豬肉中雄烯酮含量不同對小鼠性腺組織及性激素水平的影響

許爍熙，劉嘉瑩，李育銀，梁曉文，章力建，侯少貞*

1. 廣州中醫(yī)藥大學中藥學院（廣州 510006）；2. 廣州市仙草家園科技有限公司（廣州 510799）；3. 國家農產品質量安全風險評估專家委員會（北京 100125）

肉類食品是人類飲食重要的營養(yǎng)物質，豬肉是我國主要的動物性食品，對人們生活水平具有極其重要影響。豬肉中含有人體各種必需氨基酸，其必需氨基酸的構成比例接近人體需要，可被人體充分吸收，屬于優(yōu)質蛋白質[1-2]*。豬肉中含有豐富的鈣、鎂、磷、鈉、鉀、氯等微量元素。其中，鈣、磷是影響骨骼發(fā)育的營養(yǎng)要素；鐵元素是合成血紅蛋白所不可缺少的，同時也是維持人體正常生命活動最重要的十幾種酶的組成要素；鈉、氯等元素，可充分補充有機體消耗的鹽分[3-6]*。因此，這些指標是豬肉質量評價重要依據。

在豬肉質量評價中，風味是一種重要的評價指標。豬肉在烹飪時會產生膻味，這主要是由雄烯酮及糞臭素過度累積造成[7-9]*。糞臭素是大腸內厭氧微生物降解色氨酸的產物，有極強的糞臭味[10]*。雄烯酮又叫豬烯酮，是公豬睪丸中產生的一項類固醇激素，屬于16-雄甾烯類固醇家族，具有尿騷味，易儲存于肌肉及口水中，作為信息素刺激母豬發(fā)情以促進交配，且在母豬中也少量存在，這是豬肉的主要騷味來源。雄烯酮在睪丸中與類固醇激素、雄激素和雌激素一同形成，連同其他16-雄甾類固醇激素，由睪丸中孕烯酮合成[11-14]*。有研究表明，睪丸類固醇，雄激素和雌激素含量增加的公豬具有較高的雄烯酮水平，雄烯酮與性發(fā)育程度相關。雄烯酮是公豬氣味劑的主要成分，可用于測試母豬是否進入發(fā)情期或誘導母豬發(fā)情[15]*。

在豬體內，雄烯酮與雄激素、雌激素等的合成及代謝息息相關[16]*。但雄烯酮不僅存在于公豬的口水及脂肪中，還存在于人類的口水和汗腺中，是人類男性體味的一類化合物。已有研究支持雄烯酮傳遞優(yōu)勢、攻擊及競爭的概念，并認為雄烯酮是社會合作意愿降低及婚外性行為可能性增加的信號[17-18]*。研究表明睪酮水平及雌二醇水平較高的患者對于雄烯酮的敏感程度更高[19]*，睪酮與雌二醇是影響人體性腺組織分泌的主要性激素。雄烯酮的產生與內源性睪酮水平密切相關，因此，推測雄烯酮可能能影響機體的性激素水平。

豬肉作為肉類食品中雄烯酮含量較高的一項肉類食品，其雄烯酮對于味蕾的影響已被廣泛報導，然而食用雄烯酮含量偏高的豬肉后是否產生其他不良影響，尤其是對攝入者體內激素水平的影響，仍缺乏相關研究。因此，試驗采用雄烯酮含量不同的豬肉對小鼠進行喂養(yǎng)，觀察小鼠性激素水平和性腺組織的變化，以期初步探討豬肉雄烯酮含量高低不同對機體性激素帶來的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料

