袁中杰 ，郝軒軒 ，李彬 ，謝世陽 ，王新陸 ，王幼平 ，常鑫迪 ，包宇 ，朱明軍 （.河南中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，鄭州 450099；.貴州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，貴陽 55000；.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院心臟中心，鄭州 450099）

心力衰竭（簡稱“心衰”）是心血管疾病的嚴重和終末階段，致殘率和致死率均較高[1]。心肌梗死（簡稱“心?！保┦钱斍靶乃プ畛Ｒ?、最重要的病因之一，心梗后心衰的發(fā)生與心肌細胞丟失、心室重構(gòu)、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)激活及其他病理變化密切相關(guān)，其中心室重構(gòu)是心衰發(fā)生的基本病理過程[2]。腎素-血管緊張素系統(tǒng)（reninangiotensin system，RAS）的激活、細胞外基質(zhì)的成分改變和心肌纖維化的進展均會影響心室重構(gòu)，加重心衰[3-4]。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2-血管緊張素-（1-7）-Mas[angiotensin converting enzyme 2-angiotensin-（1-7）-Mas，ACE2-Ang-（1-7）-Mas]軸是一種RAS的非典型軸，被激活后可拮抗RAS系統(tǒng)對心臟產(chǎn)生的不良影響，改善心室重構(gòu)[5]。ACE2是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）的同系物，在心血管、腎臟、腸道和呼吸系統(tǒng)中發(fā)揮重要的生理和病理作用，可將血管緊張素Ⅱ（angiotensin，AngⅡ）轉(zhuǎn)化為Ang-（1-7），后者可與Mas受體（Mas receptor，MasR）結(jié)合，從而形成ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸。該軸可改善RAS中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶-血管緊張素Ⅱ-血管緊張素Ⅱ1型受體（angiotensin converting enzyme-angiotensin Ⅱ-angiotensin Ⅱ type 1 receptor，ACE-AngⅡ-AT1R）軸激活后對心臟的損害，具有舒張血管、抑制心肌肥大、調(diào)節(jié)心臟重塑等作用[6]。

葶藶大棗瀉肺湯由炒葶藶子和大棗組成，是治療心衰的經(jīng)典復方，可通過多途徑、多靶點改善心衰、緩解心室重構(gòu)[7-8]。然而，葶藶大棗瀉肺湯改善心室重構(gòu)的作用機制尚未明確。為此，本研究擬使用葶藶大棗瀉肺湯干預心梗后心衰模型大鼠，從Ⅰ型膠原蛋白（Ⅰ-type collagen，COLⅠ）、Ⅲ型膠原蛋白（Ⅲ-type collagen，COLⅢ）、羥脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）、纖維化相關(guān)指標和ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸相關(guān)蛋白等變化方面探討其作用機制，以期為該方用于治療心衰提供確切證據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括Micro Maxx型彩色多普勒超聲診斷儀（美國SonoSite公司），164-5050型電泳儀電源、Mini-Protean型垂直電泳槽、Mini Trans-Blot型電泳轉(zhuǎn)印儀（美國Bio-Rad公司），Multiskan GO型全波長酶標儀、Biofuge Stratos型臺式高速冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司），KZ-Ⅱ型高速組織研磨儀（武漢賽維爾生物科技有限公司），JB-P5型組織包埋機（武漢俊杰電子有限公司），KD-P型組織攤片機（浙江省金華市科迪儀器設備有限公司），RM2016型病理切片機（德國Leica公司），DP71-BX41型顯微觀察攝像系統(tǒng)（日本Olympus公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

炒葶藶子飲片（產(chǎn)地安徽，批號1801123）購自安徽普仁中藥飲片有限公司，大棗飲片（產(chǎn)地新疆，批號180901）購自河南輝煌草本藥業(yè)有限公司，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥學部陳天朝主任藥師鑒定均為真品。

