長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)母系表達(dá)基因3(MEG3)對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠模型視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響△

王艷平 劉含軍

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是發(fā)生于糖尿病患者的微血管并發(fā)癥，主要病理學(xué)特征包括視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞受損、管腔變窄、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡等，可造成患者視力不同程度受損[1-2]。高糖可導(dǎo)致炎癥因子過(guò)量表達(dá)，引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。抗炎治療是目前改善DR的有效方法[3-4]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)母系表達(dá)基因3(MEG3)在DR患者體內(nèi)表達(dá)明顯減少，促進(jìn)其表達(dá)可抑制炎癥，降低汞誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞凋亡[5]，并可通過(guò)抑制炎癥因子的產(chǎn)生而減輕Müller細(xì)胞的膠質(zhì)增生，延緩DR進(jìn)展[6]。miR-145-5p是一種調(diào)控炎癥和細(xì)胞增殖與凋亡的重要微小RNA分子，轉(zhuǎn)染miR-145-5p抑制劑可降低炎癥因子表達(dá)，提高高糖環(huán)境下視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞活力，抑制其凋亡。因此，miR-145-5p可能是治療DR的重要靶點(diǎn)[7-8]。有研究顯示，在缺血再灌注損傷處理的腎臟細(xì)胞中，LncRNA MEG3可與miR-145-5p結(jié)合并下調(diào)其表達(dá)[9]，但LncRNA MEG3是否可通過(guò)靶向miR-145-5p影響DR大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，目前尚不清楚。本文通過(guò)構(gòu)建DR大鼠及細(xì)胞模型，探討LncRNA MEG3對(duì)DR大鼠模型視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞SPF級(jí)雄性SD大鼠購(gòu)自寧波科瑞特動(dòng)物藥業(yè)有限公司，體質(zhì)量為180～210 g。將大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠不超過(guò)6只，在本院動(dòng)物中心屏障環(huán)境下飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。本研究實(shí)驗(yàn)操作遵守3R原則，動(dòng)物處理遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》(2017修訂版)的規(guī)定。人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HRMEC)、HRMEC完全培養(yǎng)基均購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.2 主要試劑及儀器鏈脲佐菌素(試劑級(jí))、葡萄糖(純度≥99.5%)、miR-145-5p與U6引物、LncRNA MEG3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、miR-145-5p agomir、LncRNA MEG3空載質(zhì)粒、miR-145-5p agomir陰性對(duì)照、野生型miR-145-5p報(bào)告質(zhì)粒、突變型miR-145-5p報(bào)告質(zhì)粒、RIPA裂解液均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司，伊文思藍(lán)(EB)溶液(純度≥85%)、Opti-MEM減血清培養(yǎng)基、總RNA提取試劑盒、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、即用型Hoechst 33258染色液(10 mg·L-1)、脂質(zhì)體2000、一步法實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，Cell-LightTMEdU熒光顯微鏡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣州市銳博生物科技有限公司，雙熒光素酶試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，白細(xì)胞介素(IL)-1β檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒、IL-6檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，兔源β-actin一抗、兔源Bcl-2一抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗、兔源Bax一抗均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

EnSpireTM2300全自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)自英國(guó)PerkinElmer公司，F(xiàn)SX100熒光顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司，Stepone plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自ABI公司，F(xiàn)96Pro熒光分光光度計(jì)購(gòu)自上海棱光技術(shù)有限公司，CM3600 XP冷凍切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica公司，Trans-Blot SD半干轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)、PowerPac Universal電泳儀、GelDox XR+凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 DR大鼠模型制備參照文獻(xiàn)[10]制備DR大鼠模型：將鏈脲佐菌素溶于0.1 mol·L-1的檸檬酸緩沖液中，制成6 g·L-1溶液；大鼠禁食12 h后，自腹腔按照10 mL·kg-1劑量注入鏈脲佐菌素溶液，使其終劑量達(dá)到60 mg·kg-1，72 h后測(cè)量大鼠尾靜脈血樣中血糖水平，每天測(cè)量3次，連續(xù)一周內(nèi)血糖濃度均超過(guò)16.7 mmol·L-1，表明DR模型建立成功。共成功構(gòu)建DR模型大鼠60只，隨機(jī)分為模型組、LncRNA MEG3過(guò)表達(dá)組、miR-145-5p agomir組、共轉(zhuǎn)染組、共轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組，每組分配12只大鼠，再取12只大鼠按照10 mL·kg-1劑量自腹腔注入0.1 mol·L-1檸檬酸緩沖液，作為對(duì)照組。

