張 帥, 李超俠, 康 穎, 蘇宏華, 周福才, 景田興, 楊益眾

(揚州大學(xué)植物保護學(xué)院, 揚州 225009)

昆蟲經(jīng)過漫長的進化,為應(yīng)對環(huán)境的變化,在種之下產(chǎn)生了多型現(xiàn)象。一部分為發(fā)生在轉(zhuǎn)錄調(diào)控階段的非可遺傳的多型,比如飛蝗Locustamigratoria的群居型與散居型,棉蚜Aphisgossypii的黃色型和綠色型,褐飛虱Nilaparvatalugens的長翅型和短翅型[1]。另一部分為發(fā)生在染色體水平、可以遺傳的多型,比如草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda的玉米型和水稻型[2],豌豆蚜Acyrthosiphonpisum的綠色型和橘色型[3],棉蚜的黃瓜型和棉花型[4]。本文討論的多型為發(fā)生在染色體水平、可遺傳的昆蟲多型現(xiàn)象。

昆蟲的分型是比較寬泛的內(nèi)容,也是一個不斷更新的內(nèi)容,具有不確定性且分型方法多樣。以往昆蟲學(xué)中的分型直接按表型進行,比如按照取食寄主可以分成不同的寄主偏好型,甚至寄主專化型[4];按照地理區(qū)域分布分為不同的地理種群;按照個體某些表型分為不同的類型[1]。隨著分子生物學(xué)研究的深入,利用分子標記進行昆蟲分型的技術(shù)不斷發(fā)展。起初是在蛋白水平,如同工酶技術(shù)應(yīng)用于中華按蚊Anophelessinensis種下分型[5],后來的發(fā)展主要集中于核苷酸水平的分型技術(shù)。目前在昆蟲上用的分子標記類型包括隨機擴增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)標記、線粒體基因、SSR(simple sequence repeat)標記和SNP(single nucleotide polymorphisms)標記。

當前昆蟲分型具有比較強的目的性,并未在昆蟲學(xué)研究中普遍開展并建立統(tǒng)一的分型標準,僅在數(shù)種比較重要的昆蟲研究中得到應(yīng)用。如煙粉虱Bemisiatabaci各型(隱種)間在地理分布[6]、溫度耐受[7]、傳毒能力[8]、抗藥性[9]、種群交配競爭[10]等方面存在明顯差異,極大地促進了煙粉虱防治技術(shù)發(fā)展。

棉蚜是半翅目昆蟲,廣泛分布于世界各國。棉蚜寄主范圍較廣,據(jù)記載全世界棉蚜的寄主植物有76科600種[11]。生物測定結(jié)果表明蚜蟲種群在不同的寄主間出現(xiàn)明顯的分化,包括木槿型、木豆型、菊花型、黃瓜型、芋頭型、茄子型、棉花型和馬鈴薯型[12-15]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用,棉蚜的分型進入一個新的階段。利用微衛(wèi)星標記,Vanlerberghe-Masutti等[16]將21個棉蚜群體分為16個基因型,Carletto等[17]將棉蚜按照寄主適合度分為5種寄主類型。在棉蚜線粒體基因組序列的基礎(chǔ)上,Zhang等[4,18]分析了采自于我國華北地區(qū)不同時期9種寄主上1 046個棉蚜,結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們由57個單倍型構(gòu)成,其中有3種主要的單倍型,分別為Hap1(棉花上主要類型,屬于棉花型棉蚜),Hap3(黃瓜上主要類型,屬于黃瓜型棉蚜)和Hap4(棉花上次要類型,屬于棉花型棉蚜),三者占總數(shù)的86%。