昆明種小鼠[SPF級別，體重18～22 g，珠海百試通生物科技有限公司提供，許可證號：SCXK（粵）2020-0051，廣州中醫(yī)藥大學動物中心飼養(yǎng)]；豬肉樣品（市場隨機采購豬前腿肉樣品10份、廣州仙草家園提供散養(yǎng)山豬前腿肉樣品10份）；肝臟樣品（市場隨機購買豬肝新鮮豬肝樣品10份、廣州市仙草家園提供散養(yǎng)山豬豬肝樣品10份）；豬雄烯酮（ADT）Elisa試劑盒（BS-E14469O1，江蘇博深生物科技有限公司）；小鼠睪酮（T）Elisa試劑盒（RXJ202921M）、小鼠雌二醇（E2）Elisa試劑盒（RXJ203008M）（泉州睿信生物科技有限公司）；小鼠糞臭素（Ska）Elisa試劑盒（ZK-P9738，深圳子科生物科技有限公司）；BCA蛋白定量/濃度測定試劑盒（MA0082-3，大連美侖生物技術有限公司）。

1.1.2 儀器

1510型全波長酶標儀、HP300型組織脫水機、HBM-1型組織包埋機、TM-4000型組織切片機（美國Thermo Fisher公司）；HF-24M型全自動樣品冷凍研磨儀（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司）；CKX-41-32型倒置型顯微鏡（日本Olympus公司）；CM-24-11型光學顯微鏡（日本Olympus公司）；LGJ-60A型冷凍干燥機（上海豫明儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 豬肉及肝臟中糞臭素及雄烯酮含量檢測

從每份樣品中取適量豬肉或者豬肝，按1∶9比例加入生理鹽水，勻漿后離心取上清，使用蛋白濃度測定試劑盒測定其蛋白濃度，并將蛋白濃度調節(jié)至一致，按照雄烯酮及糞臭素試劑盒檢測說明書檢測豬肉及豬肝樣品中雄烯酮及糞臭素含量。

1.2.2 豬肉樣品制備

將市售豬肉和天下農王提供的豬肉分別用清水洗凈，放入鍋中加清水煮熟，撈出，用吸水紙擦干表面水分，切成等量小塊，放入冷凍干燥機中干燥至恒重，取出，密封袋密封，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 動物模型建立、分組及給藥方法

將60只雄性小鼠和60只雌性小鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為5組，雌雄各半，分別為：空白組、低雄烯酮豬肉喂養(yǎng)組（低、高投喂劑量組設為5和10 g/kg組）、高雄烯酮豬肉喂養(yǎng)組（低、高投喂劑量組設為5和10 g/kg組）。動物每12 h光照，相對濕度50%～80%，給予普通飼料，純水，進行普通飼養(yǎng)。動物每天給予定量的普通飼料，雄烯酮豬肉喂養(yǎng)組按供試量及體重每天給予一定量凍干豬肉以替代等量普通飼料；連續(xù)投喂8周。

1.2.4 小鼠血清睪酮及雌二醇

8周后，小鼠禁食過夜；隔天早上麻醉，以含有EDTA之真空采血管自下腔靜脈采血后。隨后動物進一步麻醉處死，解剖取雌鼠子宮、卵巢；雄鼠睪丸及前列腺精密稱重。采用Elisa劑盒測定雄性小鼠血清睪酮、雌性小鼠雌二醇水平。

1.2.5 卵巢、子宮及睪丸、前列腺組織病理學觀察

動物采血后，進一步麻醉處死，解剖卵巢、子宮、睪丸及前列腺精密稱重后，4%多聚甲醛溶液固定后用石蠟包埋，通過蘇木精-伊紅染色進行病理組織學檢查。

1.3 數據處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件處理數據，結果均以均數±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析，P＜0.05有顯著性差異，具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 不同來源豬肉及肝臟樣品中雄烯酮、糞臭素含量

采用Elisa檢測試劑盒檢測2種不同來源豬肉及豬肝中雄烯酮含量，結果如圖1所示，與市場銷售的相比，仙草家園供的豬肉及豬肝中雄烯酮含量顯著性降低（P＜0.05）。圖2顯示，與市場銷售組相比，仙草家園提供的豬肉樣品中糞臭素含量顯著性降低（P＜0.05）。

