張迪，王應(yīng)輝，薛瑾，陳應(yīng)強(qiáng)

1 貴州醫(yī)科大學(xué)感染科教研室，貴陽(yáng) 550004；2 黔南州人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科；3 貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院感染科

肝纖維化是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)，其主要病理改變是細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）大量形成并在肝臟內(nèi)沉積［1-2］。肝星狀細(xì)胞是ECM的主要來(lái)源。正常情況下，肝星狀細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，不合成或合成少量ECM。當(dāng)肝星狀細(xì)胞被激活后可轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，從而大量合成ECM［3］。目前，肝纖維化的具體發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。NF-κB信號(hào)通路是一條至關(guān)重要的炎癥信號(hào)通路。有研究表明，阻斷NF-κB 信號(hào)通路可減少下游炎癥因子釋放，抑制肝星狀細(xì)胞激活，減少ECM合成和沉積，從而抑制肝纖維化［4］。都勻毛尖茶是我國(guó)的十大名茶之一，含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、生物堿、茶多酚等物質(zhì)。其中，茶多酚的含量約占17%［5］。有研究報(bào)道，茶多酚可降低血漿和肝臟組織炎癥因子水平，提高肝臟的抗炎能力［6］。2021年1月—2022年1月，本研究探討了都勻毛尖茶浸提液對(duì)人肝星狀細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝星狀細(xì)胞株LX-2，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。特級(jí)都勻毛尖茶，購(gòu)自貴州省黔南州梅淵商貿(mào)有限公司。水飛薊賓，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。所有引物序列購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。iMARKTM酶標(biāo)儀，購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司；Veriti PCR 儀，購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，購(gòu)自上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。CCK-8 試劑盒，購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；總RNA 提取試劑盒，購(gòu)自美國(guó)OMEGA 公司；Hifair?Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、Hieff UNICON?Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix，購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；Western 一抗、二抗稀釋液，購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司；NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα、p-IκBα 一抗，購(gòu)自美國(guó)CST 公司；IL-6、COX-2 一抗，購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；TNF-α 一抗，購(gòu)自美國(guó)Affinity公司；GAPDH 單克隆抗體，購(gòu)自杭州賢至生物科技有限公司；HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗，購(gòu)自武漢普美克生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將LX-2 細(xì)胞接種于含10% FBS、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)達(dá)80%融合后，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3傳代。取傳6代、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的LX-2細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 都勻毛尖茶浸提液制備 取特級(jí)都勻毛尖茶10 g，研磨后加入無(wú)水乙醇和去離子水混合液（體積比2∶1）150 mL，63 ℃水浴超聲30 min，過(guò)濾去渣，獲得都勻毛尖茶浸提液原液。將都勻毛尖茶浸提液原液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空泵中，50 ℃蒸發(fā)無(wú)水乙醇，65 ℃蒸發(fā)剩余水分，獲得都勻毛尖茶干粉約5 g，用時(shí)經(jīng)0.22 μm微孔過(guò)濾器過(guò)濾除菌后稀釋至相應(yīng)濃度。1.4 LX-2 細(xì)胞活性檢測(cè) 采用CCK-8 法。取傳6代、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的LX-2細(xì)胞，接種于96孔板，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，分別加入5、10、20、40、80、160、320、640 μg/mL都勻毛尖茶浸提液10 μL，另設(shè)空白對(duì)照孔和陰性對(duì)照孔，每個(gè)濃度設(shè)6 個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃孵育2 h。酶標(biāo)儀于450 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的光密度（OD）值，按公式計(jì)算細(xì)胞活性。細(xì)胞活性=（實(shí)驗(yàn)孔OD450值-空白對(duì)照孔OD450值）/（陰性對(duì)照孔OD450值-空白對(duì)照孔OD450值）×100%。計(jì)算LX-2 細(xì)胞半數(shù)抑制活性（IC50）時(shí)都勻毛尖茶浸提液濃度，選擇低于LX-2 細(xì)胞IC50時(shí)都勻毛尖茶浸提液濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 細(xì)胞分組干預(yù) 取傳6 代、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的LX-2 細(xì)胞，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組以及茶浸提液低、中、高濃度組和陽(yáng)性對(duì)照組?？瞻讓?duì)照組不予任何處理，常規(guī)培養(yǎng)26 h；模型組予0.5 μg/mL 脂多糖（LPS）預(yù)處理2 h 后常規(guī)培養(yǎng)24 h；茶浸提液低、中、高濃度組予0.5 μg/mL LPS 預(yù)處理2 h 后分別加入低、中、高濃度都勻毛尖茶浸提液處理24 h；陽(yáng)性對(duì)照組予0.5 μg/mL LPS 預(yù)處理2 h 后加入5 μmol/L 水飛薊賓處理24 h。

