骨質(zhì)疏松兔顱骨骨缺損模型的建立

田彬 劉長松 程為

骨質(zhì)疏松癥是以骨組織微結(jié)構(gòu)破壞和骨量減少為主要病理特征的一種全身性骨骼疾病［1］。骨質(zhì)疏松癥患者的牙槽骨局部表現(xiàn)為骨密度減低、骨愈合減緩和骨吸收增加，因此易于發(fā)生骨組織缺損。我國正在逐步步入老齡化社會，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率逐年提高［2，3］。大量的口腔種植相對禁忌的骨質(zhì)疏松癥患者在缺牙局部同時存在骨組織的缺損，因此給口腔種植帶來極大的挑戰(zhàn)，很多學(xué)者已經(jīng)開始著手這方面的研究。因此，建立一個可靠、可行且相對簡單的骨質(zhì)疏松癥的骨缺損動物模型來進行相關(guān)的前期實驗研究具有至關(guān)重要的意義［4］。我們的研究建立了骨質(zhì)疏松兔的顱骨缺損動物模型，從而為深入研究骨質(zhì)疏松癥患者的骨增量的研究奠定基礎(chǔ)。

1.材料與方法

1.1 實驗動物 48 只雌性5月齡，體重（2.5±0.25）kg 的普通級新西蘭大白兔，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院實驗動物倫理委員會審查通過實驗動物的使用（倫理號：KQYY-201803-002）。

1.2 骨質(zhì)疏松造模實驗 將所有動物隨機分為2組（A 組，B 組），每組24只動物。再將每組隨機分成4 組，每組6 只動物。其中A 組為：A1、A2、A3、A4，B 組為：B1、B2、B3、B4。速新眠II 0.2 ml/kg和舒泰10 mg/kg 混合后肌肉注射，全身麻醉實驗兔。沿腹中線做5 cm 縱行切口切開腹腔。（1）A 組（造模組）：結(jié)扎雙側(cè)卵巢及附件后摘除，關(guān)閉創(chuàng)口。（圖1）（2）B 組（對照組）：找到卵巢后切取鄰近的等量脂肪組織即縫合創(chuàng)口。

圖1 卵巢切除手術(shù)圖

1.3 驗證骨質(zhì)疏松造模實驗 卵巢切除手術(shù)后3個月將A1及B1組實驗動物全部處死，取股骨頭。股骨頭通過微型計算機斷層掃描系統(tǒng)（microCT：Siemens Inveon Micro，德國）進行360°旋轉(zhuǎn)掃描，數(shù)據(jù)三維重建進行分析。標本掃描后，脫鈣處理，切片行HE染色。

1.4 顱骨缺損造模實驗 剩余6組動物（均為進行完上述手術(shù)的實驗組或?qū)φ战M），進行顱骨缺損造模。

實驗兔全身麻醉，于顱頂區(qū)制備圓形直徑5 mm 的全層骨缺損（諾瓦格MD20種植機）。骨缺損在顱骨的一側(cè)距離骨縫2 mm 的位置，硬腦膜完整（圖2）。骨缺損僅以新鮮出血形成的血凝塊充盈，縫合骨膜、皮下組織、皮膚。

圖2 顱骨缺損造模手術(shù)圖

分別在顱骨手術(shù)后4 周處死A2、B2 組，術(shù)后8周處死A3、B3組，術(shù)后12周處死A4、B4組。

動物處死前2周耳緣靜脈注射10 mg/ml鈣黃綠素注射液，動物處死前3、4 天注射10 mg/ml 茜素紅注射液。實驗兔處死后取顱骨標本，脫水，缺損區(qū)制備硬組織磨片。共聚焦顯微鏡（Olympus，日本）激發(fā)標本的鈣黃綠素的綠色熒光和茜素紅的紅色熒光，采集圖像。然后，甲苯胺藍染色標本。對標本進行組織形態(tài)學(xué)分析：新骨面積比（%)=(新形成骨面積，mm2)/(總面積，mm2)×100(%)。

