慢性乙型肝炎臨床治愈者的血清sPD-1和sPD-L1水平及臨床特點

譚 寧， 劉建湘， 亢 倩， 潘家莉， 韓一凡， 陳宏宇， 徐小元

北京大學第一醫(yī)院 消化內科， 北京 100034

目前慢性乙型肝炎(CHB)患者的抗病毒治療藥物主要是干擾素α和核苷(酸)類似物(NUC)[1-2]。一部分CHB患者適合干擾素治療，這些患者中不到10%可以發(fā)生持續(xù)的HBsAg轉陰[3]。由于聚乙二醇干擾素α的不良反應和禁忌證，還有一部分CHB患者接受長期的NUC抗病毒治療，只有很少的患者可以在長期抗病毒治療過程中達到HBsAg轉陰，HBeAg陽性初治患者在5～8年抗病毒治療后HBsAg轉陰率為10%～12%，而HBeAg陰性初治患者只有<1%～2%的患者發(fā)生HBsAg轉陰[4]。CHB患者停止治療后仍保持HBsAg陰性，抗-HBs陽性或陰性、HBV DNA檢測不到、肝臟生化指標(如ALT)正常、肝組織病變改善則為臨床治愈[5]。血清HBsAg轉陰后HBV共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)仍持續(xù)存在于肝，肝內仍存在低水平的HBV復制[6]，且存在HBV再激活和發(fā)生HCC的風險。有研究[7]統(tǒng)計，2946例CHB患者HBsAg消失后發(fā)生肝細胞癌的風險約為4.0%。

在發(fā)生慢性HBV感染者體內，CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞應答在質量和數(shù)量上發(fā)生變化[8]，甚至會出現(xiàn)CD8+T淋巴細胞應答的嚴重缺陷，病毒特異性CD8+T淋巴細胞通常無法分化為記憶性CD8+T淋巴細胞[9]，HBV特異性T淋巴細胞的檢出頻率顯著降低[10]。以上研究提示功能性T淋巴細胞持續(xù)暴露于高水平的病毒抗原引起T淋巴細胞耗竭[11]，這是病毒持續(xù)存在的主要促成因素[12]。PD-1是耗竭型T淋巴細胞主要表達的抑制性受體，研究[12]發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1信號通路可以調節(jié)慢性HBV感染者體內免疫細胞的功能。對CHB患者的縱向分析[13-14]顯示，PD-1和PD-L1表達水平在炎性發(fā)作期顯著升高，在炎癥消退時逐漸降低。因此，PD-1在CHB患者體內T淋巴細胞的表達情況可能具有重要意義。

近來，有研究[15]證明部分CHB患者病毒抗原水平下降對病毒特異性免疫功能恢復有利。本研究對CHB臨床治愈者外周血中T淋巴細胞PD-1表達情況進行分析，探究臨床治愈者體內病毒特異性免疫的恢復情況，并分析血清可溶性PD-1(soluble PD-1, sPD-1)和sPD-L1水平[16-17]與T淋巴細胞PD-1表達情況的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2022年1月—5月在本院感染疾病科門診診斷的CHB臨床治愈者。入選標準：(1)年齡18～70歲；(2)HBsAg陰性以及HBV DNA低于檢測值下限(20 IU/mL)；(3)抗病毒治療時間>6個月。出現(xiàn)以下任何一種情況即排除：(1)非HBV原因導致的慢性肝臟疾病，例如HCV感染、HDV感染、重度脂肪肝、酒精性肝病、自身免疫性肝病、藥物性肝損傷、遺傳代謝性肝病等；(2)HIV感染；(3)合并惡性腫瘤患者(不包括已治愈者，包括原發(fā)性肝癌)；(4)合并心、肺、腎、腦、血液等重要臟器嚴重疾病伴功能不全者。經(jīng)以上入排標準篩選，總共納入26例臨床治愈者。

同時納入了26例CHB初治患者進行比較。入選標準：(1)年齡18～70歲；(2)HBsAg陽性>6個月；(3)未進行抗病毒治療。排除標準同CHB臨床治愈者。另外納入26例健康對照者。

1.2 研究方法 收集CHB初治患者、CHB臨床治愈者和健康對照者的基本信息和各項臨床數(shù)據(jù)，包括生化指標及病毒學檢查指標。

1.3 標本收集及檢測 收集CHB初治患者、CHB臨床治愈者和健康對照者的外周血樣本。使用流式細胞技術檢測外周血T淋巴細胞及PD-1表達情況，使用FITC anti-human CD3 Antibody (美國，Biolegend公司)標記外周血T淋巴細胞，使用PE anti-human CD8 Antibody(美國， Biolegend公司) 標記外周血T淋巴細胞中的CD8+T淋巴細胞，使用APC anti-human CD279 (PD-1) Antibody (美國，Biolegend公司)標記PD-1+淋巴細胞。使用ELISA法檢測血清sPD-1和sPD-L1 (美國，R&D Systems 公司)。

1.4 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。非正態(tài)分布計量資料采用M(P25～P75)表示，sPD-1和sPD-L1及抗-HBs的水平經(jīng)log10變換后使用M(P25～P75)描述，3組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗。計數(shù)資料3組間比較采用χ2檢驗。使用Pearson相關或Spearman相關進行兩個連續(xù)變量之間的相關性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CHB初治患者、臨床治愈者與健康對照者的特點分析 CHB臨床治愈者平均抗病毒治療時間約8.33年，抗病毒治療藥物均為恩替卡韋。CHB初治患者HBsAg水平為2.51(1.74～3.31) log10IU/mL，HBV DNA為 1.42(1.30～2.53) log10IU/mL，HBeAg陽性7例。臨床治愈者的血清sPD-1和sPD-L1水平顯著高于健康對照者(P值分別為0.029、<0.001)。然而臨床治愈者血清sPD-1和sPD-L1水平與CHB初治患者水平相似，差異無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)(表1)。

