耿澤星 陳朝通* 吳 鵬 李吉清 單洪偉**
(1.中國海洋大學,海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室,青島 266003;2.威海市文登區(qū)海洋發(fā)展事務中心,威海 264400;3.威海泰裕水產良種繁育有限公司,威海 264400)
凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)又稱凡納對蝦,生長速度快、活力強、口感誘人且營養(yǎng)豐富,目前是世界主要的對蝦養(yǎng)殖品種[1]。近年來,隨著凡納濱對蝦養(yǎng)殖密度的逐漸增加,養(yǎng)殖環(huán)境有害物質大量積累,造成對蝦處于各種環(huán)境脅迫之下,影響對蝦正常的生理代謝,降低對蝦的生長性能。養(yǎng)殖過程中,可以通過營養(yǎng)強化手段提高水生動物的生長和環(huán)境抗逆性[2]。研究表明,通過營養(yǎng)改善可以提高低鹽度脅迫下凡納濱對蝦的成活率[3]。生物餌料能夠提供大量可消化的營養(yǎng)物質,如必需氨基酸和礦物質等,對蝦攝食生物餌料,如南極磷蝦(Euphausiasuperba)、黑水虻(Hermetiaillucens)等,利于提高對蝦的生長性能,因此,比攝食單一配合飼料的產量更高[4]。此外,生物餌料還可以作為營養(yǎng)強化劑來增強對蝦的應激耐受性[5]。
藻鉤蝦(Ampithoesp.)屬于節(jié)肢動物門(Arthropoda),甲殼綱(Crustacea),端足目(Gammarid),藻鉤蝦亞目(Gammaridea),主要分布于中國黃海、渤海、東海、日本和北太平洋海岸,棲息于灘涂濕地的海藻,主要以動物碎屑為食[6]。藻鉤蝦體內富含蛋白質、多不飽和脂肪酸(PUFA)和必需氨基酸,已被證明是一種優(yōu)良的對蝦生物餌料[7]。然而,藻鉤蝦的繁殖能力在夏季較弱,并且可能攜帶病原,活體不易儲存和運輸,導致對蝦養(yǎng)殖中直接使用鮮活的藻鉤蝦存在不便。將鮮活的藻鉤蝦通過冷凍干燥的方法制成藻鉤蝦粉可能是一種解決方法。藻鉤蝦粉很好地保存了藻鉤蝦的營養(yǎng)成分,易保存和方便運輸,同時降低了引入病原的風險。Shan等[8]研究表明,飼喂藻鉤蝦粉對凡納濱對蝦的生長性能、能量代謝、抗氧化和氨氮耐受性均有積極的影響,是一種很好的營養(yǎng)強化劑。
脂類物質在水生動物的生長以及能量代謝、環(huán)境抗逆性等生理過程中起著重要作用,是維持機體內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一種必不可少的成分[9]。例如,脂類中的蝦青素是對蝦體色最主要的類胡蘿卜素,能夠影響對蝦蛻皮、生長、免疫等生理過程[10]。為了滿足凡納濱對蝦的生長需求,飼料必須含有足量的亞油酸(LA)、亞麻酸(ALA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)等必需脂肪酸,它們可以提高對蝦的生長性能、飼料利用率、抗氧化能力并減少脂肪沉積[11]。藻鉤蝦含有豐富的脂類物質,可能通過影響對蝦脂類組成影響對蝦健康水平,但相關研究資料匱乏。
因此,本研究以凡納濱對蝦為研究對象,投喂添加藻鉤蝦粉的飼料,探究飼喂藻鉤蝦粉對凡納濱對蝦生長性能以及蝦青素、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TCHO)、脂肪酸等脂類含量的影響,為進一步揭示藻鉤蝦粉的功能提供基礎數據,為餌料生物在對蝦養(yǎng)殖中的應用提供參考。