在棉蚜防治過程中,其抗藥性是一個突出的問題,棉蚜先后對有機磷類、擬除蟲菊酯類、氨基甲酸酯類、新煙堿類農(nóng)藥產(chǎn)生抗性,而且抗性上升迅速[19]。1997年-1998年澳大利亞棉田的棉蚜對抗蚜威(>1 700倍)和氧化樂果(>56倍)產(chǎn)生較強的抗性[20]。2008年-2011年對美國田間棉蚜農(nóng)藥抗性系統(tǒng)監(jiān)測結(jié)果表明,棉蚜對噻蟲嗪具有高水平的抗性,48 h時抗性倍數(shù)可達562倍[21]。2004年-2008年,我國室內(nèi)棉蚜抗性品系對抗蚜威的抗性倍數(shù)從227倍上升到48 000倍[19]。棉蚜的抗藥性機制研究報道比較多,主要包括乙酰膽堿酯酶、細胞色素P450、鈉離子通道介導(dǎo)和煙堿乙酰膽堿受體介導(dǎo)等主要的抗性機制[19]。目前,P450在棉蚜不同生物型之間的分化情況尚不清楚。本文依據(jù)最新發(fā)布的棉蚜兩種單倍型的基因組數(shù)據(jù)[22],分析了已報道的與抗性相關(guān)的棉蚜P450基因在染色體分布、基因編碼、基因結(jié)構(gòu)等方面的異同,探討棉蚜相關(guān)研究中考慮生物型的重要性。

1 材料與方法

1.1 棉蚜P450的篩選

首先檢索Web of Science 數(shù)據(jù)庫中收錄的棉蚜P450的文獻。在文獻中提取關(guān)于棉蚜寄主、P450功能以及對應(yīng)基因的數(shù)據(jù)庫登錄信息。在NCBI數(shù)據(jù)庫下載相關(guān)序列,并對基因序列進行比對分析,合并重復(fù)序列,得到已進行功能研究的棉蚜P450。

1.2 序列生物信息分析

構(gòu)建單倍型Hap1和Hap3型棉蚜基因組本地數(shù)據(jù)庫,通過BLAST工具(BLAST+ 2.12.0)檢索文獻獲得的P450與基因組中對應(yīng)區(qū)域的信息,將獲得的P450與2種單倍型棉蚜基因組數(shù)據(jù)建立對應(yīng)關(guān)系。

根據(jù)BLAST結(jié)果，將棉蚜基因組數(shù)據(jù)中與文獻對應(yīng)的P450基因提取出,分析基因的串聯(lián)重復(fù)情況。根據(jù)基因組.gff3文件確定目標基因在染色體上的分布和外顯子、內(nèi)含子情況。使用MEGA 6.0 軟件,對來自于文獻的P450以及來自于基因組中的基因CDS區(qū)(coding sequence)序列和編碼的氨基酸序列進行比對,確定序列中的缺失、插入和取代等變異情況。WebLogo 3(http:∥weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)軟件用來構(gòu)建序列標識圖(sequence logo)。

根據(jù)棉蚜基因組數(shù)據(jù)(NCBI登錄號JAGTJE01和JAGTJF01),提取出P450基因序列,基因簇區(qū)域選擇該區(qū)域所有P450。使用在線版MAFFT version 7軟件(https:∥mafft.cbrc.jp/alignment/software/),參數(shù)選擇默認值,比對基因所在區(qū)域基因組序列在Hap1和Hap3型棉蚜中的缺失、插入、取代、復(fù)制和倒置等變異信息。使用CENSOR軟件工具(https:∥www.girinst.org/censor/index.php),選擇“昆蟲insects數(shù)據(jù)庫”,鑒定序列中轉(zhuǎn)座子類型。根據(jù)基因序列信息及轉(zhuǎn)座子信息,使用IBS在線工具(http:∥ibs.biocuckoo.org/online.php),繪制可視化的基因組結(jié)構(gòu)圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 已確定功能的棉蚜P450基因