臨床治愈者的T淋巴細胞/淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞/淋巴細胞、PD-1+細胞/淋巴細胞、PD-1+CD8+T淋巴細胞/淋巴細胞與健康對照者水平相似，差異無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。而CHB初治患者的PD-1+細胞/淋巴細胞、PD-1+CD8+T淋巴細胞/淋巴細胞顯著高于臨床治愈者(P值分別為0.040、0.016)(表1)。

表1 CHB患者和健康對照者臨床特點分析

2.2 健康對照者血清sPD-1和sPD-L1與各指標的相關性分析 健康對照者血清sPD-1水平和年齡、性別、ALT、T淋巴細胞/淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞/淋巴細胞、PD-1+細胞/淋巴細胞、PD-1+CD8+T淋巴細胞/淋巴細胞均無相關性(P值均>0.05)，sPD-L1也是類似結果(表2)。

表2 健康對照者血清sPD-1和sPD-L1與各指標的相關性

2.3 CHB初治患者血清sPD-1和sPD-L1與各指標的相關性分析 結果提示CHB初治患者血清sPD-1、sPD-L1與HBsAg水平均呈中等程度負相關(r值分別為-0.524、-0.583，P值均<0.05)。血清sPD-1、sPD-L1水平和PD-1+CD8+T淋巴細胞/淋巴細胞具有中等程度的正相關(r值分別為0.535、0.419，P值均<0.05)。血清sPD-1和sPD-L1水平與其他指標均無相關性(P值均>0.05)(表3)。

表3 CHB初治患者血清sPD-1和sPD-L1與各指標的相關性

2.4 CHB臨床治愈者血清sPD-1和sPD-L1與各指標的相關性分析 CHB臨床治愈者血清sPD-1水平和年齡、性別、ALT、T淋巴細胞/淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞/淋巴細胞、PD-1+細胞/淋巴細胞、PD-1+CD8+T淋巴細胞/淋巴細胞均無相關性(P值均>0.05)，sPD-L1也是類似結果(表4)。

表4 臨床治愈CHB患者血清sPD-1和sPD-L1與各指標的相關性分析

3 討論

CHB初治患者中血清sPD-1、sPD-L1水平與外周血PD-1+CD8+T淋巴細胞/淋巴細胞之間存在中等程度的正相關性，提示CHB初治患者血清sPD-1、sPD-L1水平主要與外周血PD-1+CD8+T淋巴細胞有關，外周血病毒特異性耗竭型CD8+T淋巴細胞比例越高，血清sPD-1、sPD-L1水平越高。然而CHB臨床治愈者、健康對照者未見到血清sPD-1、sPD-L1水平與PD-1+CD8+T淋巴細胞/淋巴細胞顯著的相關性，提示CHB臨床治愈者、健康對照者體內sPD-1、sPD-L1水平可能主要來源于外周血以外。有研究[18-19]發(fā)現(xiàn)超過90%的肝臟浸潤的HBV特異性CD8+T淋巴細胞中可檢測到PD-1陽性。

本研究中臨床治愈者的外周血PD-1+細胞/淋巴細胞、PD-1+CD8+T淋巴細胞/淋巴細胞顯著低于CHB初治患者，提示臨床治愈者外周血耗竭型CD8+T淋巴細胞減少。這可能是因為臨床治愈者隨著病毒載量和抗原水平降低，體內部分病毒特異性T淋巴細胞功能恢復。然而與健康對照者相比，臨床治愈者的血清sPD-1和sPD-L1水平仍顯著高于健康對照者。這可能與CHB臨床治愈者體內耗竭型病毒特異性T淋巴細胞主要存在于肝內[20]有關。由于HBV cccDNA以及HBV整合DNA的存在，臨床治愈者雖然血清檢測不到病毒和抗原，但肝內還在發(fā)生病毒復制[21]，使得肝內病毒特異性T淋巴細胞只能恢復部分功能。因此，血清sPD-1和sPD-L1可能可以反映肝內病毒特異性T淋巴細胞恢復情況，尤其是CHB臨床治愈者這種外周血T淋巴細胞功能部分恢復的情況，值得進一步研究驗證。

在CHB初治患者體內，血清sPD-1、sPD-L1和HBsAg水平呈中等程度負相關，sPD-1和sPD-L1水平越高，HBsAg水平越低。這可能是因為CHB初治患者病毒抗原水平較高，使得病毒特異性T淋巴細胞的耗竭主要表現(xiàn)為數(shù)量減少。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)臨床治愈者的血清sPD-1和sPD-L1水平高于健康對照者,這可能與臨床治愈者肝內仍持續(xù)發(fā)生病毒復制有關，使得肝內病毒特異性T淋巴細胞功能仍受到抑制。通過檢測血清sPD-1和sPD-L1可能可以反映臨床治愈者肝內病毒特異性免疫恢復的情況。

倫理學聲明：本研究于2021年1月13日由北京大學第一醫(yī)院倫理委員會批準，倫理審查編號：2020科研363。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：譚寧負責數(shù)據(jù)收集，統(tǒng)計分析，撰寫文章；劉建湘負責資料分析，擬定寫作思路，撰寫文章；譚寧和劉建湘貢獻等同，為共同第一作者?？嘿?、潘家莉、韓一凡、陳宏宇參與收集數(shù)據(jù)和分析；徐小元負責指導撰寫文章并最后定稿。