1.2.2 大鼠分組給藥及視網(wǎng)膜血管通透性檢測(cè)參照文獻(xiàn)[11] 給予大鼠藥物：LncRNA MEG3過(guò)表達(dá)組大鼠玻璃體內(nèi)注射LncRNA MEG3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(濃度參照說(shuō)明書設(shè)定)；miR-145-5p agomir組大鼠玻璃體內(nèi)注射miR-145-5p agomir(濃度參照說(shuō)明書設(shè)定)；共轉(zhuǎn)染組大鼠玻璃體內(nèi)同時(shí)注射LncRNA MEG3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和miR-145-5p agomir；共轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組大鼠玻璃體內(nèi)同時(shí)注射LncRNA MEG3空載質(zhì)粒和miR-145-5p agomir陰性對(duì)照質(zhì)粒，各組大鼠均每7 d注射1次，共注射9次。

視網(wǎng)膜血管通透性檢測(cè)：第9次注射后7 d，每組隨機(jī)選出6只大鼠，自尾靜脈向其體內(nèi)注射20 g·L-1EB溶液5 mL，2 h后將大鼠置于充滿乙醚氣體的玻璃瓶中麻醉，然后取大鼠玻璃體，加入生理鹽水研磨后離心，采用熒光分光光度計(jì)測(cè)出上清中EB含量，借此反映視網(wǎng)膜血管通透性。

1.2.3 大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡檢測(cè)及標(biāo)本采集第9次注射后7 d，將每組剩余的6只大鼠以同樣方法麻醉后取出房水，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩⑷〕龇克蟮拇笫?，每組隨機(jī)選出3只，取大鼠視網(wǎng)膜組織后平分為兩份，一份存在液氮備用，另一份加入RIPA裂解液于冰水中高速研磨成漿，離心(4 ℃，20 min，1000 r·min-1)后以BCA試劑盒測(cè)量上清液中蛋白總濃度，根據(jù)測(cè)量結(jié)果將各組蛋白濃度調(diào)至相同后置入-80 ℃保存?zhèn)溆?；將剩余?只大鼠取出視網(wǎng)膜組織后，包埋并置于液氮中快速冰凍成塊狀，使用冰凍切片機(jī)將其切為連續(xù)的薄片，自其中選出沒(méi)有破損且厚薄均勻的切片，室溫中靜置5 min后，浸入冰丙酮中固定后以TUNEL試劑盒染色，漂洗后封片觀察，隨機(jī)采集5個(gè)視野圖像，以ImageJ軟件分析，計(jì)算細(xì)胞凋亡率(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%)。

1.2.4 DR細(xì)胞模型制備及分組處理將購(gòu)買的HRMEC復(fù)蘇后置于37 ℃含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中無(wú)菌培養(yǎng)，細(xì)胞融合度達(dá)到約80%時(shí)傳代，然后接種在12孔板中無(wú)菌培養(yǎng)12 h，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、LncRNA MEG3過(guò)表達(dá)組、miR-145-5p agomir組、共轉(zhuǎn)染組、共轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組，對(duì)照組細(xì)胞以HRMEC完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，其余5組細(xì)胞均以含有25 mmol·L-1葡萄糖的HRMEC完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，誘導(dǎo)出DR細(xì)胞模型[11]，然后嚴(yán)格遵照脂質(zhì)體2000試劑盒說(shuō)明書指導(dǎo)步驟分組轉(zhuǎn)染質(zhì)粒、miR-145-5p agomir及其陰性對(duì)照質(zhì)粒。

1.2.5 細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡檢測(cè)及標(biāo)本采集細(xì)胞分組轉(zhuǎn)染48 h后，棄去培養(yǎng)基，輕柔洗滌細(xì)胞后加入40 g·L-1多聚甲醛溶液固定2 h，然后加入EdU，嚴(yán)格遵照Cell-LightTMEdU熒光顯微鏡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書指導(dǎo)步驟檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，熒光顯微鏡下觀察可發(fā)現(xiàn)EdU陽(yáng)性細(xì)胞，即是增殖細(xì)胞，將對(duì)照組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)其余各組相對(duì)于對(duì)照組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例，即是各組細(xì)胞增殖率，對(duì)照組記為100%。

