孫佳琦，王晨，王光華，任應黨，祝增榮，白耀宇

（1.西南大學植物保護學院，重慶 400715；2.河南省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，鄭州 450002；3.浙江大學農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學院昆蟲科學研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部作物病蟲分子生物學重點實驗室，杭州 310058）

“再生稻”是指在單季稻基礎上發(fā)展起來的，利用頭季稻收割后稻樁上存活的休眠芽重新發(fā)苗和再生蘗而形成的水稻，通常從8 月下旬水稻收割至10 月下旬稻谷成熟再收割的稻田為再生稻田。種植再生稻是有效提高稻田復種指數(shù)、增加單位面積稻谷產(chǎn)量和經(jīng)濟收入的主要措施之一[1]。目前，廣泛分布在重慶、四川等西南丘陵山區(qū)的單季稻區(qū)水稻種植主要采用中稻或中稻結(jié)合再生稻模式。

有研究指出，在陸地生態(tài)系統(tǒng)廣食性捕食者間，普遍存在能削弱它們對害蟲抑制力的集團內(nèi)捕食（intraguild predation, IGP）作用[2-3]。IGP 是指在一個生態(tài)系統(tǒng)中位于同一營養(yǎng)層或功能團的消費者在它們組成的捕食者/獵物模式中，通過充當不同的角色而分享資源并互作的現(xiàn)象，被視為一種極端種間競爭形式和經(jīng)典的捕食類型。而且這種現(xiàn)象本質(zhì)上能夠影響捕食性天敵對目標害蟲的控制效力[3]。一些生物和非生物因素與IGP 密切相關(guān)，如集團內(nèi)捕食者和集團內(nèi)獵物的相對體型大小[2]、集團外獵物豐度[4]、棲息地結(jié)構(gòu)和復雜性[5]、生境基質(zhì)[6]、溫度[7-9]等。迄今為止，有關(guān)IGP的研究多集中在非稻田生態(tài)系統(tǒng)上。盡管如此，一些研究者指出在水稻生育期稻田捕食者間也普遍存在著IGP 現(xiàn)象。例如，在晚稻種植早期，擬環(huán)紋豹蛛（Pardosa pseudoannulata）（以下簡稱豹蛛）與青翅蟻形隱翅甲（Paederus fuscipes）（以下簡稱隱翅甲）間存在著單向性IGP[10]。而在水稻抽穗期，針對捕食者腸道內(nèi)容物的分子檢測結(jié)果指出，豹蛛和隱翅甲等集團內(nèi)捕食者能獵殺集團內(nèi)獵物黑肩綠盲蝽（Cyrtorhinus lividipennis）和中華淡翅盲蝽（Tytthus chinensis），且這種IGP 作用強度受到集團內(nèi)獵物的種類、水稻品種抗性和集團外獵物豐度的影響[11]。另外，也有研究表明，豹蛛能夠捕食臺灣裂頭小皿蛛（Atypena formosana）和黑肩綠盲蝽[12]。但目前尚無關(guān)于水稻收割后的再生稻田廣食性捕食者間IGP 的研究報道。

豹蛛和隱翅甲是稻田節(jié)肢動物群落中最主要的廣食性捕食性天敵，在水稻收割后的冬水田休耕季節(jié)（包括再生稻期間）發(fā)生量很大[13]。常規(guī)的聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction,PCR）技術(shù)已在有關(guān)捕食作用的研究中被使用[14-15]；而特異性更強、靈敏性更好、準確性更高以及可量化分析的實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR,qPCR）盡管在捕食作用的研究中有一些應用[11,16]，但尚無在上述2 種捕食性天敵間IGP 研究中的報道。鑒于此，本研究建立和優(yōu)化了隱翅甲和豹蛛的qPCR探針法檢測體系，基于此分析再生稻田中這2 種天敵間的IGP 水平，并在室內(nèi)通過兩者的共存試驗系統(tǒng)分析它們間的IGP 及影響該IGP 的生物和非生物因素。該研究的開展可發(fā)掘增強再生稻田捕食性天敵種群發(fā)生的新途徑，為制定可持續(xù)的全年作物系統(tǒng)水稻害蟲“綠色防控”策略提供重要的理論參考依據(jù)，同時也將豐富捕食者間的IGP理論體系。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究地點位于重慶市璧山區(qū)（29°17′—29°53′N，106°02′—106°20′E）。該地的再生稻田為典型的低海拔丘陵山地溝壑田。水稻收割后的再生稻田（8月下旬至10 月下旬）通常不再進行施肥、施藥等管理，但會對其進行蓄水管理，因此也被認為是休耕季節(jié)的早期冬水田[16]。

我們在前期研究[17]的基礎上，選擇了2 個在當?shù)乇容^有代表性的試驗點進行再生稻田供試節(jié)肢動物的采集，試驗地分別位于重慶市璧山區(qū)大路街道（29°43′ N，106°13′ E）和河邊鎮(zhèn)（29°40′ N，106°11′E）。水稻種植模式均為近10年來連續(xù)耕作的一季中稻結(jié)合再生稻種植模式。

1.2 集團內(nèi)獵物DNA 測定

1.2.1 供試節(jié)肢動物

于2020 年9—10 月在上述2 個地點，使用盆拍法結(jié)合人工捕捉法開展豹蛛和隱翅甲及其他節(jié)肢動物的采集。使用乙酸乙酯立即處死采集到的節(jié)肢動物并裝入保存管中帶回實驗室，于－30 ℃冰箱中保存，待用。用于DNA測序的捕食性天敵在田間不立即處死，而是帶回實驗室于25 ℃條件下供水饑餓處理6～7 d（清除腸道內(nèi)的殘留物）后處死，隨后保存于－30 ℃冰箱中，待用。

1.2.2 主要儀器與設備

Centrifuge 5424R 離 心 機（德 國Eppendorf 公司）、DFD-700 水浴鍋（上海樹立儀器儀表有限公司）、YXQ-50S Ⅱ立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業(yè)有限公司）、DYY-6C 電泳儀（北京六一生物科技有限公司）、Universal HoodⅡ凝膠成像系統(tǒng)、T100 Thermal Cycler梯度PCR 儀、CFX384 Touch實時熒光定量PCR儀、DGX-9053B-1鼓風干燥箱、移液器等。