1.5 統(tǒng)計分析 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以“均數(shù)±標準差”表示，統(tǒng)計方法采用ANOVA 單因素方差分析比較各組間及組內(nèi)差異，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 大體觀察 實驗兔術(shù)后傷口無紅腫、開裂及腹腔積膿感染等，愈合良好。A 組實驗動物卵巢摘除術(shù)后三個月時，毛色灰暗，體重增加明顯，與B組有顯著性差異（圖3）。

圖3 實驗兔體重統(tǒng)計圖（n=24，A：實驗組；B：對照組。NS：無統(tǒng)計學(xué)差異；*：P<0.05）

2.2 股骨頭MicroCT 圖重建 股骨Micro CT三維重建圖可見：A1 組股骨頭骨密度低于B1 組，皮質(zhì)骨厚度變薄，骨髓腔增大；松質(zhì)骨骨小梁稀疏、連接率降低、孔隙率增加。A1 組股骨頸骨皮質(zhì)厚度變薄，明顯薄于B1組。（圖4）

圖4 實驗兔卵巢切除3個月前、后股骨頭MicroCT重建圖

2.3 股骨頭HE 染色圖（圖5）B1 組（未切除卵巢組）骨皮質(zhì)較厚，厚度均勻、完整；松質(zhì)骨骨小梁豐富，粗大，排列密集，骨量豐富。

圖5 實驗兔股骨頭脫鈣切片HE染色圖

A1 組相比B1 組：骨皮質(zhì)明顯變薄，厚度不均勻；松質(zhì)骨骨小梁變細，稀疏，數(shù)目變少，部分斷裂消失；骨量明顯減少，髓腔擴大。

2.4 兔顱骨磨片的熒光檢測（圖6）激光共聚焦顯微鏡下，螯合鈣黃綠素的新生骨組織在特定波長激發(fā)光下呈現(xiàn)亮綠色，螯合茜素紅的新生骨組織呈現(xiàn)紅色。分別拍攝的兩種熒光條帶，合成圖像，讀取灰度值，通過Image J 圖像分析軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。

?Jane Yakowitz Bambauer，“The New Intrusion”，Notre Dame Law Review，88(1)，2012，pp．205 ～277．

圖6 顱骨骨組織缺損區(qū)域不脫鈣磨片熒光融合圖片及統(tǒng)計圖

顱骨術(shù)后4 周，骨缺損邊緣只有很少量的不規(guī)則新骨形成，骨缺損的中心區(qū)新生骨組織極少觀察到。兩組間沒有顯著性差異，均形成約5%的新生骨組織。

顱骨術(shù)后8 周，新骨形成量略有增加，骨質(zhì)疏松組A3組僅比4周時A2組新骨略多，對照組B3組缺損區(qū)邊緣向中心區(qū)不規(guī)則生長新生骨組織，A3組明顯少于B3組。

顱骨術(shù)后12 周，B4 組可觀察到島狀的新生骨組織位于骨缺損中心區(qū)，B4 新生骨幾乎達到10%，而A4 組僅向缺損中心區(qū)略有增多（新骨形成量約7%），兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.5 組織形態(tài)學(xué)檢測（甲苯胺藍染色）（圖7）甲苯胺藍染色的組織學(xué)切片與熒光標記圖片一致（圖7）。新生骨組織被染成藍色，主要位于骨缺損邊緣和骨組織表面，骨缺損的中心區(qū)也少量存在。

圖7 甲苯胺藍染色的骨組織缺損區(qū)域組織形態(tài)學(xué)圖片及統(tǒng)計圖

結(jié)果統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)顱骨缺損手術(shù)后4 周A2組與B2組無顯著性差異，術(shù)后8周、12周A3、A4組新骨形成量均顯著低于B3、B4 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3.討論