藻鉤蝦購買于濰坊昌邑,生長水域鹽度35。藻鉤蝦使用冷凍干燥機進行凍干處理,粉碎,制成藻鉤蝦粉。以魚粉、藻鉤蝦粉、豆粕為蛋白質源,以面粉為糖源,以魚油和磷脂為脂肪源,配制3種等氮等能的飼料,飼料中藻鉤蝦粉的質量分數分別為0、8.25%、33.00%,分別標記為D0、D8.25和D33.00。飼料制作過程如下:飼料原料經粉碎后過80目篩,采用逐級擴大法混合均勻,隨后添加魚油、卵磷脂,再添加水和氯化膽堿,混勻,壓制成粒徑為1.0 mm的顆粒飼料,55 ℃烘干,自然冷卻后放入密封袋中,置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。試驗飼料組成及營養(yǎng)水平見表1,試驗飼料脂肪酸組成見表2,其中總能使用氧彈儀(Parr 6400,Parr Instrument Company,美國)測定,粗蛋白質含量使用凱氏定氮儀(2300-Kjeldahl apparatus,FOSS,丹麥)測定,粗脂肪含量用索氏抽提儀(Soxhlet extraction system B-811,瑞士)測定。
表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) %
續(xù)表1項目Items飼料DietsD0D8.25D33.00氯化膽堿Cholinechloride0.500.500.50磷酸二氫鈣Ca(H2PO4)22.002.002.00褐藻酸鈉Sodiumalginate0.350.350.35合計Total100.00100.00100.00營養(yǎng)水平Nutrientlevels2)總能GE/(MJ/kg)16.8316.8016.75粗蛋白質CP36.6235.6135.89粗脂肪EE7.745.885.37
表2 試驗飼料脂肪酸組成(占總脂肪酸的比例)Table 2 Fatty acid composition of experimental diets (percentage of total fatty acid) %
續(xù)表2項目Items飼料DeitsD0D8.25D33.00C20∶5n3(二十碳五烯酸EPA)8.55±0.248.40±0.188.11±0.15C20∶3n60.13±0.010.16±0.030.16±0.02C20∶3n32.33±0.581.50±0.052.03±0.62C22∶2n61.09±0.071.02±0.021.14±0.06C22∶6n3(二十二碳六烯酸DHA)10.34±0.35a10.15±0.08a8.28±0.23b總多不飽和脂肪酸ΣPUFA47.29±1.52a45.20±0.25ab42.42±1.67bn-6多不飽和脂肪酸n-6PUFA8.59±0.30b8.76±0.06ab9.18±0.16an-3多不飽和脂肪酸n-3PUFA38.70±1.27a36.44±0.22a33.24±1.52b二十碳五烯酸+二十二碳六烯酸EPA+DHA18.89±0.59a18.55±0.26a16.38±0.39bn-3多不飽和脂肪酸/n-6多不飽和脂肪酸n-3PUFA/n-6PUFA4.51±0.10a4.16±0.03b3.62±0.10c
養(yǎng)殖試驗在文登市泰裕水產良種繁育有限公司室內9個水泥池中進行,水泥池規(guī)格為206 cm×137 cm×97 cm,養(yǎng)殖水體為2.26 m3。試驗用凡納濱對蝦約6 777尾,初始規(guī)格為體長(5.32±0.69) cm,體重(1.80±0.72) g,活力好,不攜帶病原。試驗分為3組,每組3個重復(每個水泥池為1個重復),分別投喂含藻鉤蝦粉為0、8.25%和33.00%的試驗飼料,組別分別記為D0組、D8.25組和D33.00組。每個水泥池放養(yǎng)凡納濱對蝦(753±36)尾(放養(yǎng)密度為333尾/m2),養(yǎng)殖試驗持續(xù)40 d。養(yǎng)殖過程中,每天按照對蝦體重的8%投喂,投喂4次(06:00、10:00、18:00、22:00),每次投喂1 h后查看殘餌情況,以便調整下次投喂量。養(yǎng)殖過程中,水質參數如下:溶氧含量>6 mg/L,水溫(24.7±3.5) ℃,鹽度30.0±0.5,pH 7.6~8.0。
