侯云 周寶琴 楊忠思

采供血機(jī)構(gòu)一直在保證血液安全的前提下大力發(fā)展獻(xiàn)血者隊伍，探討假反應(yīng)性獻(xiàn)血者歸隊策略是目前關(guān)注的熱點問題。采供血機(jī)構(gòu)對酶聯(lián)免疫吸附試驗（簡稱酶免）呈反應(yīng)性的獻(xiàn)血者歸隊研究及政策制定已較成熟，但是對核酸檢測反應(yīng)性獻(xiàn)血者的歸隊策略還存在分歧?！斗磻?yīng)性獻(xiàn)學(xué)者屏蔽與歸隊指南》針對核酸反應(yīng)性獻(xiàn)血者歸隊策略內(nèi)容為：（1）2013 版為核酸檢測結(jié)果必須是無反應(yīng)性的，獻(xiàn)血者可進(jìn)入歸隊流程。（2）2015 版調(diào)整為核酸三項聯(lián)檢結(jié)果反應(yīng)性而鑒別試驗陰性，獻(xiàn)血者可進(jìn)入歸隊流程。（3）2019 版調(diào)整為核酸檢測結(jié)果必須是無反應(yīng)性的，即核酸三項聯(lián)檢反應(yīng)性而鑒別試驗陰/ 陽性，獻(xiàn)血者都不進(jìn)入歸隊流程。因此本文針對核酸歸隊策略調(diào)整的關(guān)鍵點，以綜述形式對核酸檢測反應(yīng)性結(jié)果不一致情況進(jìn)行分析，探討核酸檢測假反應(yīng)性結(jié)果存在的可能，為采供血機(jī)構(gòu)采取相應(yīng)的確證和歸隊方案提供新的思路。

1 核酸反應(yīng)性結(jié)果初檢/再檢不一致情況的研究

2015 年核酸檢測技術(shù)（nucleic acid testing，NAT）在血站全面開展，出現(xiàn)一定數(shù)量的酶免陰性核酸反應(yīng)性的獻(xiàn)血者，但是這些獻(xiàn)血者的核酸反應(yīng)性結(jié)果重復(fù)率偏低，即單人份檢測系統(tǒng)聯(lián)檢結(jié)果反應(yīng)性會出現(xiàn)鑒別結(jié)果陰性；混樣系統(tǒng)初檢反應(yīng)性池（pool），拆分結(jié)果為陰性。那么針對這些核酸反應(yīng)性結(jié)果初檢/再檢不一致的情況，怎樣確證標(biāo)本的真假陽性？該問題是目前采供血機(jī)構(gòu)所面臨的共同挑戰(zhàn)，亟待解決。

1.1 核酸單人份系統(tǒng)和混樣系統(tǒng)判定反應(yīng)性結(jié)果的對比研究

目前核酸檢測系統(tǒng)分為單人份系統(tǒng)和混樣系統(tǒng)。單人份系統(tǒng)是初檢為單個標(biāo)本在一管內(nèi)同時檢測乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）和 艾滋病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的核酸，當(dāng)聯(lián)合檢測結(jié)果陰性時，則標(biāo)本直接判定為陰性；而當(dāng)聯(lián)合檢測有反應(yīng)性時，則需要進(jìn)行鑒別試驗，進(jìn)而對該標(biāo)本分別進(jìn)行 HBV、HCV 和HIV 單項核酸檢測，以明確標(biāo)本中是哪種病原體核酸陽性。在核酸單人份系統(tǒng)中，常出現(xiàn)聯(lián)合檢測HBV、HCV 和HIV 有反應(yīng)性而鑒別試驗陰性的標(biāo)本，也稱為核酸檢測不確定標(biāo)本。該類標(biāo)本在核酸單人份系統(tǒng)中占有較高的比例，據(jù)深圳市中心血站統(tǒng)計單項NAT 反應(yīng)性標(biāo)本的鑒別陽性率為24.76%，即檢測不確定標(biāo)本率高達(dá)75.24%[1]。青島市中心血站2017—2020 年應(yīng)用基立福核酸檢測系統(tǒng)檢測不確定標(biāo)本率為59.14%。核酸單人份系統(tǒng)如此高的不確定標(biāo)本率，說明有多數(shù)的標(biāo)本是因為鑒別試驗陰性聯(lián)檢反應(yīng)性而判定為不合格。這類標(biāo)本無法確定究竟是哪種病原體核酸陽性或者是否由實驗的假陽性反應(yīng)引起，其血液直接報廢，獻(xiàn)血者資格被屏蔽[2]。