氯沙坦鉀片（陽性對照，批號J009104，規(guī)格0.05 g）購自英國Merck Sharp & Dohme Limited公司；A779對照品（Mas受體拮抗劑，批號NJP90025-181225，純度98.23%）購自南京肽業(yè)生物科技有限公司。兔COLⅠ多克隆抗體（貨號AF7001）購自美國Affinity公司；兔COLⅢ多克隆抗體、兔甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體、HRP標記的山羊抗兔IgG二抗（貨號分別為22734-1-AP、10494-1-AP、SA00001-2）均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；蘇木精染液、DAB顯色劑、Masson染色試劑盒（貨號分別為G1004、G1211、G1006）均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、MMP-9、金屬蛋白酶組織抑制因子1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（貨號分別為E-EL-R0618c、E-EL-R0624c、E-EL-R0540c）均購自武漢伊萊瑞特生物科技公司；可溶性致瘤性抑制因子2（soluble suppression of tumorigenicity-2，sST-2）ELISA試劑盒（貨號E2292r）購自武漢伊艾博科技有限公司；兔Mas多克隆抗體（貨號PA5-43668）購自美國Invitrogen公司；兔ACE2多克隆抗體（貨號GTX101395）購自美國GeneTex公 司 ；兔 Ang-（1-7）多 克 隆抗體（貨號PAS085Ra01）購自武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司；Hyp檢測試劑盒（貨號A030-2-1）購自南京建成生物工程研究所。

1.3 實驗動物

健康SPF級雄性SD大鼠120只，6周齡，體質(zhì)量（235±15）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（京）2016-0006。本研究所有實驗過程均遵循河南中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會指導規(guī)定進行，批件號為YFYDW2018004。

2 方法

2.1 葶藶大棗瀉肺湯的制備

取炒葶藶子15 g、大棗約12枚，以水煎法提取，所得提取液經(jīng)濃縮、干燥后粉碎，得葶藶大棗瀉肺湯干粉（藥物出膏率為7.69%，每1 g干粉相當于生藥總量13 g）[7]。

2.2 大鼠心梗后心衰模型的建立

動物適應性喂養(yǎng)3 d后行左冠狀動脈前降支結(jié)扎術(shù)：手術(shù)前12 h禁食不禁水，次日稱定體質(zhì)量，予1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射進行麻醉，以仰臥位固定動物四肢，胸部備皮，酒精消毒后在心臟搏動最明顯處開胸擠出心臟，于肺動脈圓錐與左心耳邊緣交界下1 mm處結(jié)扎冠狀動脈前降支，然后迅速將心臟放回胸腔，縫合皮膚后立即胸外按壓數(shù)次。假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎。所有大鼠術(shù)后3 d經(jīng)腹腔給予慶大霉素注射液0.2 mL/d預防感染。術(shù)后24～72 h大鼠死亡率較高，剔除死亡動物，正常喂養(yǎng)4周，行心臟超聲檢測，若左室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）≤50%，則判定為心梗后心衰模型復制成功。具體手術(shù)過程參照課題組前期心梗動物模型的復制方法[9]。

2.3 分組與給藥

術(shù)后4周LVEF≤50%的大鼠共63只（存活率約為52%），其中8只大鼠只穿線不結(jié)扎，將其納入假手術(shù)組；剩余55只隨機分為7組，分別為模型組（8只）、A779組（8只）、A779+葶藶大棗瀉肺湯等效劑量組（7只，簡稱“A779+等效劑量組”）、A779+葶藶大棗瀉肺湯高劑量組（8只，簡稱“A779+高劑量組”）、葶藶大棗瀉肺湯等效劑量組（8只，簡稱“等效劑量組”）、葶藶大棗瀉肺湯高劑量組（8只，簡稱“高劑量組”）、氯沙坦鉀組（8只，簡稱“氯沙坦組”）。結(jié)合課題組前期研究[7]和藥理學實驗中動物與人體間的等效劑量換算要求[10]，本研究設定葶藶大棗瀉肺湯的灌胃劑量分別為0.8 g/kg（等效劑量）、1.6 g/kg（高劑量），氯沙坦鉀的灌胃劑量為10 mg/kg，A779組的腹腔注射劑量為1 mg/kg，假手術(shù)組和模型組平行灌胃蒸餾水，每日1次，干預4周后進行后續(xù)實驗，期間A779組和等效劑量組大鼠因心衰過于嚴重各死亡1只。

2.4 大鼠血清和心肌組織的取材和保存

給藥4周后，將大鼠用1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射進行麻醉，待其麻醉后于腹主動脈取血，于4 ℃下靜置2 h后，以3 000 r/min離心15 min，分離血清后置于-80 ℃冰箱保存。待完成取血后，取出大鼠心臟，用4 ℃生理鹽水清洗并剝離多余組織，再次以生理鹽水清洗2～3次后用刀片切取心室，部分放于4%多聚甲醛溶液中固定，部分置于-80 ℃冰箱保存。