在試驗第0(開始投喂試驗飼料)、10、20、30、40天取樣,隨機從各組中選取9尾對蝦(每個重復3尾蝦),從對蝦血竇處按血淋巴與抗凝劑[12]體積比1∶3的比例抽取血淋巴,抽出的血淋巴立即離心(4 000 r/min,10 min),取上清置于-80 ℃冰箱內保存待測。取對蝦肝胰腺、肌肉、甲殼置于-80 ℃冰箱內保存待測。
1.4.1 生長性能
對蝦相對增重率(WGR)、特定生長率(SGR)、成活率(SR)、飼料系數(FCR),分別按照以下公式進行計算:
WGR(%)=[(Wt-W0)/W0]×100;SGR(%/d)=[(lnWt-lnW0)/T]×100;SR(%)=(Nt/N0)×100;FCR=M/AY。
式中:W0表示養(yǎng)殖初始時凡納濱對蝦的平均質量(g);Wt表示養(yǎng)殖結束時凡納濱對蝦的平均質量(g);T表示養(yǎng)殖天數(d);N0表示養(yǎng)殖初始時的凡納濱對蝦數量;Nt表示養(yǎng)殖結束時凡納濱對蝦的數量;M表示養(yǎng)殖過程中投喂量(kg);AY表示對蝦收獲量(kg)。
1.4.2 組織生化指標
血淋巴、肝胰腺和肌肉中的TG、TCHO含量均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進行測定。脂肪酸的提取主要根據Hazel[13]方法,采用氣相色譜法測定,脂肪酸甲酯含量的檢測使用氣相色譜儀(Shimadzu GC-2010 plus,日本)完成。蝦青素含量的測定按照Yi等[14]方法,采用分光光度法測定。
試驗數據用平均值±標準差表示。試驗數據分析采用SPSS 22.0軟件,先進行正態(tài)性分析(Shapiro-Wilk)和方差齊性檢驗(Levene),對于符合正態(tài)性和方差齊性的數據進行單因素方差分析(one-way ANOVA),采用Tukey檢驗進行組間差異顯著性分析。若數據不符合方差齊性,則采用Tamhane’s T2(M)檢驗進行組間差異顯著性分析,P<0.05為差異顯著。
如表3所示,D8.25組和D33.00組對蝦的終末體重、WGR、SGR、SR均高于D0組,其中D8.25組對蝦終末體重、SR和D33.00組對蝦終末體重、WGR、SGR、SR、PR顯著高于D0組(P<0.05)。D8.25組和D33.00組對蝦的FCR低于D0組,其中D33.00組對蝦的FCR顯著低于D0組(P<0.05)。以上結果表明,飼料添加藻鉤蝦粉可以提高凡納濱對蝦的生長性能,但D8.25組和D33.00組沒有顯著差異(P>0.05)。
表3 飼料藻鉤蝦粉水平對凡納濱對蝦生長性能的影響Table 3 Effects of dietary Ampitheoe sp.powder level on growth performance of L.vannamei
如圖1所示,D8.25組對蝦甲殼、肝胰腺、肌肉中蝦青素含量均顯著高于D0組(P<0.05),D33.00組對蝦甲殼、肝胰腺、肌肉中蝦青素含量均顯著高于D8.25組(P<0.05)。以上結果表明,飼料添加藻鉤蝦粉能提高凡納濱對蝦的蝦青素含量,且效果與藻鉤蝦粉添加水平呈正相關。