隨著我國老齡人口逐年增多，骨質(zhì)疏松作為一個社會性的健康問題，越來越受到醫(yī)學(xué)各專業(yè)的關(guān)注。缺牙同時伴隨牙槽骨骨缺損而需要種植牙的骨質(zhì)疏松癥患者日益增多，因此首先需要進行動物模型的相關(guān)研究。

3.1 骨質(zhì)疏松動物模型的建立 目前，小鼠、大鼠、兔、犬、羊、豬等均可用于建立骨質(zhì)疏松的動物模型，這些動物在實驗研究中各有優(yōu)缺點。大鼠［2，5］、小鼠體型較小，難以提供足夠的骨量進行骨重建方面的研究。犬雌激素分泌明顯低于人類，不適合做骨質(zhì)疏松動物模型。羊［6、7］為食草反芻動物，鈣、磷及維生素代謝與人相差較大。豬及靈長類動物生長周期長，實驗周期長，因此成本較高。兔飼養(yǎng)周期短，成熟快，骨骼改建短期內(nèi)就可觀察到骨組織改變，從而縮短實驗周期。兔體型中等；出生5-8個月性成熟后，骺板閉合，與人類相似［8］；兔的頜骨體積較小、骨量較少，骨缺損造模及骨重建手術(shù)不易觀察效果；頜骨骨重建手術(shù)后動物的活動及進食均影響實驗結(jié)果；胚胎學(xué)上兔顱骨與頜骨均通過膜內(nèi)成骨方式成骨，具有同源性，因此兔顱骨是研究頜骨重建與改建的首選材料［9］?；谝陨显颍覀冞x擇兔作為實驗動物。

3.2 骨質(zhì)疏松顱骨缺損模型的建立 伴隨著老齡化社會的到來，老齡人口越來越多，其中60歲以上人群骨質(zhì)疏松的發(fā)病率約為59.89%。這部分龐大數(shù)量的骨質(zhì)疏松老齡患者的牙齒缺失常常伴隨牙槽骨的缺損，成為目前臨床中的一大難題。因此急需建立骨缺損的骨質(zhì)疏松動物模型進行前期的研究。骨缺損的動物模型已經(jīng)相對成熟，但能否將其應(yīng)用于骨質(zhì)疏松的動物模型上，文獻中鮮有報道。

在胚胎學(xué)上，顱骨與頜骨具有同源性，均通過膜內(nèi)成骨方式成骨；解剖學(xué)上，二者形態(tài)、結(jié)構(gòu)相似，均由內(nèi)、外的皮質(zhì)骨夾中間的松質(zhì)骨構(gòu)成。因此將頜面部骨替代材料在兔顱骨缺損模型中檢測具有明顯的優(yōu)勢。當骨缺損的范圍超出了機體骨組織的再生極限——臨界骨缺損（critical size defects，CSD)，必須借助骨替代材料才能使骨缺損達到愈合［15］。對于兔顱骨的臨界骨缺損有多種理論［16］，不同的研究選用不同的形狀以及不同的尺寸作為臨界骨缺損進行骨組織工程學(xué)的研究,以往文獻中鮮有關(guān)于骨質(zhì)疏松兔的顱骨缺損的研究，我們經(jīng)過文獻考證及前期實驗，選擇了在兔顱骨制備直徑5 mm 圓形全層骨缺損進行實驗研究。本實驗的第二部分實驗結(jié)果（熒光照片及不脫鈣磨片甲苯胺藍組織學(xué)結(jié)果）可見，兔顱骨制作直徑5 mm的圓形骨缺損，骨質(zhì)疏松組術(shù)后骨缺損區(qū)域新骨形成率在4 周、8 周、12 周均低于對照組，尤其是8 周和12 周時明顯低于對照組；且所有骨質(zhì)疏松組骨缺損區(qū)域新骨形成均低于10%。由此可以得出，我們建立了骨質(zhì)疏松兔顱骨骨缺損模型，為后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ)。