1.6 炎癥因子基因表達(dá)檢測(cè) 采用RT-qPCR 法。收集各組干預(yù)后LX-2 細(xì)胞，按總RNA 提取試劑盒說(shuō)明提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)NanoDrop 2000 超微量分光光度計(jì)鑒定，OD260/OD280為1.8～2.0。按Hifair?Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit 說(shuō)明將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA 為模板，按Hieff UNICON?Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix 說(shuō)明進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。引物序列：IL-6 上游引物5′-GGCACTGGCAGAAAACAACC-3′、下游引物5′-GGCAAGTCTCCTCATTGAATCC-3′，TNF-α 上游引物5′-GCTGCACTTTGGAGTGATCG-3′、下游引物5′-GCTTGAGGGTTTGCTACAACA-3′，COX-2 上游引物5′-TTCCAATCCATGTCAAAACCGT-3′、下游引物5′-AGTCCGGGTACAGTCACACTT-3′，GAPDH 上游引物5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′、下游引物5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′。PCR 反應(yīng)體系共20 μL：Hieff UNICON?Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA模板4 μL，ddH2O 5.2 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s 共40 個(gè)循環(huán)。PCR 反應(yīng)結(jié)束，繪制熔解曲線，收集循環(huán)閾值（CT）數(shù)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.7 炎癥因子及NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting 法。收集各組干預(yù)后LX-2 細(xì)胞，加入含蛋白酶抑制劑混合物的RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)BCA 法蛋白定量合格。然后加入蛋白上樣緩沖液，置于金屬恒溫孵育器100 ℃加熱變性10 min。取部分變性蛋白，SDS-PAGE 分離。電泳結(jié)束，將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上。5%脫脂奶粉封閉，然后分別加入IL-6、TNF-α、COX-2、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα、p-IκBα、GAPDH 一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。次日，加入HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗，室溫孵育1 h。ECL 發(fā)光，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光、顯影。采用一體式化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像，Image J 軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以GAPDH 為內(nèi)參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 都勻毛尖茶浸提液濃度篩選 0、5、10、20、40、80、160、320、640 μg/mL 都勻毛尖茶浸提液干預(yù)24 h，LX-2 細(xì)胞活性分別為0.854 ± 0.112、0.839 ±0.075、0.803 ± 0.072、0.762 ± 0.049、0.727 ±0.016、0.673 ± 0.016、0.603 ± 0.041、0.501 ±0.009、0.306 ± 0.025。都勻毛尖茶浸提液呈濃度依賴性抑制LX-2 細(xì)胞活性（F=60.160，P＜0.01）。5、10、20 μg/mL 都勻毛尖茶浸提液干預(yù)時(shí)LX-2 細(xì)胞活性雖然呈下降趨勢(shì)，但與0 μg/mL 都勻毛尖茶浸提液干預(yù)時(shí)比較P均＞0.05；而40、80、160、320、640 μg/mL 都勻毛尖茶浸提液干預(yù)時(shí)LX-2 細(xì)胞活性明顯下降，與0 μg/mL 都勻毛尖茶浸提液干預(yù)時(shí)比較P均＜0.05。通過(guò)GraphPad Prism 8.0 軟件計(jì)算，LX-2 細(xì)胞IC50時(shí)都勻毛尖茶浸提液濃度為170.9 μg/mL。因此，選擇40、80、160 μg/mL 都勻毛尖茶浸提液分別作為茶浸提液低、中、高濃度組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 各組IL-6、TNF-α、COX-2表達(dá)比較 見表1。