圖1 不同來源豬肉及肝臟中雄烯酮含量

圖2 不同來源豬肉及肝臟中糞臭素含量

2.2 不同來源豬肉對小鼠生長狀態(tài)的影響

根據2.1結果，隨機購買的市售豬肉樣品雄烯酮含量更高，因此作為高雄烯酮含量豬肉樣品進行喂養(yǎng)；仙草家園公司提供的豬肉樣品雄烯酮含量偏低，列為低雄烯酮含量豬肉樣品進行喂養(yǎng)?？瞻捉M小鼠給與常規(guī)試驗鼠飼料、未進行任何飲食干預，其狀態(tài)良好、活潑，毛發(fā)有光澤。各豬肉干預組在保證基礎飲食供應的基礎上，替換一定量豬肉樣品進行飼喂。其中，高雄烯酮含量豬肉喂養(yǎng)組雄性小鼠飼養(yǎng)1周后開始出現(xiàn)部分動物有躁狂及攻擊行為，表現(xiàn)為喜打架撕咬；將其中撕咬情況最為嚴重的雄性小鼠分離后，其余小鼠仍出現(xiàn)嚴重的撕咬狀況，多數小鼠尾部及背部出現(xiàn)明顯咬痕，個別動物甚至出現(xiàn)斷尾、眼睛受傷等極端損傷現(xiàn)象；低雄烯酮豬肉喂養(yǎng)組小鼠與高雄烯酮豬肉喂養(yǎng)組組相比，撕咬狀態(tài)明顯緩解，喜打架撕咬小鼠分離后其他小鼠撕咬情況明顯降低，與空白對照組無明顯差異。

雌性動物喂養(yǎng)豬肉后未出現(xiàn)明顯的異常行為或狀態(tài)改變。

2.3 各組雄性小鼠睪丸及前列腺指數

如圖3所示，與空白組比較，高雄烯酮及低雄烯酮豬肉喂養(yǎng)組喂養(yǎng)一定量豬肉后，小鼠睪丸指數及前列腺指數等沒有顯著性差異。

圖3 各組小鼠睪丸及前列腺指數

2.4 各組雄性小鼠睪酮、雌性小鼠雌二醇含量

如圖4所示，與空白組相比，經過高雄烯酮及低雄烯酮豬肉飼養(yǎng)后，雌鼠雌二醇水平有所降低，其中高雄烯酮豬肉喂養(yǎng)組（供試量10 g/kg）雌鼠雌二醇水平顯著降低（P＜0.05），而雄鼠睪酮水平顯著性增加（P＜0.01），低雄烯酮含量豬肉喂養(yǎng)組喂食后小鼠血清中睪酮及雌二醇水平均沒有顯著性差異。

圖4 不同喂養(yǎng)組小鼠雌二醇、睪酮水平的比較

2.5 各組小鼠卵巢組織病理學

如圖5所示，空白組小鼠卵巢皮質及髓質結構清晰，顆粒細胞排列整齊、層次多；高雄烯酮豬肉喂養(yǎng)組與空白組相比，有個例出現(xiàn)正常卵泡數量有所減少，閉鎖卵泡較空白組有所增加；而低雄烯酮豬肉喂養(yǎng)組與空白組相比，個別動物有些許閉鎖卵泡；整體上各組間形態(tài)結構差異不顯著。

2.6 各組小鼠子宮組織病理學

如圖6所示，小鼠子宮內膜腔上皮細胞呈柱狀排列，表面有纖毛覆蓋，間質疏松，呈蛻膜化改變，血管、腺體數量多，腺腔面積大。各組豬肉喂養(yǎng)后小鼠子宮與空白組相比無顯著性差異。