1.2.3 qPCR 檢測體系的建立和優(yōu)化

1.2.3.1 DNA提取、測序和引物與探針設計

使用DNA提取試劑盒D1700（北京索萊寶科技有限公司）提取供試節(jié)肢動物的DNA，采用瓊脂糖凝膠電泳分析提取的DNA 質(zhì)量。使用COⅠ和ITS基因的通用引物進行PCR 擴增[18-19]，擴增產(chǎn)物檢測合格后送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

將測序正確的目標種DNA 序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）中通過BLAST 比對，以驗證物種及序列的準確性，同時搜集下載近緣種同一基因的DNA序列并使用DNAMAN 6.0軟件比對它們間的差異。使用Primer Premier 5.0軟件設計特異性引物和探針，并委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以再生稻田系統(tǒng)內(nèi)共存的其他節(jié)肢動物及水為對照，通過qPCR 檢驗目標種基因引物與探針的特異性，qPCR 擴增體系為：12.5 μL TaqProbe 2×qPCR-Multiplex 預混液，0.5 μL 上、下游引物（20 mmol/L），0.5 μL 探針（20 mmol/L），0.5 μL DNA，10.5 μL ddH2O。反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。

1.2.3.2 qPCR檢測體系的優(yōu)化

檢測體系的優(yōu)化。隱翅甲和豹蛛的檢測體系均為單重qPCR檢測體系；為保證檢測時熒光強度好且擴增曲線平滑完整，對該反應體系進行優(yōu)化，優(yōu)化后的反應體系為：5 μL TaqProbe 2×qPCR-Multiplex預混液，0.05 μL上、下游引物（20 mmol/L），0.025 μL探針（20 mmol/L），1 μL DNA，3.875 μL ddH2O。反應程序為：94 ℃預變性8 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。

檢測下限與重復性分析。委托深圳華大基因科技有限公司直接合成含有靶基因序列的DNA 樣品，對該樣品進行10 倍濃度梯度的稀釋，最終獲得DNA 拷貝數(shù)1×101～1×108copies/μL 8 個濃度梯度的標準品。對低濃度到高濃度的標準品依次進行PCR 擴增，以確定最低檢測濃度。每個濃度設置3組，每組重復3次。

標準曲線的建立與擴增效率分析。選擇最低檢測濃度以上的5個連續(xù)濃度梯度標準品進行PCR擴增，得到該檢測體系的標準曲線方程。該方程的通用公式為：Y（CT）=a×lg（樣品濃度）＋b。其中，CT為循環(huán)閾值（cycle threshold,CT）；a、b為常量。由該方程可知，CT與樣品濃度的對數(shù)呈線性關(guān)系，故使用線性回歸方法構(gòu)建的方程來計算qPCR擴增效率（E），公式為：E=[10（-1/a）－1]×100%。

1.2.4 集團內(nèi)獵物DNA 檢出率及DNA 拷貝數(shù)的測定

為探究不同發(fā)育階段的豹蛛對隱翅甲成蟲捕食的差異，本研究以再生稻田發(fā)生最為普遍的2 種體型的豹蛛蟲態(tài)（中齡幼蛛和亞成蛛/成蛛）為代表，開展它們腸道內(nèi)隱翅甲DNA 的殘留分析。試驗開始前，測得豹蛛亞成蛛/成蛛和中齡幼蛛的體長分別為≥7.0 mm 和4.0～7.0 mm。同時也測量隱翅甲成蟲的體長。使用DNA 提取試劑盒D1700 提取整個捕食者的DNA。為保證DNA 提取的質(zhì)量，參考有關(guān)文獻[20]對體長大于10 mm 的豹蛛僅提取其腹部的DNA。在目標種DNA 提取完成后，檢查DNA質(zhì)量，方法同1.2.3.1節(jié)。

使用1.2.3.2節(jié)中建立的qPCR檢測體系對提取的捕食者DNA樣品進行擴增。PCR擴增結(jié)束后，統(tǒng)計對集團內(nèi)獵物DNA 有陽性反應的集團內(nèi)捕食者的檢測個體樣品數(shù)，并計算集團內(nèi)獵物DNA的檢出率，該檢出率計算公式為：DNA 檢出率=DNA 陽性樣品數(shù)/全部檢測樣品數(shù)×100%。

使用1.2.3.2 節(jié)中建立的檢測體系的標準曲線方程計算檢出基因的DNA拷貝數(shù)，即捕食者腸道內(nèi)集團內(nèi)獵物的DNA 拷貝數(shù)。計算公式為：DNA 拷貝數(shù)=100×10（CT-b）/a。其中，100 為DNA 提取的最終溶液體積，μL。

1.3 2 種捕食性天敵間的IGP 及其影響因素分析

1.3.1 供試節(jié)肢動物及試驗條件

在上述2 個再生稻田采樣點，使用盆拍法結(jié)合人工捕捉的方式獲取隱翅甲成蟲和豹蛛成蛛以及集團外獵物天臺刺齒跳蟲（Homidia tiantaiensis,Ht）和白翅葉蟬（Thaia rubiginosa,Tr）成蟲。供試豹蛛低齡幼蛛為室溫條件下利用天臺刺齒跳蟲飼養(yǎng)攜帶卵囊的雌蛛獲得。所有試驗均在人工氣候箱中的玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)進行。人工氣候箱溫度為（22±1）℃，相對濕度為（85±10）%，光照周期為12 h/12 h（光照/黑暗）。

1.3.2 2 種捕食者間的IGP 分析

為進一步明確這2種天敵間IGP的發(fā)生規(guī)律及程度，在室內(nèi)開展了它們間的IGP 試驗。由于這2種天敵在再生稻田大量發(fā)生且易捕捉到的蟲態(tài)分別為豹蛛成蛛和幼蛛以及隱翅甲成蟲，因此，在參考IGP 理論中集團內(nèi)捕食者/獵物相對體型大小對IGP發(fā)生規(guī)律影響的基礎上，設計了這2種天敵間2類IGP情景配對試驗，即豹蛛成蛛和隱翅甲成蟲間、豹蛛低齡幼蛛和隱翅甲成蟲間的IGP試驗（附圖1，http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2022.07.041）。