將傳代的HRMEC接種在12孔板，以同樣方法分組轉(zhuǎn)染后48 h，棄去培養(yǎng)基，輕柔洗滌細(xì)胞后加入40 g·L-1多聚甲醛溶液固定2 h，然后加入10 mg·L-1的Hoechst 33258染色5 min，熒光顯微鏡下觀察可發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞，將對(duì)照組的凋亡細(xì)胞數(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)其余各組相對(duì)于對(duì)照組的凋亡細(xì)胞比例，即是各組細(xì)胞凋亡率，對(duì)照組記為100%。

將傳代的HRMEC接種在12孔板，以同樣方法分組轉(zhuǎn)染后48 h，收集各組細(xì)胞及其培養(yǎng)液備用。

1.2.6 大鼠房水中及HRMEC炎癥因子IL-6、IL-1β含量檢測(cè)取出1.2.3中大鼠房水置于4 ℃冰箱中凍融，取1.2.5中備用的各組細(xì)胞培養(yǎng)液離心(4 ℃，20 min，1000 r·min-1),以試劑盒測(cè)量房水及細(xì)胞培養(yǎng)液離心后上清液中IL-6、IL-1β含量，具體步驟嚴(yán)格遵照試劑盒說(shuō)明書指導(dǎo)進(jìn)行。

1.2.7 HRMEC及大鼠視網(wǎng)膜組織miR-145-5p表達(dá)水平檢測(cè)取出1.2.3中存于液氮中的大鼠視網(wǎng)膜組織和1.2.5中備用的各組細(xì)胞，均以總RNA提取試劑盒將其中總RNA提取出來(lái)，然后通過(guò)一步法實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，具體步驟及反應(yīng)條件嚴(yán)格遵照試劑盒說(shuō)明書指導(dǎo)進(jìn)行，所得數(shù)據(jù)以算法2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算。各基因引物序列見(jiàn)表1。

1.2.8 HRMEC及大鼠視網(wǎng)膜組織凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax表達(dá)水平檢測(cè)采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)HRMEC及大鼠視網(wǎng)膜組織凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2、Bax)表達(dá)。取出1.2.3中保存的大鼠視網(wǎng)膜組織蛋白樣品液置于4 ℃冰箱中凍融，取1.2.5中備用的各組細(xì)胞，以RIPA裂解液提取總蛋白后離心(4 ℃，20 min，1000 r·min-1)，以BCA試劑盒測(cè)量蛋白總濃度后調(diào)至各組相同，然后分別取上述各組大鼠視網(wǎng)膜組織及細(xì)胞蛋白樣品液20 μL，加熱變性蛋白后，依次進(jìn)行電泳、半干轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)，封閉膜上蛋白非特異位點(diǎn)，孵育兔源抗大鼠Bcl-2、Bax及β-actin一抗，洗滌、孵育辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗，洗滌、顯影，拍照后采集蛋白條帶圖像，并以 ImageJ 軟件測(cè)定其灰度值，以內(nèi)參β-actin為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算各組蛋白的相對(duì)表達(dá)量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 基因引物序列

1.2.9 LncRNA MEG3對(duì)miR-145-5p靶向調(diào)控的檢測(cè)將傳代的HRMEC接種于24孔板，無(wú)菌培養(yǎng)12 h后隨機(jī)分為6組：轉(zhuǎn)染野生型miR-145-5p報(bào)告質(zhì)粒+LncRNA MEG3空載質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染野生型miR-145-5p報(bào)告質(zhì)粒+LncRNA MEG3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染突變型miR-145-5p報(bào)告質(zhì)粒+LncRNA MEG3空載質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染突變型miR-145-5p報(bào)告質(zhì)粒+LncRNA MEG3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染miR-145-5p無(wú)義序列+LncRNA MEG3空載質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染miR-145-5p無(wú)義序列+LncRNA MEG3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組，以1.2.4中方法分組轉(zhuǎn)染24 h后，收集各組細(xì)胞并用試劑盒檢測(cè)雙熒光素酶相對(duì)活性，具體操作遵照說(shuō)明書指導(dǎo)步驟進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 24.0軟件做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)照組與模型組之間差異比較采用t檢驗(yàn)；模型組與其余各組之間差異比較采用單因素方差分析，兩兩之間進(jìn)一步比較行LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠玻璃體中EB含量、視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率及房水中炎癥因子IL-6、IL-1β含量模型組大鼠玻璃體中EB含量、視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率及房水中IL-6、IL-1β含量均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。LncRNA MEG3過(guò)表達(dá)組大鼠玻璃體中EB含量、視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率及房水中IL-6、IL-1β含量均低于模型組、共轉(zhuǎn)染組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；miR-145-5p agomir組大鼠玻璃體中EB含量、視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率及房水中IL-6、IL-1β含量均高于模型組、共轉(zhuǎn)染組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；共轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組大鼠玻璃體中EB含量、視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率及房水中IL-6、IL-1β含量與模型組、共轉(zhuǎn)染組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)(圖1和表2)。

