祝啟釗,謝曉磊,楊海霞,王晉,片慧芳,虞德兵

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,江蘇 南京 210095)

家禽卵巢卵泡按發(fā)育階段可大致分為等級(jí)前卵泡(prehierarchical follicle,PHF)和排卵前卵泡(preovulatory follicle,POF)[1],二者間形態(tài)和功能上有巨大差異。等級(jí)前卵泡生長(zhǎng)緩慢且容易發(fā)生閉鎖,只有被選擇成為排卵前卵泡之后,才可以免受閉鎖并繼續(xù)發(fā)育至成熟。其顆粒細(xì)胞也開(kāi)始分化,類固醇激素的合成逐漸增加[2]。由等級(jí)前卵泡發(fā)育為排卵前卵泡這一過(guò)程被稱為卵泡選擇,此過(guò)程約每天一次[3]。蛋雞卵泡的選擇由復(fù)雜的正向和負(fù)向選擇共同決定[4-5],使卵泡發(fā)育過(guò)程嚴(yán)格保持規(guī)律[6]。卵泡的選擇與卵泡刺激素(FSH)和卵泡刺激素受體(FSHR)的功能密切相關(guān)[7]。FSHR基因在卵巢(顆粒、卵泡膜和基質(zhì))組織中有選擇性表達(dá)[8-9],并且在6～8 mm卵泡中表達(dá)量最高[10]。這些證據(jù)都表明蛋雞卵泡的顆粒細(xì)胞在卵泡選擇的過(guò)程中起決定作用。

WNT(Wingless-type MMTV integration site family)配體蛋白屬于分泌型糖蛋白家族,WNT配體通過(guò)與附近細(xì)胞表面膜受體結(jié)合激活WNT通路,進(jìn)而通過(guò)β-catenin結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子并介導(dǎo)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[11],其下游靶基因CCND1、C-myc、BIRC5等[12]與細(xì)胞增殖、凋亡的功能密切相關(guān)。

WNT4通過(guò)影響雞顆粒細(xì)胞增殖與類固醇合成參與卵泡選擇的調(diào)控[3],但本課題組未發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示,等級(jí)前卵泡與排卵前卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)WNT4基因表達(dá)水平并無(wú)顯著差異,但是等級(jí)前卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)WNT6基因表達(dá)水平顯著高于排卵前卵泡顆粒細(xì)胞,提示W(wǎng)NT6可能參與蛋雞卵泡選擇。本研究檢測(cè)蛋雞各組織WNT6基因表達(dá),并檢測(cè)了WNT6對(duì)顆粒細(xì)胞增殖、類固醇合成以及卵泡選擇關(guān)鍵基因的影響,以探究WNT6在蛋雞卵泡選擇過(guò)程中的生物學(xué)功能與調(diào)控機(jī)制,并完善蛋雞卵泡選擇調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物處理與樣本采集

本試驗(yàn)所用300日齡海蘭褐蛋雞購(gòu)自南京盤滁機(jī)械化養(yǎng)雞場(chǎng),在采樣前3 d均連續(xù)正常產(chǎn)蛋,頸部放血法屠宰5只,采集卵泡、胸肌、腿肌、肝臟、心臟、卵巢、腸道、腎臟等組織樣本,裝入凍存管內(nèi)放入液氮速凍,隨后放入-80 ℃冰箱保存,用于RNA提取。

1.2 雞組織RNA的提取及WNT6基因表達(dá)水平的熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)

采用傳統(tǒng)Trizol試劑法(TaKaRa)提取總RNA,利用TaKaRa的反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)體系:1 000 ng 總RNA、反轉(zhuǎn)錄酶 4 μL,加去離子水至 20 μL;反應(yīng)條件:37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。合成cDNA之后用分光光度計(jì)檢測(cè)cDNA濃度,再使用ddH2O將其稀釋至400 ng·μL-1后-20 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù) GenBank中收錄的雞相關(guān)基因mRNA序列,用 Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參,利用ABM RT-qPCR試劑,按照李佳宜等[13]的方法測(cè)定蛋雞各組織內(nèi)WNT6基因表達(dá)水平。引物信息見(jiàn)表1。