1.3.2.1 豹蛛成蛛和隱翅甲成蟲間的IGP試驗

豹蛛成蛛饑餓處理而隱翅甲成蟲未饑餓處理的試驗。試驗前對豹蛛成蛛饑餓處理6 d，且在試驗期間不再飼喂集團外獵物；而隱翅甲成蟲為非饑餓個體。為明晰IGP處理中隱翅甲成蟲死亡是IGP的結(jié)果而非饑餓所致，在試驗期間，每24 h 用集團外獵物天臺刺齒跳蟲飼喂的隱翅甲成蟲活躍個體替換IGP 處理中的個體。在捕食者接入培養(yǎng)皿前，先在空白培養(yǎng)皿底部滴入少許無菌水，然后放入2 種捕食者各1 頭到同一培養(yǎng)皿中，用塑料薄膜將培養(yǎng)皿頂端封住后置于人工氣候箱內(nèi)開始試驗（記為T1）。同時，設置對照組（CK1）。CK1中的豹蛛成蛛和隱翅甲成蟲均為單獨個體，其他同T1處理。觀察期為6 d。在試驗過程中，如某個培養(yǎng)皿中2頭天敵中的一頭（T1）或單獨一頭（CK1）個體死亡，則不再進行該培養(yǎng)皿的觀察試驗并記錄最終試驗結(jié)果。每24 h觀察和記錄一次試驗結(jié)果。在記錄時，標注被豹蛛取食的隱翅甲個體數(shù)（視為集團內(nèi)捕食的結(jié)果）。每個培養(yǎng)皿為1 個重復，各處理重復20～40次。

豹蛛成蛛和隱翅甲成蟲均未饑餓處理的試驗。試驗前對田間采集的豹蛛成蛛和隱翅甲成蟲不進行饑餓處理和飼喂集團外獵物，設置處理組和對照組，分別記為T2和CK2。其他同上。

1.3.2.2 豹蛛低齡幼蛛和隱翅甲成蟲間的IGP試驗

隱翅甲成蟲饑餓處理而豹蛛低齡幼蛛未饑餓處理的試驗。試驗前對隱翅甲饑餓處理6 d。幼蛛為離開雌蛛體背1～2 d 的個體（1～2 齡[21]）。在試驗期間，處理組（T3）中的幼蛛每24 h 用集團外獵物飼喂的活躍個體進行替換，而隱翅甲為饑餓個體。對照組（CK3）中的豹蛛低齡幼蛛和隱翅甲成蟲均為單獨個體，其他同T3處理。另外，在統(tǒng)計結(jié)果時不去除隱翅甲死亡的重復數(shù)。

隱翅甲成蟲和豹蛛低齡幼蛛均未饑餓處理的試驗。在處理組（T4）中，從田間采集的隱翅甲不再進行饑餓處理，同時設置對照組（CK4）。其他同上。

1.3.3 影響2 種捕食者間IGP 的因素分析

上述1.3.2 節(jié)中這2 種捕食者間高IGP 發(fā)生率存在于豹蛛低齡幼蛛和隱翅甲成蟲間，因此，選擇豹蛛低齡幼蛛和隱翅甲成蟲為配對試驗對象開展它們間IGP 發(fā)生的影響因素研究。由于集團外獵物天臺刺齒跳蟲（Ht）和白翅葉蟬（Tr）在該季節(jié)的稻田發(fā)生量巨大[13]，故將他們作為影響該IGP 的生物因子。集團外獵物密度通過預試驗確定，分別采用20 頭Ht 和10 頭Tr。預試驗前，IGP 和對照處理中的隱翅甲成蟲均為饑餓處理6 d 的個體，而豹蛛低齡幼蛛為離開雌蛛體背1～2 d 的個體；試驗期間，IGP 和對照組中的隱翅甲和幼蛛均不飼喂集團外獵物。

共設置5 個生物、非生物因素及其結(jié)合處理。其中，2 個生物因素處理為10 頭Tr（記為10Tr）、10頭Tr＋20頭Ht（10Tr＋20Ht）。2個非生物因素處理為：由10 g 再生稻田滅菌處理后的土壤和13 mL 無菌水混合而成的土壤基質(zhì)（Ss）結(jié)合兩端孔洞封閉的2 根稻稈（Rs）（圖1）處理（Ss＋Rs）、在Ss 基礎上再加入5 mL無菌水且土表面約有1 mm水層（模擬再生稻田生境）的淹水條件（Wi）處理（Ss＋Rs＋Wi）。1 個集團外獵物和上述非生物因子結(jié)合的處理，即Ss＋Rs＋Wi＋20Ht。在上述處理中接入2種捕食者各1頭到培養(yǎng)皿中開始試驗。同時，將豹蛛低齡幼蛛和隱翅甲成蟲單頭個體分別作為上述IGP試驗的非IGP 對照（CK）。各處理重復12～20 次。試驗觀察期均為6 d。其他同1.3.2節(jié)。

圖1 稻稈放置示意圖Fig.1 Diagram of rice straw layout

1.4 統(tǒng)計與分析

使用SPSS 24.0 和Excel 2019 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 2 種捕食者間IGP 的集團內(nèi)獵物DNA 檢測結(jié)果

2.1.1 qPCR 檢測體系引物與探針的特異性

本研究首次設計和合成了擬環(huán)紋豹蛛COⅠ基因和青翅蟻形隱翅甲ITS基因的特異性引物和探針，并在GenBank 數(shù)據(jù)庫進行了登記，具體信息見表1。

表1 qPCR檢測體系的引物與探針信息Table 1 Information for primers and probes of qPCR detection system