數據柱標注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。Date bars with different letters mean significant difference (P<0.05).The same as below.圖1 飼料藻鉤蝦粉水平對凡納濱對蝦甲殼(A)、肝胰腺(B)、肌肉(C)中蝦青素含量的影響Fig.1 Effects of dietary Ampitheoe sp.powder level on astaxanthin content in carapace (A),hepatopancreas (B) and muscle (C) of L.vannamei
如圖2所示,整個養(yǎng)殖過程中,D0組血淋巴TG含量呈逐漸升高趨勢,而D8.25組和D33.00組相對穩(wěn)定。除第20天外,D8.25組對蝦血淋巴TG含量均顯著低于D0組(P<0.05);D33.00組對蝦血淋巴TG含量均顯著低于D0組(P<0.05)。第20天時,D8.25組血淋巴TCHO含量顯著高于D0組和D33.00組(P<0.05)。
圖2 飼料藻鉤蝦粉水平對凡納濱對蝦血淋巴甘油三酯(A)、總膽固醇(B)含量的影響Fig.2 Effects of dietary Ampitheoe sp.powder level on TG (A) and TCHO (B) contents in haemolymph of L.vannamei
如圖3所示,在第30和40天,D8.25組肝胰腺TG含量顯著低于D0組(P<0.05),D33.00組的TG含量顯著低于D8.25組(P<0.05)。第30天時,D8.25組和D33.00組的肝胰腺TCHO含量顯著高于D0組(P<0.05)。第40天時,D8.25組肝胰腺TCHO含量顯著高于D0組和D33.00組(P<0.05)。
圖3 飼料藻鉤蝦粉水平對凡納濱對蝦肝胰腺甘油三酯(A)、總膽固醇(B)含量的影響Fig.3 Effects of dietary Ampitheoe sp.powder level on TG (A) and TCHO (B) contents in hepatopancreas of L.vannamei
如圖4所示,第20和40天時,D8.25組和D33.00組肌肉TG含量均顯著低于D0組(P<0.05)。第20天時,D8.25組和D33.00組的肌肉TCHO含量顯著高于D0組(P<0.05);第40天時,D33.00組肌肉TCHO含量顯著高于D0組(P<0.05)。
圖4 飼料藻鉤蝦粉水平對凡納濱對蝦肌肉甘油三酯(A)、總膽固醇(B)含量的影響Fig.4 Effects of dietary Ampitheoe sp.powder level on TG (A) and TCHO (B) contents in muscle of L.vannamei
以上結果表明,飼料添加藻鉤蝦粉能夠影響對蝦TG和TCHO的積累,具體表現為TG積累量減少,TCHO積累量增加。
如表4所示,D8.25組對蝦肝胰腺的EPA含量顯著高于D0組(P<0.05),D33.00組對蝦肝胰腺的EPA和AA含量顯著高于D0組和D8.25組(P<0.05)。各組對蝦肝胰腺的總飽和脂肪酸(ΣSFA)、總單不飽和脂肪酸(ΣMUFA)、總多不飽和脂肪酸(ΣPUFA)、LA、ALA和DHA含量均無顯著差異(P>0.05)。
表4 飼料藻鉤蝦粉水平對凡納濱對蝦肝胰腺脂肪酸組成的影響(占總脂肪酸的比例)Table 4 Effects of dietary Ampitheoe sp.powder level on fatty acid composition of hepatopancreas of L.vannamei (percentage of total fatty acid) %
如表5所示,D33.00組對蝦肌肉的AA含量顯著高于D0組(P<0.05)。各組對蝦肝胰腺的ΣSFA、ΣMUFA、ΣPUFA、LA、ALA、EPA和DHA含量均無顯著差異(P>0.05)。