表1 各組IL-6、TNF-α、COX-2表達(dá)比較（±s）

表1 各組IL-6、TNF-α、COX-2表達(dá)比較（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與茶浸提液低濃度組比較，△P＜0.05；與茶浸提液中濃度組比較，▲P＜0.05；與茶浸提液高濃度組比較，▽P＜0.05。

組別空白對(duì)照組模型組茶浸提液低濃度組茶浸提液中濃度組茶浸提液高濃度組陽(yáng)性對(duì)照組IL-6 mRNA 1.00 ± 0.00 3.16 ± 0.10*2.73 ± 0.11*#2.02 ± 0.10*#△1.68 ± 0.11*#△▲0.86 ± 0.08#△▲▽蛋白0.79 ± 0.14 1.05 ± 0.09*0.74 ± 0.04#0.51 ± 0.02*#△0.29 ± 0.02*#△▲0.29 ± 0.02*#△▲TNF-α mRNA 1.00 ± 0.03 3.74 ± 0.43*2.60 ± 0.13*#2.30 ± 0.12*#1.28 ± 0.09#△▲0.75 ± 0.12#△▲蛋白0.50 ± 0.05 1.42 ± 0.06*1.00 ± 0.05*#0.44 ± 0.03#△0.23 ± 0.05*#△▲0.19 ± 0.02*#△▲COX-2 mRNA 1.00 ± 0.19 6.46 ± 0.23*4.64 ± 0.56*#3.71 ± 0.30*#2.80 ± 0.15*#△2.81 ± 0.48*#△蛋白0.71 ± 0.07 1.08 ± 0.05*0.66 ± 0.05#0.46 ± 0.06*#△0.27 ± 0.04*#△▲0.32 ± 0.02*#△▲

2.3 各組NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα、p-IκBα蛋白表達(dá)比較 見表2。

表2 各組NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα、p-IκBα蛋白表達(dá)比較（±s）

表2 各組NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα、p-IκBα蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與茶浸提液低濃度組比較，△P＜0.05；與茶浸提液中濃度組比較，▲P＜0.05；與茶浸提液高濃度組比較，▽P＜0.05。

p-IκBα 1.18 ± 0.02 1.32 ± 0.03*0.98 ± 0.06*#0.89 ± 0.03*#0.74 ± 0.04*#△▲0.65 ± 0.04*#△▲組別空白對(duì)照組模型組茶浸提液低濃度組茶浸提液中濃度組茶浸提液高濃度組陽(yáng)性對(duì)照組NF-κB p65 1.12 ± 0.01 1.03 ± 0.01*1.00 ± 0.01*1.02 ± 0.01*1.05 ± 0.03*1.03 ± 0.02*p-NF-κB p65 0.87 ± 0.10 1.20 ± 0.01*0.97 ± 0.06#0.87 ± 0.07#0.64 ± 0.02*#△▲0.50 ± 0.02*#△▲IκBα 0.76 ± 0.02 0.82 ± 0.04 0.73 ± 0.01 0.76 ± 0.03 0.77 ± 0.03 0.82 ± 0.05

3 討論

肝纖維化是由各種致病因素導(dǎo)致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生的病理生理過(guò)程，是慢性肝病向肝硬化進(jìn)展的共同環(huán)節(jié)。迄今為止，肝纖維化的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，臨床尚無(wú)有效治療肝纖維化的化學(xué)藥物。近年來(lái)，隨著國(guó)民健康意識(shí)不斷加強(qiáng)以及生活水平不斷提高，國(guó)內(nèi)食品、醫(yī)藥、保健品等行業(yè)正朝著綠色、天然、無(wú)污染方向不斷轉(zhuǎn)型升級(jí)，天然植物及其提取物在疾病防治方面?zhèn)涫荜P(guān)注［7-8］。

茶葉是天然的植物飲品，也是全球第二大飲品。都勻毛尖茶是我國(guó)的十大名茶之一，含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、生物堿、茶多酚等物質(zhì)。其中，茶多酚的含量約占17%［5］。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯是茶多酚中最有效的活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用，能夠抑制氧化損傷，通過(guò)減少Ⅰ型膠原合成、抑制細(xì)胞增殖及基質(zhì)金屬蛋白酶活化，抑制肝星狀細(xì)胞侵襲并誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗肝纖維化作用［9-10］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，都勻毛尖茶浸提液呈濃度依賴性抑制LX-2 細(xì)胞活性，提示都勻毛尖茶浸提液能夠抑制肝纖維化。但目前都勻毛尖茶浸提液抑制肝纖維化的機(jī)制尚不清楚。