利用上述引物對再生稻田常見節(jié)肢動物進行qPCR擴增，結(jié)果如圖2所示。從中可知：該反應體系僅對目標種標記基因有擴增反應，而對62種非目標種（附表1，http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2022.07.041）基因均無擴增反應，說明本研究設計的引物與探針特異性強，完全能用于后續(xù)田間調(diào)查中對這2 種天敵IGP 的檢測分析，且檢測結(jié)果可靠度高。

圖2 青翅蟻形隱翅甲和擬環(huán)紋豹蛛qPCR檢測體系的擴增曲線Fig.2 Amplification curves of qPCR detection systems of Pf and Pp

2.1.2 qPCR 檢測體系的可靠性分析

優(yōu)化后的qPCR 檢測體系靈敏性試驗結(jié)果表明，該體系對這2種捕食者DNA模板的檢測靈敏度高，最低檢測濃度均為1×102copies/μL。同時，重復性試驗結(jié)果進一步表明，該檢測系統(tǒng)CT值的變異系數(shù)均小于5%，說明該檢測體系對這2種天敵標記基因的擴增重復性良好（表2）。

表2 針對2種捕食者建立和優(yōu)化后的qPCR檢測體系的擴增重復性分析Table 2 Amplification repeatability analysis of qPCR detection systems established and optimized for the two predators

根據(jù)5個濃度梯度標準品qPCR的結(jié)果，建立了豹蛛和隱翅甲qPCR 檢測的標準曲線方程，分別為Y=－3.20X＋40.47（R2=0.992）和Y=－3.14X＋39.78（R2=0.989）。同時，由擴增效率計算公式可知，該反應體系對豹蛛和隱翅甲的標記基因擴增效率（E）分別為105.4%、108.2%，且90%＜E＜110%，進一步表明該反應體系擴增效果好，完全能用于這2 種捕食者腸道內(nèi)集團內(nèi)獵物DNA的檢測。

2.1.3 捕食者腸道內(nèi)集團內(nèi)獵物DNA的檢測結(jié)果

2.1.3.1 3類捕食者體長比較

共采集到3 類捕食性天敵1 527 頭，包括511 頭隱翅甲成蟲、484頭豹蛛中齡幼蛛以及532頭豹蛛亞成蛛/成蛛。這3類供試捕食者的體長統(tǒng)計分析結(jié)果見表3。從中可知：同一采樣點3類天敵的體長排序為豹蛛亞成蛛/成蛛＞隱翅甲成蟲＞豹蛛中齡幼蛛，它們之間的體長差異極顯著（P＜0.001），且兩兩間也存在顯著性差異（P＜0.05）；但是，同種天敵在2個不同采樣點間的體長差異均不顯著（P＞0.05）。

表3 用于IGP中集團內(nèi)獵物DNA檢測的捕食者體長分析Table 3 Analysis of the body length of predators used for determination of intraguild prey DNA in the IGP mm

2.1.3.2 DNA檢出率

對采集到的1 527頭隱翅甲和豹蛛個體腸道內(nèi)集團內(nèi)獵物DNA的檢出率進行分析，結(jié)果如圖3所示。從中可知：盡管3類天敵間無IGP（集團內(nèi)獵物DNA 檢出率為0）的發(fā)生率均顯著高于它們間IGP（集團內(nèi)獵物DNA 檢出率大于0）的發(fā)生率（P＜0.05），但隱翅甲成蟲腸道內(nèi)豹蛛DNA 的檢出率及豹蛛亞成蛛/成蛛腸道內(nèi)隱翅甲DNA的檢出率分別高達35.4%和22.7%，而豹蛛中齡幼蛛腸道內(nèi)隱翅甲DNA的檢出率則低至3.9%。

圖3 擬環(huán)紋豹蛛和青翅蟻形隱翅甲間IGP中的集團內(nèi)獵物DNA檢出率Fig.3 DNA detection rates of intraguild prey in the IGP between Pp and Pf

2 個采樣點的隱翅甲腸道內(nèi)豹蛛DNA 的檢出率均為10 月大于9 月，且差異極顯著（P＜0.01），而豹蛛亞成蛛/成蛛腸道內(nèi)隱翅甲DNA的檢出率均為9 月極顯著大于10 月（P＜0.01）。豹蛛中齡幼蛛腸道內(nèi)隱翅甲DNA 的檢出率在9—10 月間的變化規(guī)律因采樣點而異，采樣點1 的該DNA 檢出率為9 月極顯著高于10月（P＜0.01），但采樣點2中9—10月間該DNA 檢出率無顯著性差異（P＞0.05）。另外，除9月隱翅甲體內(nèi)豹蛛DNA檢出率在2個采樣點間差異極顯著外（P＜0.01），同一月3類天敵體內(nèi)集團內(nèi)獵物DNA 檢出率在2 個采樣點間均差異不顯著（P＞0.05）。

3類天敵體內(nèi)集團內(nèi)獵物DNA檢出率與測定的集團內(nèi)捕食者個體數(shù)間均無顯著相關(guān)性（P＞0.05）；其中，在隱翅甲捕食豹蛛、豹蛛中齡幼蛛或亞成蛛/成蛛捕食隱翅甲的IGP中，它們間的Pearson相關(guān)系數(shù)分別為0.07（P=0.94）、0.56（P=0.42）、0.29（P=0.71）。

2.1.3.3 DNA拷貝數(shù)

對上述1 527 頭2 種天敵中檢出有集團內(nèi)獵物DNA 的321 頭個體進一步分析，結(jié)果如表4 所示。從中可知：在隱翅甲成蟲捕食豹蛛中，2個采樣點的集團內(nèi)獵物DNA拷貝數(shù)均為10月大于9月，且采樣點2的結(jié)果差異極顯著（P＜0.01）；在豹蛛中齡幼蛛或亞成蛛/成蛛捕食隱翅甲中，2 個采樣點的集團內(nèi)獵物DNA拷貝數(shù)均為9月大于10月，但差異均不顯著（P＞0.05）。

表4 擬環(huán)紋豹蛛和青翅蟻形隱翅甲腸道內(nèi)集團內(nèi)獵物DNA拷貝數(shù)Table 4 DNA copies of intraguild prey in the guts of Pp and Pf