表5 飼料藻鉤蝦粉水平對凡納濱對蝦肌肉脂肪酸組成的影響(占總脂肪酸的比例)Table 5 Effects of dietary Ampitheoe sp.powder level on fatty acid composition of muscle of L.vannamei (percentage of total fatty acid) %
天然生物餌料富含營養(yǎng)和活性物質,能夠提高水產動物的生長性能和健康水平,如南極磷蝦粉能促進凡納濱對蝦親蝦的生長和性腺發(fā)育[15],黑水虻幼蟲粉可提高凡納濱對蝦幼蝦抗氧化能力和促進脂質代謝[16]。藻鉤蝦是生物餌料的一種,彭瑞冰等[17]通過分析藻鉤蝦的營養(yǎng)成分,確認藻鉤蝦氨基酸含量豐富、結構合理,PUFA豐富,EPA含量高,營養(yǎng)效能高。已有相關研究報道,藻鉤蝦能夠提高對蝦的生長性能,Shan等[18]研究發(fā)現,飼料添加藻鉤蝦粉可以提高凡納濱對蝦的生長性能;韓永望等[19]研究發(fā)現,在中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)和日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)的養(yǎng)殖試驗中,相比于人工配合飼料,投喂鮮活藻鉤蝦能顯著提高對蝦的SGR、SR和抗逆性。本試驗結果與前人研究結果相似,當藻鉤蝦粉的添加水平達到8.25%時,對蝦的終末體重、SR顯著提高;當藻鉤蝦粉的添加水平達到33.00%時,對蝦的終末體重、WGR、SGR、PR、SR均顯著提高,同時FCR顯著下降,提示藻鉤蝦粉添加水平越高,對對蝦生長性能的提升作用越明顯。由此可見,將鮮活的藻鉤蝦制成藻鉤蝦粉,能夠提高對蝦的生長性能和SR。藻鉤蝦粉能夠促進對蝦的生長,體現了藻鉤蝦粉的營養(yǎng)強化作用,推測與飼喂藻鉤蝦粉能夠提高對蝦的蝦青素、TCHO含量和改變對蝦的脂肪酸組成有關,具體分析將在下文闡述。此外,D8.25組和D33.00組對蝦的生長性能沒有顯著差異,因此,從經濟角度考慮,飼料中添加8.25%的藻鉤蝦粉較為適宜。
蝦青素是一種類胡蘿卜素,對水產動物的體色、肉質、抗氧化性等有積極作用,然而對蝦自身無法直接合成蝦青素,因此其體內蝦青素含量取決于飼料的蝦青素或相關類胡蘿卜素前體的含量[20]。本試驗中,對蝦甲殼、肝胰腺、肌肉中蝦青素含量隨著藻鉤蝦粉添加水平的增加而提高,表明飼料中添加藻鉤蝦粉可以提高對蝦的蝦青素含量。藻鉤蝦含有豐富的蝦青素以及其他類胡蘿卜素[10],前期研究發(fā)現,添加藻鉤蝦粉能夠顯著提高對蝦飼料中蝦青素的含量[21],因此,以上結果是由于添加藻鉤蝦粉提高了飼料的蝦青素含量所導致。天然的蝦青素比人工合成的蝦青素更安全、更有利于被吸收和利用[20],未來可以考慮在飼料中添加藻鉤蝦粉從而使水產動物獲得天然的蝦青素。
蝦青素對于對蝦至關重要,能夠提高對蝦的生長性能,并且通過清除活性氧來減輕環(huán)境脅迫對對蝦產生的危害[22]。Yamada等[23]研究發(fā)現,飼料中添加一定量的蝦青素可以顯著提高對蝦SR;Chien等[24]研究發(fā)現,當對蝦受到溫度脅迫、鹽度脅迫、缺氧脅迫或氨氮脅迫時,添加蝦青素可以顯著提高對蝦的SR。已有研究發(fā)現,蝦青素通過激活半胱氨酸和蛋氨酸代謝、丙酮酸代謝、糖酵解和糖異生途徑等能量代謝途徑來提高對蝦的生長性能[25]。綜上所述,飼料中添加鉤蝦粉可以顯著提高對蝦體內的蝦青素含量,這可能是對蝦生長性能提高的重要原因,并且對對蝦環(huán)境抗逆性的提高也有重要意義。