2.7 各組小鼠睪丸組織病理學

如圖7所示，空白組小鼠睪丸精小管排列緊密整齊，精管內生精細胞數量密集、分布均勻、形態(tài)良好；與空白組相比，個別高雄烯酮豬肉喂養(yǎng)組動物睪丸精管內生精細胞數量有所減少，而低雄烯酮豬肉喂養(yǎng)組與空白組相比無明顯差異，睪丸精小管排列整齊，形精管內生精細胞數量密集、分布基本均勻，整體上各組間的組織形態(tài)差異不顯著。

3 討論

雄烯酮是豬的一種性費洛蒙，也是豬的膻味來源，有研究表明，雄烯酮在豬體內與雄激素及雌激素一起合成，而性激素對性腺組織的發(fā)育具有重要影響[13]*。因此推測雄烯酮可能對性腺組織產生一定影響。雄烯酮主要存在于豬肉脂肪中，通過豬肉攝入一定量雄烯酮是否會產生對激素水平的不良影響，尚無相關報道。

經檢測，仙草家園提供的散養(yǎng)山豬豬肉樣品與市場銷售隨機采豬肉購樣品相比，其肌肉及肝臟中雄烯酮含量顯著性降低。根據前期觀察發(fā)現(xiàn)，仙草家園散養(yǎng)的雄豬發(fā)情的次數與其他常規(guī)飼養(yǎng)場的雄豬明顯降低，這或許是與其體內雄烯酮含量不高有關。此外，經檢測仙草家園提供的豬肉與市場銷售豬肉相比其糞臭素含量顯著性降低。綜合2項指標，可以推測糞臭素、雄烯酮含量偏低是仙草家園豬肉風味更好的重要原因。

試驗進一步考察雄烯酮含量不同的2種豬肉喂食后對小鼠性激素及性腺組織的影響。采用Elisa試劑盒檢測雄性小鼠血清睪酮水平。與空白組相比，高雄烯酮豬肉喂養(yǎng)組小鼠的睪酮水平顯著增加；且喂養(yǎng)后雄性小鼠出現(xiàn)一定的躁狂狀況，隨著飼養(yǎng)周期的逐漸增加，部分小鼠出現(xiàn)嚴重打架行為，這可能是因為睪酮水平的增高影響雄性小鼠，增加雄性小鼠的攻擊性[20-21]*。低雄烯酮含量豬肉喂養(yǎng)后小鼠相比高雄烯酮含量豬肉喂養(yǎng)的小鼠，其打架行為明顯緩解。其隨著飼養(yǎng)周期的增加其躁狂狀態(tài)變化不大。研究表明，雄烯酮可能會傳遞一種優(yōu)勢、攻擊及競爭的概念，因此，推測雄烯酮水平過高可能會影響雄性小鼠的睪酮水平，導致小鼠出現(xiàn)躁狂狀態(tài)，影響動物的相關性激素水平及動物狀態(tài)。

同時，檢測雄烯酮含量不同的2種豬肉喂食后雌鼠體內雌二醇水平。結果表明，經高雄烯酮豬肉喂養(yǎng)后雌鼠雌二醇水平可出現(xiàn)明顯降低。這是因為食物中高雄烯酮攝入直接引起還是由其他物質引起的，需要后續(xù)試驗進行研究及探索。

綜上，試驗發(fā)現(xiàn)市場銷售豬肉及仙草家園提供的自然散養(yǎng)豬豬肉樣品中的雄烯酮、糞臭素等含量有明顯差異。除了引起膻味外，雄烯酮含量較高的豬肉樣品還可能影響攝入動物小鼠的性激素水平，改變雄性動物行為。具體影響機制仍有待進一步研究。

雄烯酮是豬飼養(yǎng)過程中一種常用的刺激發(fā)情的激素。試驗初步揭示高雄烯酮含量肉樣對攝入動物性激素的影響，但其具體量效關系、時效關系考察還不全面，尤其是長期攝入是否會對性器官產生明顯的不良影響，也有待進一步研究。