除9 月的豹蛛亞成蛛/成蛛捕食隱翅甲和10 月的隱翅甲成蟲捕食豹蛛的集團內(nèi)獵物DNA 拷貝數(shù)在不同采樣點間存在顯著性差異（P＜0.05）外，其他月份隱翅甲成蟲捕食豹蛛、豹蛛中齡幼蛛或亞成蛛/成蛛捕食隱翅甲中的集團內(nèi)獵物DNA 拷貝數(shù)在同一月份不同采樣點間均差異不顯著（P＞0.05）。

2.1.3.4 環(huán)境溫度與集團內(nèi)獵物DNA 檢出率的相關(guān)性分析

田間溫度會影響天敵的捕食作用[13]，包括對IGP 的影響[7]，因此，對再生稻田2 個采樣點隱翅甲和豹蛛間的集團內(nèi)獵物DNA 檢出率與環(huán)境溫度隨時間的變化進行相關(guān)性分析，結(jié)果如圖4 所示。從中可知：隱翅甲腸道內(nèi)豹蛛DNA 檢出率可劃分為＞50%、10%～50%和＜10%3 個區(qū)間，與之相對應的DNA 檢出率和環(huán)境溫度均值分別為85.5%和17.5 ℃（溫度區(qū)間為15～21 ℃）、21.0%和18.0 ℃（溫度區(qū)間為15～23 ℃）以及2.0%和22.0 ℃（溫度區(qū)間為17～27 ℃）；豹蛛中齡幼蛛腸道內(nèi)隱翅甲DNA 檢出率則無明顯的區(qū)間變化，大多在10%以下，均值為7.3%；豹蛛亞成蛛/成蛛腸道內(nèi)隱翅甲DNA 檢出率可分為＞35%和＜35%2 個區(qū)間，與之相對應的DNA 檢出率和環(huán)境溫度均值分別為63.3%和22.4 ℃（溫度區(qū)間為17～27 ℃）以及3.7%和17.6 ℃（溫度區(qū)間為15～21 ℃）。

通過Spearman 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，田間溫度與隱翅甲捕食豹蛛后的豹蛛DNA 檢出率間呈極顯著中度負相關(guān)（P＜0.01），與豹蛛亞成蛛/成蛛捕食隱翅甲后的隱翅甲DNA 檢出率呈極顯著中度正相關(guān)（P＜0.01），與豹蛛中齡幼蛛腸道內(nèi)隱翅甲DNA 檢出率相關(guān)性不顯著（P＞0.05）（圖4）。

圖4 擬環(huán)紋豹蛛和青翅蟻形隱翅甲間IGP中的集團內(nèi)獵物DNA檢出率與環(huán)境溫度變化的相關(guān)性Fig.4 Correlations between intraguild prey DNA detection rates in the IGP of Pp and Pf and the changes of ambient temperatures

分別以“積溫模型”“線性模型”和“Logistic 模型”方程擬合田間溫度對這3類天敵體內(nèi)集團內(nèi)獵物DNA檢出率的影響規(guī)律，結(jié)果如圖5所示。從中可知：隱翅甲捕食豹蛛（A）和豹蛛亞成蛛/成蛛捕食隱翅甲（C）的擬合方程均達到極顯著水平（P＜0.01），而豹蛛中齡幼蛛捕食隱翅甲（B）的擬合方程不顯著（P＞0.05）。當溫度升高時，隱翅甲捕食豹蛛的概率顯著下降，豹蛛DNA檢出率達50%時的環(huán)境溫度約為15.5 ℃；而豹蛛亞成蛛/成蛛捕食隱翅甲的概率則隨溫度升高而顯著上升，隱翅甲DNA檢出率達50%時的環(huán)境溫度約為22 ℃，特別是在24～28 ℃間的隱翅甲DNA檢出率高達65%左右（圖5）。

圖5 擬環(huán)紋豹蛛和青翅蟻形隱翅甲間IGP中溫度對集團內(nèi)獵物DNA檢出率的影響Fig.5 Effects of the ambient temperatures on intraguild prey DNA detection rates in the IGP between Pp and Pf

2.2 2 種捕食性天敵間的IGP 規(guī)律及影響因素

2.2.1 2 種捕食者間的IGP 分析

2.2.1.1 2種捕食者的死亡率

試驗前對豹蛛成蛛饑餓處理和隱翅甲成蟲未饑餓處理的試驗中，T1和CK1組均未出現(xiàn)豹蛛死亡，而隱翅甲成蟲的死亡率分別為20%和8%（圖6A）。從中可知：除了第1天外，T1處理中隱翅甲成蟲的死亡率均高于CK1，且在第4—6天出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。在試驗前均未對豹蛛成蛛和隱翅甲成蟲進行饑餓處理的試驗中，T2和CK2組均未出現(xiàn)豹蛛死亡，而隱翅甲成蟲的死亡率分別為23%和15%（圖6B）。從中可知，從第3天開始T2處理中隱翅甲成蟲的死亡率均高于CK2，但兩者間差異不顯著（P＞0.05）。

另外，由圖6A和圖6B比較可知，在相同的觀察時間T1和T2間的隱翅甲死亡率均差異不顯著（P＞0.05）；與此相似，CK1和CK2間的隱翅甲死亡率在各個觀察時間也均差異不顯著（P＞0.05）。

圖6 22 ℃下培養(yǎng)皿共存系統(tǒng)中饑餓（A）和未饑餓（B）擬環(huán)紋豹蛛成蛛與未饑餓青翅蟻形隱翅甲成蟲間的IGP分析Fig.6 IGP analysis between non-starvation adult Pf and adult Pp of starvation (A) and non-starvation (B) treatments in Petri dish coexistence systems at 22 ℃

