博落回生物堿與Bt復(fù)配對(duì)小菜蛾的毒力增效作用

谷清義，聶淑君，馬潤(rùn)紅，申君

（信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院，河南，464000）

近年來(lái)，蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt），逐漸成為防治蔬菜害蟲(chóng)的主要微生物殺蟲(chóng)劑，特別是成為防治小菜蛾的常用生物殺蟲(chóng)劑。但長(zhǎng)期使用，小菜蛾的抗藥性逐漸增強(qiáng)。研究表明，美國(guó)馬薩諸塞州小菜蛾的初孵幼蟲(chóng)和2 齡幼蟲(chóng)抗性分別高達(dá)124 000 倍和63 100 倍；日本小菜蛾對(duì)Bt 的抗性也達(dá)到了12 600 倍；我國(guó)廣東、深圳、上海地區(qū)小菜蛾對(duì)Bt 的抗性分別為1 200、450、1 900 倍[1]。為解決Bt 的抗性問(wèn)題，延長(zhǎng)其使用壽命，開(kāi)發(fā)復(fù)配制劑成為有效手段。眾多科研學(xué)者開(kāi)展了Bt 與其他藥劑的復(fù)配研究，開(kāi)發(fā)出較多復(fù)配劑，但Bt 與博落回生物堿復(fù)配開(kāi)發(fā)復(fù)配劑的研究較少。博落回是罌粟科博落回屬多年生草本植物，博落回根莖中的生物堿有活血散瘀、祛風(fēng)消腫、殺蟲(chóng)等作用，其藥理學(xué)活性非常廣泛，尤以殺蟲(chóng)活性最為突出。因此，利用博落回生物堿與Bt 復(fù)配，以小菜蛾為靶標(biāo)，探討博落回生物堿對(duì)Bt 的增效作用，對(duì)減少Bt 用量、延緩小菜蛾對(duì)Bt 的抗藥性有積極的意義。在農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)防治方面，研究表明，博落回提取物中的原阿片堿對(duì)菜粉蝶拒食作用可達(dá)到73.5%，乙醇提取物分別對(duì)致倦庫(kù)蚊和四紋豆象的活性可分別達(dá)到86.20%和92.85%[2]。同時(shí)，前人研究結(jié)果表明，博落回生物堿對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)中的小菜蛾、菜青蟲(chóng)、蘋(píng)掌舟蛾、天幕毛蟲(chóng)、松毛蟲(chóng)等，對(duì)同翅目害蟲(chóng)如蚜蟲(chóng)、線蟲(chóng)和紅蜘蛛等具有一定的防效，對(duì)魚(yú)類(lèi)指環(huán)蟲(chóng)、梨木虱、釘螺等也具有一定的毒殺作用[3～6]。博落回生物堿源自植物，因具有低毒、低殘留、對(duì)非靶標(biāo)生物及環(huán)境安全的特點(diǎn)而越來(lái)越受到重視。

本試驗(yàn)利用博落回生物堿與Bt 按不同比例復(fù)配，測(cè)定對(duì)小菜蛾的毒力，篩選有增效作用的最佳配比。為減少Bt 用量、延緩其抗藥性，及為Bt 復(fù)配劑的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供理論支持和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

①供試?yán)ハx(chóng) 小菜蛾（Plutella xylostella）由信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院園藝學(xué)院的智能化養(yǎng)蟲(chóng)室人工繼代飼養(yǎng)，選取生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)一致且健康的3 齡幼蟲(chóng)供試。

②供試植物 博落回（Macleaya cordata）選自河南省信陽(yáng)市郊區(qū)未開(kāi)花的博落回的干燥莖葉，先用植物粉碎機(jī)粉碎，再置于研缽中將其研磨成粉，過(guò)16 目篩，密封置于陰暗處備用。

③供試藥劑 32 000 IU/mg Bt 可濕性粉劑，武漢科諾生物科技股份有限公司生產(chǎn)；博落回生物堿，自提。

1.2 主要儀器和方法

①主要儀器 植物粉碎機(jī)、電子天平（0.000 1 g）、DK-98-IIA 電熱恒溫水浴鍋、電熱鼓風(fēng)干燥箱、純水機(jī)。

②博落回生物堿的提取方法 酸性乙醇回流提取法[7]：精密稱(chēng)取一定量制備好的博落回莖葉干粉置于圓底燒瓶中，再加入30 倍量的90%乙醇（含0.12%硫酸），于80℃條件下回流提取2 h，抽濾，得膏狀物，干燥備用。

③供試藥劑的配制 博落回生物堿單劑：取一定量的博落回提取物，以丙酮（分析純）為溶劑，配制濃度為2 000、4 000、8 000、10 000、20 000 mg/L的供試藥液。