2.5 大鼠心肌組織中膠原纖維分布的檢測

采用Masson染色法進行觀察。取各組大鼠心肌組織適量，常規(guī)石蠟包埋，切片，按照試劑盒說明書進行Masson染色，于顯微鏡下觀察膠原纖維的分布情況（心肌組織呈紅色，膠原纖維呈藍色）并拍照。

2.6 大鼠心肌組織中Hyp含量的檢測

采用堿水解法進行檢測。取各組大鼠心肌組織約40 mg，加堿水解液1 mL混勻，于沸水浴中水解20 min（每10 min混勻1次），用Hyp檢測試劑盒中提供的調(diào)pH試劑調(diào)節(jié)pH至6.0～6.8，以3 500 r/min離心后取上清液1 mL，按照試劑盒說明書進行處理，使用酶標儀于550 nm波長處檢測大鼠心肌組織中Hyp的含量。

2.7 大鼠心肌組織中COLⅠ、COL Ⅲ蛋白表達水平的檢測

采用免疫組化法進行檢測。每組取6只大鼠的心肌組織適量，制作蠟塊并切片，脫蠟后進行抗原修復；用0.3%過氧化氫甲醇溶液去除內(nèi)源性過氧化物酶，以血清封閉，加COLⅠ、COLⅢ一抗（稀釋度分別為1∶100、1∶300）于4 ℃孵育過夜；用PBS清洗，加HRP標記的IgG二抗（稀釋度1∶200）于37 ℃下孵育1 h；用PBS清洗，以DAB顯色、蘇木精復染后，行梯度乙醇脫水，封片，于顯微觀察攝像系統(tǒng)下拍照，觀察COLⅠ、COLⅢ蛋白的表達情況（細胞核為藍色，陽性表達細胞為棕黃色），并利用Image-Pro Plus軟件分析陽性細胞的平均光密度值，以表示COLⅠ、COL Ⅲ蛋白的表達水平。

2.8 大鼠血清中纖維化相關(guān)指標含量的檢測

采用ELISA法進行檢測。取“2.4”項下血清，按照ELISA試劑盒說明書操作，使用酶標儀于450 nm波長處檢測血清中纖維化相關(guān)指標（MMP-2、MMP-9、TIMP-1、sST-2）的含量。

2.9 大鼠心肌組織中ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸相關(guān)蛋白表達的檢測

采用Western blot法進行檢測。取凍存于-80 ℃的心肌組織，加入組織裂解液，勻漿，離心后取上清液，用BCA法測定蛋白濃度。取變性后的蛋白樣品40 μg，進行10%SDS-PAGE凝膠電泳分離并以濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)到PVDF膜上；用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入ACE2、Ang-（1-7）、Mas、GAPDH一抗（稀釋度分別為1∶1 000、1∶500、1∶800、1∶5 000），4 ℃孵育過夜；用TBST溶液漂洗，加入HRP標記的IgG二抗（稀釋度為1∶1 000），37 ℃孵育1 h；以ECL化學發(fā)光法顯影，使用Image J軟件進行分析，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH的灰度值表示目的蛋白的表達水平。每組取3個樣本進行檢測。

2.10 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩組間的比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 大鼠心肌組織中的膠原纖維分布

各組大鼠心肌組織中的膠原纖維分布如圖1所示。與假手術(shù)組比較，模型組和A779組大鼠心肌細胞排列紊亂，膠原纖維沉積明顯增多，心肌纖維化明顯；與模型組比較，等效劑量組、高劑量組和氯沙坦組大鼠心肌細胞排列規(guī)整，藍色膠原纖維分布明顯減少，心肌纖維化減輕；與A779組比較，A779+等效劑量組和A779+高劑量組大鼠心肌細胞排列有所改善，藍色膠原纖維分布不同程度減少，心肌纖維化減輕。

圖1 各組大鼠心肌組織中膠原纖維分布顯微圖（×400）

3.2 大鼠心肌組織中的Hyp含量

各組大鼠心肌組織中Hyp含量如表1所示。與假手術(shù)組比較，模型組和A779組大鼠心肌組織中的Hyp含量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，等效劑量組、高劑量組和氯沙坦組的Hyp含量顯著降低（P＜0.05）；與A779組比較，A779+等效劑量組和A779+高劑量組的Hyp含量均顯著降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠心肌組織中Hyp含量