試驗前對豹蛛低齡幼蛛未饑餓處理和隱翅甲成蟲饑餓處理的試驗中，T3和CK3組均出現(xiàn)了豹蛛低齡幼蛛和隱翅甲成蟲死亡的情況。其中，在T3處理中，豹蛛低齡幼蛛和隱翅甲成蟲的死亡率分別為48%和23%；而在CK3組中，豹蛛低齡幼蛛和隱翅甲成蟲的死亡率分別為5%和25%（圖7A1～A2）。從中可知：T3處理中豹蛛低齡幼蛛的死亡率除了第1天顯著高于CK3組（P＜0.05）外，其他時間均極顯著高于CK3組（P＜0.01）；在第1—4 天，隱翅甲成蟲的死亡率在2個處理間無顯著差異（P＞0.05），但在第5—6 天，CK3組中隱翅甲成蟲的死亡率顯著高于T3組（P＜0.05）。

試驗前對豹蛛低齡幼蛛和隱翅甲成蟲均未饑餓處理的試驗中，T4和CK4組均出現(xiàn)了豹蛛低齡幼蛛和隱翅甲成蟲死亡的情況。其中，在T4處理中豹蛛低齡幼蛛和隱翅甲成蟲的死亡率分別為53%和13%；而在CK4中豹蛛低齡幼蛛和隱翅甲成蟲的死亡率分別為5%和15%（圖7B1～B2）。從中可知，T4處理中豹蛛低齡幼蛛的死亡率在每個觀察時間均高于CK4組，且在第3 天后均極顯著高于CK4組（P＜0.01）；而第3—5天隱翅甲成蟲的死亡率在T4和CK4組間差異不顯著（P＞0.05）。

由圖7可知，除第2天（P＜0.01）外，IGP處理和對照組的豹蛛低齡幼蛛死亡率在隱翅甲成蟲饑餓和未饑餓試驗（圖7A1、B1）對應的各個觀察時間均差異不顯著（P＞0.05）。同時，IGP處理的隱翅甲成蟲死亡率在這2個試驗（圖7A2、B2）對應的各個觀察時間均差異不顯著（P＞0.05）；除了第1 天（死亡率為0）外，CK3和CK4的隱翅甲成蟲死亡率在這2個試驗對應的各個觀察時間均出現(xiàn)了顯著性差異（P＜0.05）。

圖7 22 ℃下培養(yǎng)皿共存系統(tǒng)中饑餓（A1～A2）和未饑餓（B1～B2）青翅蟻形隱翅甲成蟲與未饑餓擬環(huán)紋豹蛛低齡幼蛛間的IGP分析Fig.7 IGP analysis between non-starvation low-instar juvenile Pp and adult Pf of starvation (A1-A2) and non-starvation (B1-B2)treatments in Petri dish coexistence systems at 22 ℃

2.2.1.2 IGP的水平與對稱性

在2.2.1.1節(jié)豹蛛成蛛和隱翅甲成蟲的2個集團內(nèi)捕食試驗中，豹蛛成蛛的死亡率均為0，豹蛛成蛛捕殺隱翅甲成蟲的IGP 發(fā)生率均很低，且豹蛛成蛛總是單向性捕食隱翅甲成蟲。在2.2.1.1 節(jié)豹蛛低齡幼蛛和隱翅甲成蟲的2 個集團內(nèi)捕食試驗中，豹蛛低齡幼蛛和隱翅甲成蟲均有死亡現(xiàn)象發(fā)生，隱翅甲成蟲捕殺豹蛛低齡幼蛛的IGP 發(fā)生率均較高，且隱翅甲成蟲也總是單向性捕食豹蛛低齡幼蛛。另外，上述這2 類配對試驗中捕食者間的IGP 對稱性均為完全非對稱（表5）。

表5 22 ℃下培養(yǎng)皿共存系統(tǒng)中擬環(huán)紋豹蛛和青翅蟻形隱翅甲間的IGP分析Table 5 IGP analysis between Pp and Pf in Petri dish coexistence systems at 22 ℃

2.2.2 影響因素分析

上述2.2.1 節(jié)中，IGP 發(fā)生率高的配對試驗存在于豹蛛低齡幼蛛和隱翅甲成蟲之間，因此，選擇該配對試驗進行它們間的IGP影響因素分析。結(jié)果表明：除了第2 天外，其他觀察時間Ss＋Rs＋Wi＋20Ht 處理中豹蛛低齡幼蛛的存活率均顯著大于Ss＋Rs＋Wi處理的值（P＜0.05）；在第4—6天，Ss＋Rs＋Wi＋20Ht 處理中豹蛛低齡幼蛛的存活率也顯著大于10Tr處理的值（P＜0.05）；另外，除Ss＋Rs＋Wi＋20Ht 處理外，在所有觀察時間，CK 處理中豹蛛低齡幼蛛的存活率均高于其他各處理的值，且與Ss＋Rs＋Wi 處理的值均差異顯著（P＜0.05），也與除第2 天外的其他各觀察時間的10Tr＋20 Ht 處理的值差異顯著（P＜0.05）（Kruskal-WallisH單因素檢驗法）（圖8）。

圖8 各因素對擬環(huán)紋豹蛛低齡幼蛛和青翅蟻形隱翅甲成蟲間IGP中集團內(nèi)獵物存活率的影響Fig.8 Effects of different factors on the survival rates of intraguild prey in the IGP of low-instar juvenile Pp and adult Pf

3 討論與結(jié)論

3.1 2 種捕食性天敵間IGP 的分子檢測

利用qPCR方法研究捕食者捕食作用的關(guān)鍵和難點是特異性靶基因引物和探針的設計[22]，這是因為，在PCR擴增過程中出現(xiàn)的假陽性會影響檢測結(jié)果的準確性。另外，對一些近緣物種來說，在同一基因上尋找連續(xù)3個差異堿基的難度很大。本研究首次建立和優(yōu)化的qPCR檢測體系中，針對這2種捕食者靶基因設計的引物和探針的特異性很強；該檢測體系的變異系數(shù)均小于5%，檢測的靈敏度也比較高，能滿足田間樣品分析的要求。此外，本研究建立的qPCR 檢測體系的擴增效率為90%～110%，這進一步表明該檢測體系的結(jié)果可靠。