圖1 各組大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況(×200) A：對(duì)照組；B：模型組；C：LncRNA MEG3過(guò)表達(dá)組；D：miR-145-5p agomir組；E：共轉(zhuǎn)染組；F：共轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組。

2.2 各組HRMEC增殖率、凋亡率及炎癥因子IL-6、IL-1β含量模型組HRMEC增殖率低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HRMEC凋亡率及IL-6、IL-1β含量均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。LncRNA MEG3過(guò)表達(dá)組HRMEC增殖率均高于模型組、共轉(zhuǎn)染組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；HRMEC凋亡率及IL-6、IL-1β含量均低于模型組、共轉(zhuǎn)染組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；miR-145-5p agomir組HRMEC增殖率均低于模型組、共轉(zhuǎn)染組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，HRMEC凋亡率及IL-6、IL-1β含量均高于模型組、共轉(zhuǎn)染組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；共轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組HRMEC增殖率、凋亡率及IL-6、IL-1β含量與模型組、共轉(zhuǎn)染組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)(圖2、圖3和表3)。

表2 各組大鼠玻璃體中EB含量、視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率及房水中炎癥因子IL-6、IL-1β含量

圖2 各組HRMEC增殖情況(×200) A：對(duì)照組；B：模型組；C：LncRNA MEG3過(guò)表達(dá)組；D：miR-145-5p agomir組；E：共轉(zhuǎn)染組；F：共轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組。

表3 各組HRMEC增殖率、凋亡率及炎癥因子IL-6、IL-1β含量

2.3 各組HRMEC、大鼠視網(wǎng)膜組織miR-145-5p及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況模型組HRMEC、大鼠視網(wǎng)膜組織miR-145-5p及Bax表達(dá)高于對(duì)照組，Bcl-2表達(dá)低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。LncRNA MEG3過(guò)表達(dá)組HRMEC、大鼠視網(wǎng)膜組織miR-145-5p及Bax表達(dá)均低于模型組、共轉(zhuǎn)染組，Bcl-2表達(dá)均高于模型組、共轉(zhuǎn)染組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；miR-145-5p agomir組HRMEC、大鼠視網(wǎng)膜組織miR-145-5p及Bax表達(dá)均高于模型組、共轉(zhuǎn)染組，Bcl-2表達(dá)均低于模型組、共轉(zhuǎn)染組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；共轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組HRMEC、大鼠視網(wǎng)膜組織miR-145-5p及Bax、Bcl-2表達(dá)與模型組、共轉(zhuǎn)染組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)(圖4和表4)。

圖4 各組HRMEC及大鼠視網(wǎng)膜組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況 A：對(duì)照組；B：模型組；C：LncRNA MEG3過(guò)表達(dá)組；D：miR-145-5p agomir組；E：共轉(zhuǎn)染組；F：共轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組。

表4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織和HRMEC miR-145-5p及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況

2.4 HRMEC中LncRNA MEG3對(duì)miR-145-5p的靶向調(diào)節(jié)作用通過(guò)在線預(yù)測(cè)軟件targetscan發(fā)現(xiàn)LncRNA MEG3與miR-145-5p之間有結(jié)合位點(diǎn)(圖5)。轉(zhuǎn)染野生型miR-145-5p報(bào)告質(zhì)粒+LncRNA MEG3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性(0.33±0.05)低于轉(zhuǎn)染野生型miR-145-5p報(bào)告質(zhì)粒+LncRNA MEG3空載質(zhì)粒組(1.02±0.21)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；轉(zhuǎn)染突變型miR-145-5p報(bào)告質(zhì)粒+LncRNA MEG3空載質(zhì)粒組細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性(0.98±0.14)與轉(zhuǎn)染突變型miR-145-5p報(bào)告質(zhì)粒+LncRNA MEG3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組(1.01±0.22)相比，轉(zhuǎn)染miR-145-5p無(wú)義序列+LncRNA MEG3空載質(zhì)粒組細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性(0.99±0.16)與轉(zhuǎn)染miR-145-5p無(wú)義序列+LncRNA MEG3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組(1.03±0.24)相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。