3.3 大鼠心肌組織中的COLⅠ、COLⅢ蛋白表達水平

各組大鼠心肌組織中COLⅠ、COLⅢ表達如圖2、圖3、表2所示。與假手術(shù)組比較，模型組和A779組大鼠心肌組織中COLⅠ、COLⅢ陽性著色程度均顯著增強，平均光密度值顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，等效劑量組、高劑量組和氯沙坦組大鼠心肌組織中COLⅠ、COLⅢ陽性著色程度均顯著減弱，平均光密度值顯著降低（P＜0.05）；與 A779組比較，A779+等效劑量組、A779+高劑量組的COLⅠ、COLⅢ陽性著色程度均顯著減輕，平均光密度值顯著降低（P＜0.05）。

表2 各組大鼠心肌組織中COLⅠ、COLⅢ蛋白表達的平均光密度值

圖2 各組大鼠心肌組織中COLⅠ蛋白表達的顯微圖（×400）

圖3 各組大鼠心肌組織中COLⅢ蛋白表達的顯微圖（×400）

3.4 大鼠血清中纖維化相關(guān)指標水平

各組大鼠血清中MMP-2、MMP-9、TIMP-1、sST-2等纖維化相關(guān)指標水平如表3所示。與假手術(shù)組比較，模型組和A779組的MMP-2、MMP-9、sST-2水平顯著升高，TIMP-1水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，等效劑量組的TIMP-1水平顯著升高、sST-2水平顯著降低（P＜0.05），高劑量組和氯沙坦組的MMP-2、MMP-9、sST-2水平顯著降低以及TIMP-1水平顯著升高（P＜0.05）；與 A779組比較，A779+等效劑量組 MMP-2、MMP-9水平顯著降低（P＜0.05），A779+高劑量組的MMP-2、MMP-9、sST-2水平顯著降低（P＜0.05）。

表3 各組大鼠血清中MMP-2、MMP-9、TIMP-1、sST-2水平

3.5 大鼠心肌組織中ACE2-Ang（1-7）-Mas軸相關(guān)蛋白的表達情況

各組大鼠心肌組織ACE2、Ang（1-7）、Mas蛋白表達量如圖4所示。與假手術(shù)組比較，模型組和A779組的ACE2、Ang-（1-7）、Mas蛋白表達均顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，等效劑量組的Ang-（1-7）蛋白表達顯著升高（P＜0.05），高劑量組和氯沙坦組的ACE2、Ang-（1-7）、Mas蛋白表達顯著升高（P＜0.05）；與A779組比較，A779+等效劑量和A779+高劑量組的Ang-（1-7）和Mas差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），只有A779+高劑量組的ACE2蛋白表達顯著升高（P＜0.05）。

圖4 各組大鼠心肌組織中ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸相關(guān)蛋白的表達情況

4 討論

4.1 葶藶大棗瀉肺湯可降低心肌Hyp、膠原蛋白含量，改善心室重構(gòu)

心肌進行性纖維化是心梗后心衰的主要病理改變[11]。當心肌細胞受到應激損傷時，一方面肌成纖維細胞增殖、遷移和收縮能力增強，另一方面心肌細胞外基質(zhì)主要成分COLⅠ、COLⅢ表達上調(diào)，且Ⅰ型比Ⅲ型上調(diào)更明顯[12]。Hyp由多肽鏈上脯氨酸殘基羥基化作用形成，對膠原蛋白的機械穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性非常重要[13]，因此在心肌纖維化發(fā)生時，隨著膠原蛋白水平升高，常伴有Hyp含量升高。本研究中，模型組心肌組織間有藍色的膠原纖維沉積，心肌細胞排列紊亂；Hyp含量增多；COLⅠ和COLⅢ著色程度明顯加重，表達增多，提示心肌發(fā)生纖維化。經(jīng)葶藶大棗瀉肺湯治療后，藍色膠原著色程度明顯減輕，心肌組織中COLⅠ、COLⅢ、Hyp含量明顯降低，表明心肌纖維化減輕。

4.2 葶藶大棗瀉肺湯可調(diào)節(jié)血清MMP-2、MMP-9、TIMP-1、sST-2水平，減緩心室重構(gòu)