通過文獻[23,36]數(shù)據(jù)檢索,獲得了20個分別能提高棉蚜對棉酚、單寧酸和2-十三烷酮等3種植物次生物質(zhì)和7種化學(xué)農(nóng)藥的耐受性的P450基因(表1)。文獻中所使用的棉蚜,有8個種群來自于棉田或用棉花葉片飼養(yǎng),3個種群來自于黃瓜田或用黃瓜葉片飼養(yǎng),1個采自于青椒并用黃瓜葉片飼養(yǎng)。

表1 從文獻中獲得的棉蚜P450及其相關(guān)信息

使用文獻中給出的基因序列編號,在NCBI中檢索到相關(guān)的基因序列。對序列整理,合并或刪除重復(fù)序列,獲得17個單一的棉蚜P450基因序列。這些序列分別屬于3個P450族(Clan),其中12個屬于CYP3族,4個屬于CYP2族,1個屬于CYP4族(表2)。

2.2 棉蚜P450在基因組上的分布

獲得的P450基因序列都能夠在Hap1和Hap3型棉蚜基因組數(shù)據(jù)中找到相應(yīng)序列。在Hap1型棉蚜中,17個P450基因全部定位在常染色體上,其中12個位于常染色體A1上,2個位于常染色體A2上,3個位于常染色體A3上。在Hap3型棉蚜中,有14個P450基因位于常染色體上,且基因在染色體上的位置與Hap1型棉蚜相同;而CYP6CY13和CYP6DA2(串聯(lián)基因)位于性染色體X上,不同于Hap1型棉蚜(常染色體A3);CYP6CY7基因未能組裝到染色體上(表2)。

2.3 棉蚜P450基因序列差異

在17個棉蚜P450基因中,有8個與Hap1型棉蚜基因組CDS區(qū)序列完全相同,與Hap1型棉蚜基因組序列差異最大的是CYP380C6(GenBank編號:MF471383)基因,一致性為97%;有5個與Hap3型棉蚜基因組CDS區(qū)序列完全相同,與Hap3型棉蚜基因組序列差異最大的是CYP380C6(GenBank編號:MF471383)基因,一致性為97%。這17個P450基因序列與采集棉蚜的寄主有關(guān),即來源于棉花的棉蚜的P450與Hap1型棉蚜(棉花上主要類型,屬于棉花型棉蚜)基因組序列的相似度高,來源于黃瓜的棉蚜的P450與Hap3型棉蚜(黃瓜上主要類型,屬于黃瓜型棉蚜)基因組序列的相似度高(表2)。

17個P450基因外顯子數(shù)量在Hap1和Hap3型棉蚜基因組之間不存在差異,但基因之間的外顯子數(shù)量存在明顯差異,外顯子數(shù)量在3～13之間。按P450族來分析,12個CYP3族基因的外顯子數(shù)量在3～6個之間,4個CYP2族基因之中有3個外顯子數(shù)量大于10個,1個CYP4族基因外顯子數(shù)量為8個(表2)。

在基因組層面,編碼P450基因的序列長度從1 805 bp到59 081 bp不等。僅有編碼CYP6DC1基因的序列長度在Hap1和Hap3型棉蚜中相同,8個P450基因在Hap1型棉蚜基因組中序列長度大于Hap3型棉蚜,8個P450基因在Hap3型棉蚜基因組中序列長度大于Hap1型棉蚜,編碼CYP6UN1基因的序列長度在兩型棉蚜中相差最多,達1 802 bp(表2)。

2.4 棉蚜P450基因存在串聯(lián)復(fù)制分布現(xiàn)象

17個P450基因中有10個位于染色體P450聚集分布區(qū),這10個基因中有8個為兩兩相鄰分布于染色體上,分別由一個寄主為棉花和一個寄主為黃瓜的P450基因構(gòu)成。成對串聯(lián)基因[CYP6CY19和CYP6CY13(c21368),CYP6CY4和CYP6CY14]所在區(qū)域序列在Hap1和Hap3型棉蚜基因組間保守性較高。序列線性比對結(jié)果顯示有的序列中存在較多重復(fù)片段,結(jié)合序列比對發(fā)現(xiàn)部分區(qū)域有80%的相似性(圖1a,b),文獻資料表明它們行使不同的解毒功能,功能出現(xiàn)分化(表1)。