混樣系統(tǒng)是多個標(biāo)本混在一個pool 中檢測，如果初檢混樣pool 為反應(yīng)性時，再進(jìn)行多個標(biāo)本的拆分檢測，如拆分有反應(yīng)性標(biāo)本即判定為該標(biāo)本反應(yīng)性；若拆分結(jié)果陰性，則所有標(biāo)本判為陰性。在核酸混樣系統(tǒng)中，會出現(xiàn)初檢混樣pool 為反應(yīng)性，拆分結(jié)果陰性。雖然混樣pool 中標(biāo)本判定結(jié)果為陰性，但是無法確定真陰性的可能，會有漏檢的風(fēng)險。青島市中心血站統(tǒng)計羅氏混樣系統(tǒng)上出現(xiàn)46.94%的初檢反應(yīng)性pool，但拆分為陰性的現(xiàn)象，依據(jù)現(xiàn)行判定原則是血液合格，可以放行。但有數(shù)據(jù)顯示混檢陽性再拆分陰性的標(biāo)本，感染 HBV 的風(fēng)險高于合格獻(xiàn)血者組成的對照組，說明對混檢陽性再拆分陰性的標(biāo)本中存在的風(fēng)險要重視[3]。

1.2 核酸反應(yīng)性結(jié)果初檢/再檢不一致的原因

核酸單人份系統(tǒng)和混樣系統(tǒng)，在初始檢測和再次檢測實驗中，一致的標(biāo)本實驗者直接判定為NAT 反應(yīng)性，血液報廢，獻(xiàn)血者永久屏蔽。而對于初始檢測反應(yīng)性，再次檢測，無論鑒別實驗還是拆分實驗非反應(yīng)性的，需要實驗者進(jìn)行確證，其原因多為以下幾方面。

（1）隱匿性乙型肝炎病毒感染（occult HBV infection，OBI）的存在。OBI 是血液中乙肝表面抗原陰性而NAT 檢測陽性的HBV 感染特殊類型，當(dāng)病毒濃度極低時（病毒顆粒在血漿中分布不均勻），可以完全檢出的概率較低，因此進(jìn)行NAT 檢測時，相較于窗口期標(biāo)本，隱匿性感染標(biāo)本可能更容易漏檢。隨著NAT 的普及，越來越多的OBI 被檢出，國內(nèi)許多地區(qū)獻(xiàn)血者都有較高的OBI 感染率，感染率接近1‰或更高[4-5]。廣東地區(qū)獻(xiàn)血者OBI 陽性率可達(dá)1.5‰[6]，因此每年淘汰的獻(xiàn)血者達(dá)上百人。青島市中心血站將部分基立福初檢反應(yīng)性標(biāo)本送臨檢中心進(jìn)行 HBV 定量檢測， 聯(lián)檢反應(yīng)性鑒別陰性的標(biāo)本中18.5%可以被定量系統(tǒng)檢測出HBV 核酸的存在。因此核酸初檢/再檢不一致檢測結(jié)果可能是標(biāo)本中存在低濃度的病毒。

（2）獻(xiàn)血時的NAT 檢測為假陽性。這種情況在核酸單人份系統(tǒng)較為多見。該系統(tǒng)只要初檢有反應(yīng)性即判為不合格，往往假陽性較高，假陽性率可達(dá)21.6%[7]。廣州市中心血站對隨機(jī)抽選的391 例核酸反應(yīng)性獻(xiàn)血者標(biāo)本進(jìn)行二次檢測，76.99%標(biāo)本為非反應(yīng)性；非反應(yīng)性標(biāo)本在羅氏進(jìn)行再次確認(rèn)，98.34%標(biāo)本仍為陰性；由此推斷這部分標(biāo)本在首次 NAT 聯(lián)檢時可能出現(xiàn)假反應(yīng)。大連核酸檢測假陽性率占初次反應(yīng)性標(biāo)本 50.3%[8]?；⒏Ｏ到y(tǒng)數(shù)據(jù)表明酶免陰性核酸聯(lián)檢反應(yīng)性的標(biāo)本有24%～28%的假反應(yīng)性標(biāo)本。

