV 肺炎患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞IFI27表達(dá)與血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ 水平均呈正相關(guān)關(guān)系。有研究表明，IFI27 能夠與多聚腺苷酸胞質(zhì)結(jié)合蛋白1 相互作用，通過抑制其細(xì)胞核定位進(jìn)而抑制其轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)CXC 趨化因子配體10表達(dá)，招募大量巨噬細(xì)胞分泌促炎癥細(xì)胞因子，如IL-1β、IL-6、TNF-α 等，加重肺組織損傷［16-17］。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，RSV 肺炎患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞IFI27 表達(dá)與FEV1%pred、FEV1/FVC 均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示RSV 肺炎患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞IFI27 表達(dá)與肺功能密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，IFI27 可通過誘導(dǎo)孤兒核受體亞家族4A1 由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核移位，促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞中Th1 型細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α 分泌，進(jìn)而加重肺組織損傷［6，18］。

本研究ROC 曲線分析發(fā)現(xiàn)，外周血單個(gè)核細(xì)胞IFITM3、IFI27表達(dá)單獨(dú)和聯(lián)合預(yù)測RSV肺炎的AUC分別為0.756、0.763、0.837，外周血單個(gè)核細(xì)胞IFITM3、IFI27 表達(dá)聯(lián)合預(yù)測RSV 肺炎的AUC高于外周血單個(gè)核細(xì)胞IFITM3、IFI27 表達(dá)單獨(dú)。結(jié)果提示外周血單個(gè)核細(xì)胞IFITM3、IFI27 表達(dá)對(duì)RSV肺炎均有一定預(yù)測價(jià)值，二者聯(lián)合預(yù)測價(jià)值更高。

綜上所述，RSV 肺炎患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞IFITM3、IFI27表達(dá)顯著升高，二者表達(dá)與血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ 水平均呈正相關(guān)關(guān)系，與FEV1%pred、FEV1/FVC 均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；外周血單個(gè)核細(xì)胞IFITM3、IFI27 表達(dá)對(duì)RSV 肺炎均有一定預(yù)測價(jià)值，二者聯(lián)合預(yù)測價(jià)值更高。