圖1 棉蚜P450基因?qū)?yīng)基因組序列的比對分析

棉蚜P450基因分布區(qū)存在大量重復(fù)序列。在串聯(lián)重復(fù)基因中,有一對基因(CYP6CY13和CYP6DA2)在Hap1和Hap3型棉蚜中分別位于A3和X染色體之上(表2),進一步分析發(fā)現(xiàn),在組裝的Hap3型棉蚜基因組數(shù)據(jù)中,該段序列一端為高度重復(fù)的區(qū)域,且染色體組裝序列中有缺失序列(gap)存在,所以,這對基因處于Hap1和Hap3型棉蚜不同染色體的結(jié)果可能是由染色體的錯誤組裝造成的(圖1c,d)。

2.5 多個P450基因串聯(lián)重復(fù)區(qū)結(jié)構(gòu)分析

在獲得的17個P450基因中,有2個基因在不同文獻中同時命名為CYP380C6[27,34],都來自于棉花上的棉蚜,分別在棉蚜耐受螺蟲乙酯和溴氰蟲酰胺的過程中起作用。二者序列相似性為93%,分別比對到Hap1或Hap3型棉蚜基因組中同一個基因上,相似性分別為99%和97%。此基因位于P450基因簇區(qū)域,由5個串聯(lián)拷貝構(gòu)成,各個拷貝之間的相似性在79%～100%(圖2a,c)。Hap1和Hap3型棉蚜基因組序列中的這段P450基因簇區(qū)域存在一段長6 638 bp的差異片段(圖2b)。與Repbase數(shù)據(jù)庫比對表明,差異片段包含一個長末端重復(fù)序列(long term relationship,LTR)家族的BEL1(between env and LTR)轉(zhuǎn)座子。該區(qū)域在各類蚜蟲中都存在重復(fù)拷貝現(xiàn)象,但不同種的P450基因的拷貝數(shù)間存在變異,豌豆蚜中有4個拷貝,桃蚜中有10個拷貝。而且P450基因發(fā)生倒位的現(xiàn)象比較普遍。除基因拷貝數(shù)存在差異外,該區(qū)域的轉(zhuǎn)座子也存在明顯變異(圖3)。

圖2 棉蚜中CYP380C6所在的P450串聯(lián)重復(fù)區(qū)序列分析

圖3 蚜蟲中多個P450基因串聯(lián)重復(fù)區(qū)序列結(jié)構(gòu)分析

3 討論

昆蟲種之下的分化在昆蟲學(xué)研究中越來越受到重視,這些分化不但涉及寄主的利用,還包括環(huán)境耐受能力、遷移能力、傳毒能力及對農(nóng)藥的耐受性等與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)密切相關(guān)的特性。種之下的分化往往通過食性等表觀的生物學(xué)特性進行區(qū)分,這種區(qū)分具有過程復(fù)雜和結(jié)果不穩(wěn)定的特點,通過分子生物學(xué)技術(shù)能夠建立快速、可靠的生物型鑒定體系。昆蟲生物型的分子鑒定體系常采用線粒體基因組序列和核基因序列,往往需要利用多個分子標記位點,并結(jié)合生物學(xué)表型來建立昆蟲的生物型鑒定體系。目前,昆蟲的生物型往往是按照研究目的進行人為的劃分,缺少統(tǒng)一的標準。比如,對于蚜蟲的生物型,有按照寄主利用范圍進行劃分,有按照某種寄主的抗性基因類型進行劃分,劃分時選擇的分子標記基因不同。根據(jù)麥雙尾蚜Diuraphisnoxia對不同小麥抗性品系的適應(yīng)能力,將其分為11個生物型。根據(jù)大豆蚜Aphisglycines突破大豆抗蚜基因的能力區(qū)分不同的生物型[37]。根據(jù)棉蚜的微衛(wèi)星序列將棉蚜分為不同的生物型,它們對不同葫蘆科植物適應(yīng)能力和傳播病毒的能力存在差異[38]。