再生稻田擬環(huán)紋豹蛛不同發(fā)育階段各蟲態(tài)（成蛛和幼蛛）及青翅蟻形隱翅甲成蟲的發(fā)生量均很大。而經(jīng)典的IGP 理論認為，集團內(nèi)捕食者和集團內(nèi)獵物的角色定位與它們間相對體型大?。òl(fā)育階段）密切相關(guān)[2]。因此，本研究選擇2個發(fā)育階段（用體長表示）的擬環(huán)紋豹蛛蟲態(tài)為試驗對象，分析了它們與青翅蟻形隱翅甲成蟲間的IGP關(guān)系；同時，根據(jù)王智[21]報道可知，這些豹蛛亞成蛛和中齡幼蛛齡期應分別為7～8齡和5～6齡。本研究中這些試驗對象的體長分析表明，3 類捕食者個體能有效反映它們之間的IGP 關(guān)系。有研究也指出，不同體型大小的捕食者間或同一捕食者各發(fā)育階段蟲態(tài)間的IGP存在明顯差異[4,23-24]。

盡管在晚稻早期，血清學研究已指出了豹蛛能捕殺隱翅甲[10]，但相較于qPCR 探針法，血清學方法存在檢測靈敏度和準確度較低的缺點。此外，隱翅甲能否捕食豹蛛尚未見報道。本研究結(jié)果表明，再生稻田青翅蟻形隱翅甲和擬環(huán)紋豹蛛間存在較為普遍的雙向IGP。相關(guān)的研究也指出稻田捕食者間普遍存在IGP。例如，基于qPCR 技術(shù)的研究表明，水稻抽穗期稻田的蜘蛛等主要捕食者對稻飛虱2種重要天敵黑肩綠盲蝽和中華淡翅盲蝽存在IGP[11]。而稻田籠罩試驗結(jié)果表明，擬環(huán)紋豹蛛、臺灣裂頭小皿蛛和黑肩綠盲蝽三者間存在IGP，且該IGP 抑制了臺灣裂頭小皿蛛和黑肩綠盲蝽種群的發(fā)生量[12]。本研究結(jié)果還顯示，這2種捕食者間IGP的發(fā)生率與它們的發(fā)育階段（相對體型大?。┐嬖谥芮嘘P(guān)系。IGP 理論也認為，捕食者間的相對體型大小決定著IGP的方向和發(fā)生率[2]。本研究中，環(huán)境溫度變化也顯著影響了再生稻田集團內(nèi)捕食者腸道內(nèi)的集團內(nèi)獵物DNA檢出率；而且從環(huán)境溫度和該DNA檢出率的回歸方程可知，隱翅甲成蟲對豹蛛的IGP 主要發(fā)生在再生稻田較低溫階段，而豹蛛對隱翅甲的IGP主要發(fā)生在該稻田較高溫時期。有研究指出，環(huán)境溫度能影響擬環(huán)紋豹蛛等集團內(nèi)捕食者對集團內(nèi)獵物的IGP 強度，且這種影響程度也與不同的集團內(nèi)捕食者種類有關(guān)[25]。FRANCES等[7]對3種蜻蜓幼蟲的IGP 進行研究后發(fā)現(xiàn)，不同種類的蜻蜓幼蟲對溫度變化表現(xiàn)出不同的行為反應：當溫度升高時，白顏蜻（Leucorrhinia intacta）幼蟲的被捕食率顯著增加，且增加的幅度明顯超過了淡藍鷹蜻（Erythemis simplicicollis）和普通白尾蜻（Plathemis lydia）幼蟲被捕食率增加的幅度。ROGERS 等[8]研究表明，當?shù)氐乃{蟹（Callinectes sapidus）在高溫時更有競爭力，而入侵的歐洲青蟹（Carcinus maenas）在低溫下更有競爭性；溫度升高增強了藍蟹的捕食能力，即藍蟹對歐洲青蟹的捕食率顯著提高。最新研究指出，溫度升高影響了異色瓢蟲（Harmonia axyridis）和龜紋瓢蟲（Propylaea japonica）的種間干擾競爭及對桃蚜（Myzus persicae）的捕食率[9]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在氣溫較低的10 月，隱翅甲腸道內(nèi)豹蛛DNA 拷貝數(shù)要普遍高于溫度較高的9 月。昆蟲和蜘蛛作為冷血動物，其代謝能力易受到環(huán)境溫度變化的影響[26]，而低溫能減緩捕食者體內(nèi)獵物DNA 的消化和降解速率[27]。例如，在環(huán)境溫度為20 ℃時，2 種步甲（Pterostichus melanarius和Nebria brevicollis）對麥長管蚜（Sitobion avenae）的消化能力顯著高于在12 ℃和16 ℃下的消化能力[28]；地豹蛛（Pardosa agraria）和肖蛸蛛（Tetragnathaspp.）對赤條纖盲蝽（Stenotus rubrovittatus）的消化能力在25 ℃時要顯著高于16 ℃[29]。但也存在相反的研究結(jié)果，即捕食者對獵物的消化能力受溫度變化的影響較小。例如，二星瓢蟲（Adalia bipunctata）對禾谷縊管蚜（Rhopalosiphum padi）的消化能力在21 ℃和14 ℃間無顯著性差異[30]。此外，捕食者腸道內(nèi)獵物DNA殘留量還與其取食量密切相關(guān)。例如，大斑長足瓢蟲（Coleomegilla maculata）取食馬鈴薯甲蟲（Leptinotarsa decemlineata）卵的數(shù)量顯著影響了其腸道內(nèi)馬鈴薯甲蟲DNA拷貝數(shù)，瓢蟲取食獵物的量越大，其腸道內(nèi)獵物DNA 的拷貝數(shù)就越多[31]。因此，本研究中2種捕食者腸道內(nèi)集團內(nèi)獵物DNA的拷貝數(shù)在10 月和9 月之間的差異也可能與它們在不同季節(jié)溫度下對集團內(nèi)獵物的采食量有關(guān)。