圖5 預(yù)測(cè)軟件targetscan顯示的LncRNA MEG3和miR-145-5p之間結(jié)合位點(diǎn)

3 討論

DR是糖尿病引發(fā)的最常見(jiàn)眼部并發(fā)癥，對(duì)患者日常工作和生活造成很大不便，防治DR是糖尿病與眼底病領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[12-13]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)腹腔注射鏈脲佐菌素建立大鼠DR模型，以25 mmol·L-1葡萄糖誘導(dǎo)DR細(xì)胞模型，結(jié)果顯示，鏈脲佐菌素可造成大鼠高血糖，促使炎癥因子IL-6、IL-1β表達(dá)，引發(fā)炎癥，導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，視網(wǎng)膜血管屏障功能受損，另外高糖可通過(guò)誘導(dǎo)炎癥因子IL-6、IL-1β過(guò)表達(dá)而引發(fā)HRMEC細(xì)胞炎癥，抑制其增殖，并促進(jìn)其凋亡。這表明DR大鼠及細(xì)胞模型構(gòu)建成功。

研究顯示，LncRNA MEG3是介導(dǎo)DR發(fā)生發(fā)展的重要RNA分子，在DR患者血清中，LncRNA MEG3水平顯著降低[14]；過(guò)表達(dá)MEG3可抑制DR大鼠模型和細(xì)胞模型內(nèi)皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，緩解視網(wǎng)膜病變[15]。本實(shí)驗(yàn)以LncRNA MEG3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒干預(yù)處理DR大鼠模型和細(xì)胞模型，可降低炎癥因子IL-6、IL-1β表達(dá)，抑制炎癥發(fā)生及進(jìn)展，減輕高糖導(dǎo)致的HRMEC及大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，修復(fù)DR大鼠視網(wǎng)膜血管屏障功能。這表明過(guò)表達(dá)LncRNA MEG3可抑制DR大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，再次證實(shí)了其對(duì)DR可起到防治作用。

DR發(fā)病原因復(fù)雜，高糖引發(fā)的炎癥是導(dǎo)致DR患者視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的主要病理因素，減輕炎癥、抑制視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是防治DR的重要手段[16-17]。miR-145-5p可介導(dǎo)炎癥因子誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，抑制炎癥因子表達(dá)，阻斷炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，顯著減輕脂多糖引發(fā)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，從而改善繼發(fā)性脊髓損傷[18-19]，還可保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞免受高糖誘導(dǎo)的炎癥損傷[8]。而LncRNA MEG3可通過(guò)靶向抑制miR-145-5p表達(dá)，影響結(jié)核桿菌感染的巨噬細(xì)胞的生物學(xué)活性[20]，因而推測(cè)下調(diào)miR-145-5p表達(dá)可能是過(guò)表達(dá)MEG3治療DR的分子機(jī)制。本研究以miR-145-5p agomir上調(diào)DR大鼠及細(xì)胞模型中miR-145-5p的表達(dá)，可增強(qiáng)炎癥因子表達(dá)，放大炎癥反應(yīng)，促進(jìn)HRMEC及視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，加重DR大鼠視網(wǎng)膜血管屏障功能損傷，而過(guò)表達(dá)LncRNA MEG3可靶向下調(diào)HRMEC中miR-145-5p表達(dá)，并抑制DR大鼠視網(wǎng)膜組織過(guò)表達(dá)miR-145-5p。另外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-145-5p agomir可減弱過(guò)表達(dá)LncRNA MEG3對(duì)炎癥因子表達(dá)的抑制作用，拮抗對(duì)炎癥的減輕功效，最終逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)LncRNA MEG3對(duì)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的改善作用。這表明miR-145-5p介導(dǎo)DR的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，LncRNA MEG3可通過(guò)靶向下調(diào)miR-145-5p抑制炎癥反應(yīng)，從而減輕DR大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

綜上所述，LncRNA MEG3可靶向下調(diào)HRMEC中miR-145-5p表達(dá)，從而降低高糖引發(fā)的炎癥因子表達(dá)，抑制視網(wǎng)膜組織炎癥及視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，改善血管通透性，進(jìn)而修復(fù)血-視網(wǎng)膜屏障功能。本研究為DR的防治提供了新的候選治療靶點(diǎn)，為DR臨床治療策略的改進(jìn)及發(fā)展提供了參考。