可以看出,蚜蟲不同生物型之間存在表型上的差異,這種差異大多數(shù)是基因組層面變異的反應(yīng)。在桃蚜Myzuspersicae兩個生物型基因組間,有大約 30%的直系同源基因為生物型特異性缺失/重排[39]。對超過110個桃蚜品系基因組重測序結(jié)果表明,在基因組上平均9 bp序列存在一個變異位點[40]。全基因組SNP分析表明,在86個禾谷縊管蚜Rhopalosiphumpadi英國種群中,鑒定出4 802個SNP位點,南北種群出現(xiàn)明顯的遺傳分化[41]。大豆蚜的全基因組測序也顯示生物型間存在明顯的遺傳變異,各生物型間的SNP位點數(shù)量為167 249～217 750個,各生物型間含有比較顯著的氨基酸突變基因在283～939個[42]。

棉蚜也稱瓜蚜,是棉花和瓜類上的重要害蟲。由于棉蚜對農(nóng)藥的抗性問題突出,所以也是生產(chǎn)上難以控制的害蟲之一,是重點研究的害蟲。雖然很早就發(fā)現(xiàn)棉蚜種群對寄主的利用能力存在分化,也通過生物測定和分子生物學(xué)技術(shù)將棉蚜劃分為多個生物型,但生物型的研究僅停留在寄主利用方面,在農(nóng)藥抗性機制研究中很少考慮其生物型分化的問題。在昆蟲中,多拷貝旁系同源基因多屬于CYP3和CYP4族,并經(jīng)常在染色體上成簇排列,大部分參與次生物質(zhì)代謝和殺蟲劑抗性的P450基因?qū)儆谶@類基因[43]。P450是棉蚜抗藥性研究中的主要靶標之一,在已報道的具有次生物質(zhì)代謝或殺蟲劑抗性的17個基因中,有12個屬于CYP3族,有10個基因在染色體上處于P450成簇分布區(qū)。

由于蚜蟲為全著絲粒染色體,其基因組的變異是很常見現(xiàn)象,如蚜蟲基因組重排往往導(dǎo)致群體間對殺蟲劑的代謝反應(yīng)出現(xiàn)差異[44]。比對P450基因在Hap1和Hap3型棉蚜基因組上的分布及結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),無論是序列的長度、堿基位點還是所處區(qū)域的基因構(gòu)成都存在變異情況。一個比較明顯的現(xiàn)象就是盡管串聯(lián)重復(fù)的P450基因間相似性很高,但它們的功能出現(xiàn)分化,在以棉花和黃瓜為寄主的棉蚜中起解毒代謝作用的基因單元不同[26, 32]。P450基因在不同生物型棉蚜間的分化提示我們在研究其功能時,需要針對不同生物型棉蚜進行區(qū)別研究,有利于揭示棉蚜抗性發(fā)展的分子機制。

4 結(jié)論

棉蚜是種內(nèi)分化程度較高的昆蟲,出現(xiàn)了多種生物型。通過分析棉蚜重要解毒基因P450在兩種生物型棉蚜基因組中的分化情況,發(fā)現(xiàn)多個P450基因在Hap1和Hap3型棉蚜基因組水平發(fā)生分化。這種分化可能會導(dǎo)致基因的表達調(diào)控和生物學(xué)功能發(fā)生變異,從而使兩種棉蚜對農(nóng)藥產(chǎn)生耐受性的過程和機制也出現(xiàn)分化。以上結(jié)果提示我們在進行棉蚜抗藥性及其他方面的研究過程中,需要考慮到棉蚜生物型的分化,針對不同生物型棉蚜分別開展研究。