3.2 2 種捕食性天敵間的IGP 及其影響因素分析

IGP理論認為，2種物種（包括幼期）間IGP的方向通常是單向性的且不對稱的[2]，但也存在雙向性和對稱的情況[4]。本研究的室內(nèi)試驗結(jié)果指出，擬環(huán)紋豹蛛和青翅蟻形隱翅甲成蟲間的IGP方向是雙向性的且不對稱的，但它們之間誰是集團內(nèi)捕食者或獵物與它們個體所處的發(fā)育階段直接相關(guān)。這種結(jié)果與DNA 檢出率統(tǒng)計結(jié)果存在一致性。相關(guān)研究指出，在特定生態(tài)系統(tǒng)中，這些廣食性天敵間的IGP 常為單向性的，即體型大的種類捕殺體型小的種類[32]。本研究的室內(nèi)試驗還發(fā)現(xiàn)，豹蛛亞成蛛/成蛛與隱翅甲成蟲間的IGP 發(fā)生率很低，這與再生稻田IGP分子檢測的結(jié)果相矛盾；由此，我們推測再生稻田中這種較高DNA檢出率可能是豹蛛亞成蛛/成蛛捕殺隱翅甲幼蟲導致的結(jié)果，而這有待進一步的研究。另外，本研究也發(fā)現(xiàn)，集團內(nèi)捕食者的饑餓程度能夠明顯影響IGP 發(fā)生的進度，但對該IGP發(fā)生率的影響卻有限；集團外獵物的存在可降低IGP 的強度，但沒有改變IGP 的方向和對稱性。在水稻抽穗期稻田，不同種類捕食者（蜘蛛和隱翅甲）對稻飛虱天敵黑肩綠盲蝽和中華淡翅盲蝽存在IGP，集團內(nèi)捕食者對黑肩綠盲蝽的IGP 強度顯著高于對中華淡翅盲蝽的強度，黑肩綠盲蝽和中華淡翅盲蝽遭遇的IGP 強度與捕食者種類及集團外獵物的豐度有關(guān)[11]。在水稻生育后期稻田，集團內(nèi)獵物黑肩綠盲蝽的存在明顯降低了集團內(nèi)捕食者擬環(huán)紋豹蛛對集團內(nèi)獵物臺灣裂頭小皿蛛的捕食強度[12]。

根據(jù)本研究中2種天敵間IGP的分子檢測結(jié)果推測，隱翅甲成蟲對豹蛛的IGP 應該發(fā)生在豹蛛低齡幼蛛階段，而豹蛛對隱翅甲的IGP 應該發(fā)生在豹蛛亞成蛛/成蛛階段。據(jù)此，本研究設計了豹蛛1～2齡幼蛛/成蛛與隱翅甲成蟲的2個室內(nèi)IGP試驗。其中，室內(nèi)IGP 試驗結(jié)果明確了隱翅甲成蟲與豹蛛低齡幼蛛間具有較高IGP發(fā)生率的結(jié)論，顯然，這是對隱翅甲成蟲體內(nèi)豹蛛DNA 檢出結(jié)果的進一步重要解析。同時，本研究使用天臺刺齒跳蟲和白翅葉蟬作為影響這2 種捕食者IGP 的集團外獵物，這主要是因為這2種集團外獵物在7個月的休耕季節(jié)冬水田生境（包括再生稻田）發(fā)生量巨大，特別是刺齒跳蟲等彈尾蟲種類在該季節(jié)水稻/植物殘體系統(tǒng)重建的節(jié)肢動物群落中充當了“關(guān)鍵/中心”類群[13,16-17]。結(jié)果表明，上述2 種集團外獵物對這2 種捕食者間IGP 發(fā)生率的影響與豹蛛的發(fā)育階段（相對體型大?。┯嘘P(guān)，而且集團外獵物和非生物因素的結(jié)合能顯著降低捕食者間IGP 的發(fā)生率。YU 等[33]和RANJBAR等[34]研究發(fā)現(xiàn)，瓢蟲間的IGP發(fā)生率隨集團外獵物的增加而顯著下降。但是，集團外獵物的增加也并不總是降低IGP 的發(fā)生，而這種情況的發(fā)生通常與IGP中集團內(nèi)捕食者和集團內(nèi)獵物雙方幼體期所處的不同發(fā)育階段有關(guān)[4]。

本研究中設置的稻稈主要作為集團內(nèi)獵物的避難所，此外，土壤基質(zhì)和淹水條件的設置還模擬了田間生境條件，而這些非生物因素無疑都增加了捕食者生境的復雜性，且其與集團外獵物在試驗期間的結(jié)合不同程度地影響了捕食者間IGP 的發(fā)生率。有研究指出，生境中水的存在能增加擬水狼蛛（Pirata subpiraticus）對褐飛虱的捕食量，但對食蟲溝瘤蛛（Oedothorax insecticeps）的捕食量無影響[35]。其他研究發(fā)現(xiàn)，在楔形舞蛛（Alopecosa cuneata）捕食沼澤豹蛛（Pardosa palustris）試驗中，掩體的存在能減少豹蛛幼蛛死亡率，認為微生境復雜性可增強狼蛛科不同種類在農(nóng)田中的共存性[36]。冬季果園誘捕試驗顯示，誘捕器中避難所的存在會影響近管蛛（Anyphaenaspp.）和逍遙蛛（Philodromusspp.）的死亡率；與無避難所誘捕器相比，有避難所誘捕器能明顯降低小型蜘蛛的死亡率（被較大蜘蛛捕食）[37]。RYPSTRA 等[6]的研究指出，生境復雜性對豹蛛Pardosa milvina和穴狼蛛Hogna helluo的捕食均產(chǎn)生了不利影響，但這種生境復雜性也保護了該豹蛛免被穴狼蛛捕食。

總之，本研究首次建立了青翅蟻形隱翅甲和擬環(huán)紋豹蛛的qPCR 探針法檢測體系，在此基礎上揭示了再生稻田中這2 種捕食者間IGP 的發(fā)生規(guī)律，并進一步在室內(nèi)條件下探究了影響該IGP規(guī)律的生物和非生物因素。這些研究結(jié)果為深入研究稻田捕食性天敵間IGP 打下了堅實的技術(shù)方法基礎，同時豐富了農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中捕食者間的IGP 理論體系。