表1 引物對(duì)序列信息Table 1 Primer pairs sequences information

1.3 雞WNT6基因過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與siRNA合成

根據(jù)NCBI發(fā)布的雞WNT6基因的mRNA序列(NM_001007594.2),利用 Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)全長(zhǎng) CDS 區(qū)的擴(kuò)增引物,引入EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切位點(diǎn),再連接到 pcDNA3.1真核表達(dá)載體上,并將其命名為pcDNA3.1-WNT6。構(gòu)建好的質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定無(wú)誤后,送擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)并合成3條WNT6-siRNA與1條作為陰性對(duì)照的NC-siRNA。siRNA命名與序列信息見(jiàn)表2。

表2 siRNA 序列Table 2 sequences of siRNA

1.4 雞卵泡顆粒細(xì)胞分離與體外培養(yǎng)

頸部放血屠宰300日齡產(chǎn)蛋母雞,用稀釋后的84消毒液浸泡母雞1～2 min,用剪刀剖開(kāi)腹腔,從右側(cè)完整取出卵巢放入37 ℃預(yù)熱的PBS中。依次取出單個(gè)卵泡放入盛有少量預(yù)熱PBS的培養(yǎng)皿中,用剪刀和鑷子將卵泡輕輕戳破一個(gè)小口,并沿著破口向一個(gè)方向?qū)⒙雅莩堕_(kāi)后“倒扣”在培養(yǎng)皿中,用PBS稍微浸泡,可見(jiàn)膜層與顆粒層有分開(kāi)趨勢(shì),用剪刀和鑷子將卵泡膜層和顆粒層完整分離。將分離出的顆粒層在培養(yǎng)皿中用PBS涮洗2遍,洗凈卵黃,在剪切板上剪碎后用移液器轉(zhuǎn)移至15 mL離心管,再加入2～3 mL 0.1%Ⅱ型膠原酶(Sigma),37 ℃水浴鍋消化10 mim左右。期間注意顛倒混勻,無(wú)肉眼可見(jiàn)塊狀后結(jié)束消化。消化結(jié)束后加入等體積冷的M199完全培養(yǎng)基(2～3 mL)停止消化,混勻,過(guò)濾后1 000 r·min-1離心 5 min,倒掉上清液。再用PBS洗凈2次后將顆粒細(xì)胞用含5%FBS(Gbico)和1%雙抗的M199培養(yǎng)基重懸,按照5×106mL-1的密度將原代顆粒細(xì)胞鋪入6孔或96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)16～24 h,待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行后續(xù)處理。

1.5 WNT6基因過(guò)表達(dá)載體與siRNA轉(zhuǎn)染雞顆粒細(xì)胞

當(dāng)6孔板內(nèi)顆粒細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)孔底60%時(shí),將舊培養(yǎng)基換為無(wú)血清培養(yǎng)基,使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑按照說(shuō)明書瞬時(shí)轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的雞顆粒細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6 h后,更換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染共 6組,分別是pcDNA3.1-WNT6、pcDNA3.1、WNT6-siRNA-229、WNT6-siRNA-489、WNT6-siRNA-759以及 NC-siRNA 組。每組3個(gè)重復(fù)孔。

1.6 卵泡刺激素(FSH)處理顆粒細(xì)胞

將體外培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞貼壁培養(yǎng)24 h后,吸去舊培養(yǎng)基,加入新的M199完全培養(yǎng)基后分為4組,添加梯度稀釋的FSH,各組FSH的最終含量分別0、1、10和100 ng·mL-1。每組3個(gè)重復(fù)孔。

1.7 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活力

轉(zhuǎn)染換液24 h后采用CCK-8試劑盒檢測(cè)各處理組與對(duì)照組細(xì)胞的活力。吸出舊培養(yǎng)基,用預(yù)熱過(guò)的PBS清洗2次,每孔加入90 μL完全培養(yǎng)基和10 μL CCK-8溶液;放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h;測(cè)定D450值。進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn),取平均值。

1.8 ELISA檢測(cè)類固醇激素孕酮(P4)含量

轉(zhuǎn)染換液24 h后,用移液器收集細(xì)胞培養(yǎng)液,1 000 r·min-1離心5 min后取上清液于-20 ℃保存,用于P4檢測(cè)。使用南京奧青公司的雞P4 ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中P4含量。