肝胰腺是對蝦脂類代謝的中心,而血淋巴起到脂類物質運輸的作用,肝胰腺和血淋巴TG和TCHO含量可以反映對蝦脂類代謝的水平。飼料中高粗脂肪水平可以顯著提高動物血液TG水平[26]。本試驗中,D0組對蝦飼料粗脂肪含量高于D8.25組和D33.00組,當飼養(yǎng)結束后,D0組對蝦血淋巴TG含量顯著高于D8.25組和D33.00組,表明飼喂鉤蝦粉會降低對蝦血淋巴TG的含量。Chen等[27]用黑水虻幼蟲粉替代魚粉飼喂凡納濱對蝦后,對蝦血淋巴TG含量下降,代謝組學結果表明,黑水虻幼蟲粉促進了對蝦的脂類代謝,因此推測飼喂鉤蝦粉能夠促進對蝦的脂類代謝水平。除此之外,Yang等[28]研究發(fā)現,蝦青素可以減少肥胖小鼠血液中TG的含量,因此,本試驗中藻鉤蝦粉提高了對蝦的蝦青素含量可能是對蝦血淋巴TG含量下降的原因之一。本試驗中,對蝦肝胰腺TG含量變化與血淋巴基本一致,這可能與血淋巴的TG主要來源于肝胰腺的脂類代謝有關。
TCHO對對蝦的生長、蛻皮、繁殖等具有重要作用,可以提高凡納濱對蝦的生長性能、抗氧化能力和免疫力,是對蝦的必需營養(yǎng)物質[29-31]。然而,蝦類本身不具有合成TCHO的能力,所以對蝦體內TCHO含量主要受食物源的影響[32]。本試驗中,飼養(yǎng)結束后的對蝦肌肉TCHO含量隨著藻鉤蝦粉水平的增加而提高,提示投喂藻鉤蝦粉可以提高對蝦肌肉的TCHO含量,這可能是對蝦生長性能提高的主要原因之一。D33.00組對蝦血淋巴和肝胰腺TCHO含量皆低于D8.25組,推測是因為當藻鉤蝦粉添加水平進一步提高時,對蝦脂類代謝水平也隨之提高使得膽固醇轉運速率加快,TCHO轉移到了肌肉組織中儲存,從而引起了肝胰腺和血淋巴TCHO含量的降低,具體原因有待進一步揭示。
PUFA可以改善對蝦的生理代謝和健康水平,是對蝦的必需脂肪酸。本試驗中,藻鉤蝦粉飼料和基礎飼料的EPA和AA含量無顯著差異,但飼喂藻鉤蝦粉可以顯著提高對蝦肝胰腺的EPA和AA含量、肌肉的AA含量。可能是因為藻鉤蝦粉能提高對蝦的抗氧化能力[18],保護PUFA免受氧化,所以EPA和AA在對蝦體內得以保留的更多。對蝦可以利用AA合成前列腺素類等物質,是合成多種激素的前體[33];EPA具有抗氧化能力,能夠提高對蝦的抗逆性[34],鑒于上述方面,飼料添加藻鉤蝦粉能夠通過增加對蝦體內EPA和AA含量來改善對蝦的脂肪酸組成,從而提高對蝦的生長性能和抗逆性。
已有研究表明,對蝦肝胰腺和肌肉的n-3和n-6 PUFA含量與飼料的n-3和n-6 PUFA含量呈顯著正相關性[35]。但是本試驗中,從表2中可得藻鉤蝦粉飼料中ΣPUFA、ALA和DHA含量顯著低于基礎飼料,并沒有顯著降低D8.25組和D33.00組對蝦肝胰腺和肌肉的ΣPUFA、ALA和DHA含量,這可能與前文提到藻鉤蝦粉能提高對蝦的抗氧化能力,減少了機體PUFA消耗有關。以上結果提示,藻鉤蝦粉飼料中較低的ΣPUFA、ALA和DHA含量并不會給對蝦的PUFA組成帶來明顯的負面影響。此外,已有研究發(fā)現,將飼料PUFA含量提高到一定水平會導致對蝦生長下降,影響脂肪酸營養(yǎng)的重要因素是膳食中n-3和n-6 PUFA的比例,而不僅是個別必需脂肪酸含量的多少[36],所以從D8.25組和D33.00組對蝦的生長性能高于D0組對蝦的結果得出,藻鉤蝦粉飼料的脂肪酸組成符合凡納濱對蝦的脂肪酸營養(yǎng)需求。此外,本試驗中,各組對蝦肝胰腺和肌肉的ΣSFA、ΣMUFA和ΣPUFA含量皆無顯著差異,提示在本試驗條件下,飼料添加藻鉤蝦粉尚不足以顯著改變凡納濱對蝦肝胰腺和肌肉組織的總脂肪酸組成。
綜上所述,飼料中添加藻鉤蝦粉能夠滿足凡納濱對蝦生長的基本營養(yǎng)需求,可以通過提高對蝦的蝦青素、TCHO、EPA和AA含量來促進對蝦的生長性能,藻鉤蝦粉飼料可以作為功能飼料提高對蝦的生長和抗逆性,從經濟角度考慮,8.25%的藻鉤蝦粉添加水平較為適宜。