Bt 單劑：以0.1%表面活性劑（Triton X-100）為溶劑，配制濃度為12.5、25.0、50.0、100.0、1 000.0 的供試藥液。

④室內(nèi)毒力測(cè)定方法 葉片浸漬法[8]：將新鮮甘藍(lán)葉片用打孔器切制成形狀大小一致的圓形葉片，后將切制好的葉片浸泡在配制好的博落回生物堿單劑和Bt 單劑梯度藥液中10 s，并置于干燥處晾干，而后將晾干的葉片放入直徑為70 mm 的培養(yǎng)皿中，選取生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)一致、健康的3 齡小菜蛾幼蟲(chóng)接入培養(yǎng)皿，墊入紙巾并加蓋，置于智能化養(yǎng)蟲(chóng)室中培養(yǎng)，每藥液為1 個(gè)處理，共10 個(gè)處理，3次重復(fù)，每重復(fù)10 頭幼蟲(chóng)。分別于接種后24、48、72 h 觀察記錄小菜蛾幼蟲(chóng)死亡數(shù)量，計(jì)算死亡率以及矯正死亡率。

⑤最佳復(fù)配比例的篩選 采用交互測(cè)定法進(jìn)行最佳配比的篩選[9，10]。分別以博落回生物堿和Bt的LC50為基礎(chǔ)，設(shè)11 個(gè)濃度梯度及空白對(duì)照共12個(gè)處理進(jìn)行測(cè)定，其中各處理的單劑比例設(shè)置如表1（以博落回生物堿和Bt 的LC50為100%，進(jìn)行10等分，分別計(jì)算各組別2 種試劑的含量）。

表1 各處理單劑比例%

預(yù)期死亡率=A 藥劑LC50的實(shí)際死亡率×A 藥劑所占比例+B 藥劑LC50的實(shí)際死亡率×B 藥劑所占比例；毒效比率=實(shí)際死亡率/預(yù)期死亡率；毒效比率＞1.25 表現(xiàn)為具有增效作用，毒效比率＜0.75 表現(xiàn)存在拮抗作用，毒效比率在1 左右為相加作用。

⑥共毒系數(shù)的計(jì)算 選取采用葉片浸漬法測(cè)定毒效比率大于1.25 的配比開(kāi)展小菜蛾毒力試驗(yàn)，計(jì)算直線回歸方程和LC0。采用孫云沛法[11]計(jì)算混劑的共毒系數(shù)（CTC），共毒系數(shù)≥120 表現(xiàn)為具有增效作用；80＜共毒系數(shù)＜120，表現(xiàn)為相加作用，共毒系數(shù)≤80 表現(xiàn)為拮抗作用。

毒力指數(shù)=A 藥劑的LC50/B 藥劑的LC50×100。

混劑理論毒力指數(shù)=A 藥劑的毒力指數(shù)×混劑中A 藥劑的百分含量+B 藥劑的毒力指數(shù)×混劑中B 藥劑的百分含量。

共毒系數(shù)=混劑實(shí)際毒力指數(shù)/混劑理論毒力指數(shù)×100。

⑦田間藥效試驗(yàn) 參照《農(nóng)藥 田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則》（一）（GB/T 17980.13-2000）進(jìn)行[12]，在信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院校內(nèi)試驗(yàn)基地，供試作物為小白菜（膠研速生568，青島膠研種苗有限公司選育），2022年5月4日播種，生育期30 d。將篩選出的共毒系數(shù)最高的配比進(jìn)行田間試驗(yàn)，將該配比稀釋為200 倍液、300 倍液、400 倍液；博落回生物堿和Bt 單劑均稀釋為300 倍液，對(duì)照組（CK）施相同用量的清水，共計(jì)6 個(gè)處理，每處理設(shè)3 個(gè)重復(fù)，共18 個(gè)小區(qū)，每小區(qū)面積為15 m2，隨機(jī)區(qū)組排列。2022年5月25日施藥，采用3WBD-16 型手搖噴霧器均勻噴霧，每小區(qū)用藥量4 L。每小區(qū)5 點(diǎn)取樣，每點(diǎn)選3 株定點(diǎn)調(diào)查，施藥前調(diào)查蟲(chóng)口基數(shù)，藥后1、3、7 d 調(diào)查小菜蛾幼蟲(chóng)活蟲(chóng)數(shù)，計(jì)算蟲(chóng)口減退率和防效，并進(jìn)行差異顯著性分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用DPS 軟件計(jì)算致死中濃度LC50、相關(guān)系數(shù)、毒力回歸方程及差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單劑對(duì)小菜蛾的生物活性

博落回生物堿和Bt 單劑對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)的毒力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。由兩單劑的毒力回歸方程可分別得出Bt 的LC50值為68.73 mg/L、生物堿的LC50值為19 948.02 mg/L，表明Bt 對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)的毒力高于博落回生物堿。

表2 單劑毒力測(cè)定結(jié)果

2.2 殺蟲(chóng)劑混配增效配比的篩選

采用交互測(cè)定法，以各單劑的LC50近似值為100%進(jìn)行殺蟲(chóng)劑混配最佳比例的篩選，結(jié)果表明，博落回生物堿與Bt按不同比例混合后，毒效比均大于1.25，都具有明顯的增效作用。其中，當(dāng)博落回生物堿與Bt 以40∶60、30∶70、20∶80 的比例混配時(shí)，實(shí)際死亡率遠(yuǎn)高于預(yù)期死亡率，毒效比率分別為3.57、4.42、4.42，增效作用最為明顯（表3）。