1.9 RT-qPCR檢測(cè)體外培養(yǎng)顆粒細(xì)胞基因的表達(dá)

將各組體外培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞按照Trizol試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA,再參照反轉(zhuǎn)錄說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA,qPCR檢測(cè)目的基因表達(dá)水平,通過(guò)內(nèi)參基因β-actin校正后,用2-ΔΔCT法計(jì)算各目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.10 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 海蘭蛋雞各組織WNT6 基因 mRNA表達(dá)特征

如圖1-A所示:WNT6 mRNA在F1—F5卵泡顆粒層組織中表達(dá)量顯著高于其他器官組織(P<0.05),WNT6在卵巢和肌肉等組織內(nèi)也有部分表達(dá),且在心、肝、腎、腸道等其他組織表達(dá)量很低。WNT6 mRNA在F1—F5排卵前卵泡膜層組織中表達(dá)量也最低。如圖1-B所示:WNT6在卵泡發(fā)育過(guò)程中表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì),且在小黃卵泡和F5時(shí)期具有最高表達(dá)水平(P<0.05),提示W(wǎng)NT6在卵泡發(fā)育與卵泡選擇過(guò)程中可能起重要作用,可作為潛在的卵泡選擇調(diào)控基因。

圖1 300日齡海蘭蛋雞各組織(A)和卵泡發(fā)育不同階段顆粒細(xì)胞(B)中WNT6表達(dá)規(guī)律Fig.1 The expression pattern of WNT6 in various tissues(A)and granulosa cells at different stages of follicular(B)of 300 day-old Hyline-brown layer A. K:腎臟Kindey;L:肝臟Liver;Li:大腸Large intestine;Lu:肺Lung;O:輸卵管Fallopian tube;Sp:脾臟Spleen;OV:卵巢Ovary;GC:卵泡顆粒層細(xì)胞Granulosa cells;TC:卵泡膜層細(xì)胞Follicular membranous cells;Bm:胸肌Breast muscle;Tm:腿肌Leg muscle;H:心臟Heart.B.SWF:小白卵泡Small white follicle;LWF:大白卵泡Large white follicle;SYF:小黃卵泡Small yellow follicle. F1—F5:直徑1～5 mm的小卵泡Small follicles with a diameter of 1-5 mm.

2.2 WNT6基因的過(guò)表達(dá)與敲減效率

構(gòu)建WNT6基因過(guò)表達(dá)載體,并設(shè)計(jì)了3條siRNA,用于對(duì)顆粒細(xì)胞WNT6的過(guò)表達(dá)和敲減處理。結(jié)果如圖2所示:過(guò)表達(dá)質(zhì)?？梢栽谒拗骷?xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá),顆粒細(xì)胞內(nèi)WNT6 mRNA表達(dá)水平提高了102.3倍(P<0.01);在3條siRNA中WNT6-siRNA-229和WNT6-siRNA-489敲減效率在50%以下(P<0.01),可以用于后續(xù)試驗(yàn)。其中,WNT6-siRNA-229的敲減效果最好。

圖2 WNT6的過(guò)表達(dá)與敲減效率的驗(yàn)證Fig.2 Verification of WNT6 overexpression and knockdown efficiency*P<0.05,**P<0.01. The same as follows.

2.3 WNT6對(duì)顆粒細(xì)胞增殖的影響

分別用過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和siRNA對(duì)顆粒細(xì)胞WNT6進(jìn)行過(guò)表達(dá)和敲減處理,然后使用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。結(jié)果如圖3所示:過(guò)表達(dá)WNT6后顆粒細(xì)胞增殖能力極顯著提高,增殖能力提升了40.6%(P<0.01);敲減WNT6后顆粒細(xì)胞增殖被抑制,增殖能力降低了31%以上(P<0.01)。綜上所述,在海蘭蛋雞卵泡發(fā)育過(guò)程中,WNT6是一個(gè)促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖的關(guān)鍵基因。