2 核酸假反應(yīng)性獻(xiàn)血者確證和歸隊方案的研究

2.1 核酸單人份檢測系統(tǒng)不確定標(biāo)本的確證研究

（1）首選對該類標(biāo)本可以進(jìn)行2 次聯(lián)檢和1 次鑒別的實驗流程，≥1 次反應(yīng)性結(jié)果判定為不合格。該流程操作簡單，可行性高，只需注意留取足量的標(biāo)本。

（2）應(yīng)用超高速離心技術(shù)，同時與靶向病毒基因區(qū)段符合的高敏感度巢式PCR 檢測相結(jié)合，對標(biāo)本進(jìn)行病毒核酸的確認(rèn)。該方案技術(shù)復(fù)雜，要求配套設(shè)備多，多數(shù)需要公司配合完成。大連市血液中心應(yīng)用兩流程對該類標(biāo)本進(jìn)行確認(rèn)，并比較2 個流程的優(yōu)劣，超離體系的 HBV 確認(rèn)能力明顯好于推薦流程[9]。（3）實驗者可對該類獻(xiàn)血者進(jìn)行追蹤，至少追蹤2 次，間隔6 個月，通過不同的核酸檢測系統(tǒng)進(jìn)行確證，≥1 次反應(yīng)性結(jié)果都判定為不合格；同時補(bǔ)充乙肝核心抗體（抗-HBc）或乙肝“2 對半”檢測，如抗-HBc 陽性，則可以初步判斷為OBI。安徽省血液中心完成28 名酶免陰性核酸陽性獻(xiàn)血者的2 次追蹤，所有隨訪標(biāo)本分別在獻(xiàn)血后3 個月在浩源、基立福或羅氏系統(tǒng)在核酸檢測系統(tǒng)進(jìn)行單人份核酸檢測，發(fā)現(xiàn)獻(xiàn)血者NAT 仍呈反應(yīng)性的占75%，可以歸隊的獻(xiàn)血者只有1 例（占3.57%）[10]。雖然歸隊比例遠(yuǎn)低于酶免單試劑反應(yīng)性歸隊比例[11]，但是同時也說明核酸反應(yīng)性獻(xiàn)血者存在假陽性的可能，且是核酸單人份系統(tǒng)的不確定標(biāo)本。

2.2 核酸混樣系統(tǒng)初檢/再檢不一致標(biāo)本確證研究。

（1）對于初次拆分非反應(yīng)性的標(biāo)本再進(jìn)行2 次拆分后進(jìn)行結(jié)果的判定，≥1 次反應(yīng)性結(jié)果即判為不合格，非反應(yīng)性結(jié)果則合格，這樣可以避免1 次拆分假陰性的漏檢。成都血液中心報道約在20 000 份標(biāo)本中出現(xiàn)1 例混檢反應(yīng)性初次拆分陰性，通過2 次拆分確認(rèn)的 HBV DNA 反應(yīng)性標(biāo)本[12]。臨檢中心中也建議對初次拆分非反應(yīng)性的標(biāo)本進(jìn)行2 次拆分后再予以放行的改進(jìn)型策略[13]。

（2）對于初次拆分無反應(yīng)性的標(biāo)本，可以應(yīng)用單人份系統(tǒng)對其進(jìn)行聯(lián)檢判定，若為反應(yīng)性結(jié)果再進(jìn)行鑒別試驗；≥1 次反應(yīng)性結(jié)果即判為不合格，非反應(yīng)性結(jié)果則合格。青島市中心血站[14]抽取2019 年拆分檢測非反應(yīng)性標(biāo)本120份（20 個混樣pool），通過凍存留樣后進(jìn)行聯(lián)合檢測全部為陰性；而2021 年抽取60 份（10 個混樣pool），混檢后平行進(jìn)行基立福檢測，有2 個混樣pool 出現(xiàn)反應(yīng)性標(biāo)本。推測采血管中標(biāo)本的儲存條件以及病毒載量低，是導(dǎo)致檢測結(jié)果重復(fù)性不佳的另一原因，確證檢測時需要重視和規(guī)避這些問題。