MMP在心室重構(gòu)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，可通過促進細胞外基質(zhì)周轉(zhuǎn)和炎癥信號傳導來調(diào)節(jié)該過程[14]。實驗研究表明，心肌組成型活性MMP-2過度表達會造成肌鈣蛋白水解、心肌線粒體功能障礙、左心室重塑和收縮性心衰；而MMP-9水平升高則會損害心臟代謝[15]。目前，一些用于治療心衰的一線用藥（如血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、ACE受體抑制劑）的催化結(jié)構(gòu)域與MMP相近，都可以間接抑制MMP，改善心梗后心室重構(gòu)[14]。因此，本實驗選擇臨床常用治療心衰的藥物氯沙坦鉀片作為陽性對照藥物，其抑制心肌纖維化、改善心功能的作用在本實驗中也得到了驗證。MMP活性受到內(nèi)源性組織抑制劑（TIMPs）的嚴格調(diào)控，研究表明TIMP-1缺乏將導致MMP活性增加，將促進心室重構(gòu)，加速心衰的發(fā)生[16]。sST-2可作為誘餌受體與白細胞介素33（IL-33）結(jié)合，減弱了IL-33/跨模型致瘤性抑制因子2信號通路對心肌的保護作用[17]。本研究中，模型組大鼠MMP-2、MMP-9、sST-2水平明顯升高，TIMP-1水平下降，提示心梗后心衰模型大鼠發(fā)生了心肌纖維化改變。經(jīng)葶藶大棗瀉肺湯治療后，各項指標得到改善，高劑量組MMP-2、MMP-9、sST-2水平明顯降低，TIMP-1水平明顯升高，提示心梗后心衰模型大鼠的心肌纖維化得到抑制，心室重構(gòu)得到改善。

4.3 葶藶大棗瀉肺湯可增強ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸表達，改善心室重構(gòu)

ACE2廣泛表達于心肌細胞、心臟成纖維細胞和冠狀內(nèi)皮細胞，是一種重要的RAS調(diào)節(jié)因子，能減輕AngⅡ/AT1R介導的有害作用[18]。研究表明，ACE2活性的增加可導致ACE2/Ang-（1-7）軸的激活，從而起到預防心臟病的作用；ACE2過表達可改善心梗誘導的心臟重構(gòu)[19]。Ang-（1-7）可以改善心功能和心室重構(gòu)[20]，減輕心肌纖維化[21]。Mas作為Ang-（1-7）的受體蛋白，可以通過減少心肌炎癥細胞浸潤和酪氨酸羥化酶的表達，抑制心肌纖維化和肥大的進展[22]。因此，作為RAS系統(tǒng)的非典型軸，ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸的激活可以改善心室重構(gòu)，對心臟具有很好的保護作用。

本研究中，心梗后心衰模型大鼠LVEF降低，膠原纖維沉積，Hyp含量增多，MMP、TIMP-1發(fā)生改變，心肌組織中ACE2、Mas、Ang-（1-7）蛋白表達降低，心室重構(gòu)明顯。經(jīng)葶藶大棗瀉肺湯治療后，心肌纖維化得到改善，ACE2、Mas、Ang-（1-7）蛋白表達顯著增多，提示葶藶大棗瀉肺湯可通過激活ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸通路抑制纖維化，改善心室重構(gòu)。

A779是Mas受體拮抗劑，對揭示ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸的生理作用具有非常重要的意義[21]。給予A779后，大鼠心肌組織中ACE2、Ang-（1-7）、Mas蛋白表達均明顯降低；給予A779+葶藶大棗瀉肺湯后，A779+等效劑量組ACE2、Ang-（1-7）、Mas蛋白表達無明顯改善，盡管A779+高劑量組ACE2蛋白表達呈現(xiàn)明顯升高，但其余軸蛋白的表達改善并不理想，表明葶藶大棗瀉肺湯對ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸的激活作用被A779抑制，其改善心肌纖維化的作用減弱。

綜上所述，ACE2-Ang（1-7）-Mas軸與心肌纖維化密切相關(guān)；葶藶大棗瀉肺湯不僅可以降低心衰模型大鼠心肌組織Hyp、膠原蛋白的表達，調(diào)節(jié)血清MMP-2、MMP-9、TIMP-1、sST-2水平，還可以通過提高ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸蛋白的表達水平改善心肌纖維化，減緩心室重構(gòu)，起到保護心肌的作用。