2.4 WNT6對(duì)類固醇激素P4合成及相關(guān)基因表達(dá)的影響

從圖4可知:過(guò)表達(dá)后顆粒細(xì)胞P4產(chǎn)量極顯著提高(P<0.01),而對(duì)WNT6進(jìn)行敲減之后顆粒細(xì)胞P4含量顯著減少(P<0.01)。過(guò)表達(dá)WNT6之后類固醇合成關(guān)鍵基因CYP11A1、CYP19A1、StAR和HSD3B1的表達(dá)水平均極顯著提高(P<0.01)。而WNT6敲減后顆粒細(xì)胞合成類固醇激素相關(guān)基因CYP11A1、CYP19A1和StAR表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。這些結(jié)果表明,WNT6可以通過(guò)提高類固醇合成關(guān)鍵基因的表達(dá)水平促進(jìn)顆粒細(xì)胞合成類固醇激素。

圖3 WNT6過(guò)表達(dá)與敲減對(duì)顆粒細(xì)胞增殖活性的影響Fig.3 Effects of WNT6 overexpression and knockdown on the proliferation of granulosa cells

圖4 WNT6過(guò)表達(dá)與敲減對(duì)顆粒細(xì)胞孕酮(P4)合成(A)及相關(guān)基因表達(dá)(B、C)的影響Fig.4 Effects of WNT6 overexpression and knockdown on progesterone(P4)synthesis(A) and related gene expression(B,C)in granulosa cells

圖5 WNT6過(guò)表達(dá)與敲減對(duì)FSHR基因表達(dá)水平的影響Fig.5 Effects of WNT6 overexpression and knockdown on FSHR gene expression level

2.5 WNT6對(duì)卵泡選擇關(guān)鍵基因FSHR的影響

從圖5可知:過(guò)表達(dá)WNT6極顯著提高顆粒細(xì)胞FSHR基因表達(dá)水平(P<0.01),敲減WNT6極顯著降低顆粒細(xì)胞FSHR基因表達(dá)水平(P<0.01)。結(jié)果提示,WNT6通過(guò)調(diào)控卵泡選擇關(guān)鍵基因FSHR的表達(dá)影響顆粒細(xì)胞增殖與功能。

圖6 卵泡刺激素(FSH)對(duì)WNT6(A)及WNT通路其他關(guān)鍵基因(B)表達(dá)的影響Fig.6 Effects of follicle stimulating hormone(FSH)on the expression level of WNT6(A) and other key genes(B)in the WNT pathway

2.6 FSH對(duì)WNT通路主要基因表達(dá)的調(diào)控

如圖6-A所示:FSH可以提高WNT6 mRNA表達(dá)水平,并且WNT6 mRNA表達(dá)水平隨FSH濃度升高而增加。如圖6-B所示,FSH還可以顯著提高LRP1表達(dá)水平(P<0.05),并極顯著降低FOXO1的表達(dá)水平(P<0.01)。此結(jié)果表明WNT6基因的表達(dá)呈劑量依賴性受FSH調(diào)控,FSH還可通過(guò)影響LRP1、FOXO1等基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控蛋雞卵泡顆粒細(xì)胞的WNT信號(hào)通路。

3 討論

WNT6首先在非洲爪蟾中被檢測(cè)到,此外在人、家禽、小鼠、果蠅和非洲文昌魚等物種[14]中陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。WNT信號(hào)通路參與多種生物學(xué)過(guò)程[15],最近的研究發(fā)現(xiàn)WNT信號(hào)通路對(duì)卵巢和卵泡發(fā)育非常重要[16]。本研究對(duì)WNT6在蛋雞組織表達(dá)模式進(jìn)行探究,發(fā)現(xiàn)WNT6在卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量極高,此外在肌肉、卵巢等組織內(nèi)也有一定表達(dá)量,但都遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于顆粒細(xì)胞表達(dá)水平。之前研究發(fā)現(xiàn)湖羊WNT6 mRNA主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜、卵巢、輸卵管[17]。雖然他們未對(duì)顆粒細(xì)胞內(nèi)WNT6表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),卻有其他研究證明大鼠顆粒細(xì)胞內(nèi)有WNT2和WNT4 mRNA表達(dá)[18]。本研究中還發(fā)現(xiàn)蛋雞卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)WNT6 mRNA 表達(dá)量隨卵泡發(fā)育階段的變化而改變,其變化趨勢(shì)與FSHR高度一致,都隨著卵泡發(fā)育階段呈先升高后降低趨勢(shì),且在卵泡選擇時(shí)期具有最高表達(dá)水平[19]?？傊?這些結(jié)果都提示W(wǎng)NT6與其所在的WNT信號(hào)通路參與卵泡選擇的調(diào)控。