2.3 核酸假反應(yīng)性獻(xiàn)血者歸隊方案的研究

由于不同國家或地區(qū)的輸血相關(guān)病毒流行率不同，采供血機(jī)構(gòu)在保證血液安全的同時，采取不同的檢測策略和應(yīng)對措施，以最大程度地減少對假反應(yīng)性獻(xiàn)血者的屏蔽和淘汰。美國地區(qū)針對單人份檢測模式的NAT 反應(yīng)性血液標(biāo)本，無論該標(biāo)本是重復(fù)反應(yīng)性還是非重復(fù)反應(yīng)性，都判定為不合格[15]。對于初次NAT 重復(fù)檢測結(jié)果不一致的獻(xiàn)血者，6 個月后再次進(jìn)行 NAT 和酶免檢測，如果再檢結(jié)果均為陰性則該類獻(xiàn)血者可以歸隊。而澳大利亞等輸血相關(guān)病毒流行率較低的國家，采取的檢測策略是初次NAT 反應(yīng)性標(biāo)本再次復(fù)檢2 次，同時根據(jù)血清學(xué)（抗體等）試驗結(jié)果進(jìn)行判斷；對于復(fù)檢陰性、血清學(xué)陰性的標(biāo)本判定為合格，其血液運(yùn)行放行，獻(xiàn)血者可以歸隊[16]。

中國屬于病毒性肝炎高發(fā)地區(qū)，實驗室檢測數(shù)據(jù)顯示60%的人口既往接觸過HBV， 其中HBV 慢性攜帶者占比約為7.2%[17]；而無償獻(xiàn)血人群中OBI 的流行率約為0.04%，明顯高于低HBV 流行率地區(qū)[18-19]。目前國內(nèi)采供血機(jī)構(gòu)對于單人份檢測系統(tǒng)只要初次聯(lián)檢反應(yīng)性結(jié)果即予以報廢，獻(xiàn)血者屏蔽。該策略以最大程度降低輸血相關(guān)感染的風(fēng)險，但卻忽略了假陽性的存在，損失了部分獻(xiàn)血者的權(quán)益；對于混樣系統(tǒng)反應(yīng)性pool 中拆分1 次陰性即放行的策略，雖然符合試劑判定規(guī)則，卻低估了可能的漏檢風(fēng)險。國內(nèi)采供血機(jī)構(gòu)可在保證臨床供血安全的前提下，對于血液的處置判定依據(jù)初篩檢測結(jié)果，但對于獻(xiàn)血者資格判定應(yīng)考慮后續(xù)補(bǔ)充檢測的結(jié)果：（1）首選標(biāo)本重復(fù)檢測（自身系統(tǒng)或是其他核酸系統(tǒng)），建議進(jìn)行2 ～3 次的重復(fù)（最好取自血漿袋的標(biāo)本）。（2）補(bǔ)充抗-HBc 或乙肝“2 對半”檢測，如抗-HBc 陽性則可以初步判斷為OBI。（3）對獻(xiàn)血者進(jìn)行隨訪檢測，建議至少隨訪2 次以上，間隔3 個月。（4）補(bǔ)充血清學(xué)試驗和核酸定量分析，確定是窗口期感染、隱匿性感染、慢性感染、感染恢復(fù)期或假陽性，這樣可以給予獻(xiàn)血者較明確的結(jié)果解釋。

綜上所述，NAT 在血篩的應(yīng)用能最大程度地降低輸血相關(guān)病毒感染的風(fēng)險，但同時也增加了獻(xiàn)血人群陽性率的檢出。就意味著在國內(nèi)無償獻(xiàn)血人群中有更多的人檢測結(jié)果異常，不適合獻(xiàn)血。對于這部分人，尤其是固定獻(xiàn)血的人群，他們除了接受這樣的結(jié)果以外，更有必要得到準(zhǔn)確合理的解答。這就要求采供血機(jī)構(gòu)對核酸檢測結(jié)果的真?zhèn)芜M(jìn)行進(jìn)一步的確證，在合適的條件下允許假反應(yīng)性獻(xiàn)血者歸隊，避免血源的浪費(fèi)。同時對于反應(yīng)性的獻(xiàn)血者給予正確的指導(dǎo)建議，提高獻(xiàn)血者的回訪滿意度。另外，更重要的是將低水平病毒感染構(gòu)成的潛在輸血風(fēng)險降到最低，這也是采供血機(jī)構(gòu)無償獻(xiàn)血事業(yè)自始而終的責(zé)任和義務(wù)。