IL-6 是一種重要的炎癥因子，可由活化的肝星狀細(xì)胞分泌，而IL-6 增多又可進(jìn)一步刺激肝星狀細(xì)胞增殖，使肝星狀細(xì)胞處于持續(xù)活化狀態(tài)。因此，IL-6 是肝星狀細(xì)胞活化的重要標(biāo)志之一［11］。另外，當(dāng)肝臟存在活動(dòng)性炎癥時(shí)，肝細(xì)胞可分泌炎癥因子IL-6、TNF-α、COX-2，這些炎癥因子又可加重肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步加重肝損傷，從而導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生［12］。因此，IL-6、TNF-α、COX-2是反映肝細(xì)胞炎癥的重要介質(zhì)。本研究通過(guò)GraphPad Prism 8.0軟件計(jì)算，LX-2 細(xì)胞IC50時(shí)都勻毛尖茶浸提液濃度為170.9 μg/mL。因此，選擇40、80、160 μg/mL都勻毛尖茶浸提液分別作為茶浸提液低、中、高濃度組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LX-2細(xì)胞經(jīng)40、80、160 μg/mL都勻毛尖茶浸提液干預(yù)后，LX-2 細(xì)胞活性均顯著降低，這表明都勻毛尖茶浸提液可抑制LX-2 細(xì)胞活性，具有一定抗肝纖維化作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組比較，模型組IL-6、TNF-α、COX-2 mRNA 和蛋白表達(dá)均顯著升高；與模型組比較，茶浸提液低、中、高濃度組IL-6、TNF-α、COX-2 mRNA 和蛋白表達(dá)均顯著降低，尤其是茶浸提液高濃度組效果甚至與陽(yáng)性對(duì)照組相當(dāng)。結(jié)果提示，都勻毛尖茶浸提液可通過(guò)抑制炎癥因子表達(dá)來(lái)減輕肝臟炎癥反應(yīng)，從而抑制肝纖維化發(fā)生。

NF-κB是由Rel、p65、RelB、p50、p52五個(gè)亞單位聚合形成的同源或異源二聚體。NF-κB可通過(guò)與細(xì)胞核內(nèi)特異性κB 序列結(jié)合，誘導(dǎo)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而參與肝臟炎癥損傷，促進(jìn)肝纖維化發(fā)生［13］。IκBα是最具特異性的NF-κB 抑制劑，可通過(guò)其錨蛋白重復(fù)序列與RHD 結(jié)合而掩蓋NF-κB 的核定位信號(hào)，阻止NF-κB 轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。磷酸化的IκBα 被泛素結(jié)合酶識(shí)別發(fā)生快速泛素化并迅速被蛋白酶體降解，從而提高NF-κB 的入核效率，導(dǎo)致NF-κB 活化［14］。有研究報(bào)道，槲皮素、丹參素等天然黃酮類成分可通過(guò)抑制IκBα 磷酸化和降解來(lái)抑制NF-κB 活化，下調(diào)IL-6、TNF-α、COX-2等炎癥因子表達(dá)，從而抑制肝纖維化發(fā)生［15-16］。本研究結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組p-NF-κB p65、p-IκBα 蛋白表達(dá)顯著升高；與模型組比較，茶浸提液低、中、高濃度組p-NF-κB p65、p-IκBα蛋白表達(dá)顯著降低，尤其是茶浸提液高濃度組效果甚至與陽(yáng)性對(duì)照組相當(dāng)。結(jié)果提示，都勻毛尖茶浸提液能夠抑制NF-κB信號(hào)通路活化。

綜上所述，都勻毛尖茶浸提液能夠抑制人肝星狀細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與抑制NF-κB 信號(hào)通路活化而減少炎癥因子產(chǎn)生有關(guān)。但本研究?jī)H通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行初步探究，尚需在體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證都勻毛尖茶浸提液的抗肝纖維化作用及其機(jī)制。