在動(dòng)物胚胎發(fā)育的過(guò)程中,WNT通路主要與細(xì)胞的增殖及分化密切相關(guān)[20]。本研究發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)WNT6促進(jìn)雞卵泡顆粒細(xì)胞的增殖,而敲減WNT6抑制雞顆粒細(xì)胞的增殖。這與Wang[21]等的發(fā)現(xiàn)一致,他們發(fā)現(xiàn)WNT2敲除的顆粒細(xì)胞增殖受到抑制,PCNA顯著減少,而過(guò)表達(dá)WNT2促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖。Wang 等[22]的最新研究也發(fā)現(xiàn)抑制蛋雞顆粒細(xì)胞WNT信號(hào)會(huì)引起顆粒細(xì)胞的增殖抑制。WNT6對(duì)細(xì)胞增殖的影響也已有研究,在人結(jié)腸癌的發(fā)展的過(guò)程中,WNT6促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖,加速細(xì)胞周期[23]?？傊?本試驗(yàn)結(jié)果與前人結(jié)論一致,即WNT6促進(jìn)雞卵泡顆粒細(xì)胞增殖。類固醇激素是卵泡發(fā)育過(guò)程中的重要調(diào)控因素,P4主要由排卵前卵泡中顆粒細(xì)胞產(chǎn)生[24-25],由StAR、CYP11A1及3β-HSD三種關(guān)鍵酶將膽固醇在線粒體上轉(zhuǎn)運(yùn)催化合成的[26-27]。WNT4通過(guò)調(diào)節(jié)類固醇生成酶基因StAR、CYP19A1和CYP11A1表達(dá)促進(jìn)雞卵泡顆粒細(xì)胞合成類固醇激素[3,28]。本研究結(jié)果證明WNT6與其他WNT配體功能相似,提高雞顆粒細(xì)胞內(nèi)類固醇合成基因的表達(dá)并提高體外培養(yǎng)顆粒細(xì)胞內(nèi)P4合成量。

FSH可直接通過(guò)WNT信號(hào)通路影響相關(guān)基因的表達(dá)。Gupta等[29]發(fā)現(xiàn),經(jīng)FSH處理后,體外培養(yǎng)的牛卵巢顆粒細(xì)胞內(nèi),其WNT信號(hào)通路中的FZD2、CTNNB1等基因的表達(dá)量顯著上調(diào)。此外,目前已知FSH可以通過(guò)PI3K/Akt途徑和PKA途徑激活WNT通路[30-32]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,FSH以濃度依賴性提高體外培養(yǎng)的雞卵泡顆粒細(xì)胞的WNT6 mRNA表達(dá)水平,并顯著影響LRP1和FOXO1基因表達(dá)水平。另外,WNT信號(hào)可協(xié)同F(xiàn)SH調(diào)控卵泡發(fā)育過(guò)程。有研究發(fā)現(xiàn)抑制經(jīng)典WNT信號(hào)通路可抑制顆粒細(xì)胞對(duì)FSH的反應(yīng)性[16]。本研究發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)WNT6提高顆粒細(xì)胞內(nèi)FSHR基因表達(dá)水平,而敲減WNT6則降低FSHR基因表達(dá)水平,表明WNT6可以提高顆粒細(xì)胞對(duì)FSH的反應(yīng)性?？傊?這些結(jié)果證明WNT信號(hào)從多個(gè)方面介導(dǎo)FSH對(duì)卵泡發(fā)育的調(diào)控。WNT6可以通過(guò)促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖與P4合成促進(jìn)卵泡發(fā)育,并通過(guò)提高顆粒細(xì)胞FSHR表達(dá)水平提高顆粒細(xì)胞對(duì)FSH的反應(yīng)性,協(xié)同F(xiàn)SH參與卵泡選擇調(diào)控。