2.3 復(fù)配劑的室內(nèi)毒力測(cè)定

根據(jù)表3，選擇博落回生物堿與Bt 復(fù)配比分別為40∶60、30∶70、20∶80 的3 組復(fù)配藥液進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定。結(jié)果表明，博落回生物堿+Bt （7 979.21+41.24）mg/L、博落回生物堿+Bt（5 984.41+48.11）mg/L、博落回生物堿+Bt（3 989.60+54.98）mg/L，3 種混配劑的共毒系數(shù)分別為124.89，142.65、166.28，均大于120，3 種混配劑具有明顯的增效作用。其中，二者混配比例為20∶80 時(shí)，共毒系數(shù)最高，為166.28。當(dāng)致死率處于50%時(shí)，3 組復(fù)配劑中的Bt 含量分別較單劑下降91.15%、86.72%、82.29%；博落回生物堿含量分別較單劑下降83.24%、85.33%、87.43%（表4）。

表3 博落回生物堿與Bt 混配最佳復(fù)配比的篩選

表4 博落回生物堿與Bt 混配對(duì)小菜蛾的室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果

2.4 增效復(fù)配劑的田間防效

復(fù)配劑的室內(nèi)毒力試驗(yàn)結(jié)果表明，博落回生物堿+Bt （3 989.60+54.98）mg/L 的共毒系數(shù)最高，為166.28，將該配比的復(fù)配劑分別稀釋為200、300、400 倍液，博落回生物堿單劑和Bt 單劑均稀釋至300 倍液進(jìn)行田間防效試驗(yàn)。由表5可知，藥后1 d，各處理的校正防效間無(wú)顯著差異，藥后3 d，復(fù)配劑200 倍液的校正防效與其他各處理間存在顯著差異，校正防效最高，為62.20%，藥后7 d，復(fù)配劑200 倍液的校正防效最高，為67.29%，除與Bt 300倍液差異不顯著外，顯著高于其他各處理。

表5 博落回生物堿與Bt（3 989.60+54.98）mg/L 復(fù)配劑對(duì)小菜蛾的田間防效

3 討論與結(jié)論

博落回生物堿是從藥用植物博落回中提取的生物堿的總稱(chēng)，主要有血根堿、白屈菜紅堿、原阿片堿，別隱品堿、博落回堿、黃蓮堿、小檗堿、沙明堿、普洛托品等14 種生物堿及其他化合物[13]。前人在研究博落回生物堿殺蟲(chóng)活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，博落回生物堿對(duì)菜青蟲(chóng)、蚜蟲(chóng)、小菜蛾、線蟲(chóng)、紅蜘蛛等農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)有一定的作用[14]。杜寧[15]研究了博落回生物堿對(duì)小菜蛾的胃毒作用，然而效果不顯著，但卻可以干擾小菜蛾的生長(zhǎng)與發(fā)育，與本試驗(yàn)結(jié)果相似；周瓊等[16]、張國(guó)洲等[17]利用博落回提取物生物堿分別研究了對(duì)小菜蛾4 齡幼蟲(chóng)和菜粉蝶的拒食活性，結(jié)果顯示拒食效果優(yōu)異。本試驗(yàn)結(jié)果表明，博落回生物堿與Bt 進(jìn)行混配后，復(fù)配藥劑的毒力顯著增強(qiáng)，在不同比例下，各組的實(shí)際死亡率遠(yuǎn)大于理論死亡率，均表現(xiàn)出明顯的增效作用，當(dāng)博落回生物堿與Bt 的復(fù)配比例為（3 989.60+54.98）mg/L 時(shí)，殺蟲(chóng)效果最好，其共毒系數(shù)達(dá)到166.28。同時(shí)，當(dāng)致死率處于50%時(shí)，復(fù)配比為40∶60、30∶70、20∶80 的3 組有增效作用的復(fù)配劑中，博落回生物堿和Bt 的用量較單劑均顯著下降，說(shuō)明博落回生物堿不但能增強(qiáng)Bt 的殺蟲(chóng)活性，還能降低Bt 的用量，對(duì)推進(jìn)農(nóng)藥減量增效政策的實(shí)施有積極意義。田間防效試驗(yàn)結(jié)果表明，博落回生物堿與Bt（3 989.60+54.98）mg/L 的200 倍液，藥后3 d 對(duì)小菜蛾的校正防效達(dá)到62.20%，顯著高于其他處理，藥后7 d 的校正防效為67.29%，相比藥后3 d 的防效有所升高，說(shuō)明該制劑的持效性較好。

目前，博落回生物堿作為殺蟲(chóng)劑并未大面積推廣應(yīng)用，可能與其殺蟲(chóng)效果不甚理想有關(guān)。本試驗(yàn)證明將博落回生物堿作為增效劑與Bt 進(jìn)行復(fù)配可以明顯提高Bt 對(duì)小菜蛾的殺蟲(chóng)效果，為開(kāi)發(fā)博落回生物堿與Bt 復(fù)配劑提供了數(shù)據(jù)支撐。