尚園園 聶文娟 黃海榮 初乃惠

結核病是威脅全球公共衛(wèi)生的重大挑戰(zhàn)之一，在新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)大流行之前，結核病是單一病原體感染導致死亡的主要原因，排名高于HIV感染/艾滋病。世界衛(wèi)生組織報告顯示，2020年全球結核病患者(HIV陰性)死亡例數(shù)約為130萬，高于2019年，大約有1/6的死亡患者為耐多藥/利福平耐藥結核病(multidrug-/rifampicin-resistant tuberculosis，MDR/RR-TB)和廣泛耐藥結核病(extensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB)患者[1-2]。MDR/RR-TB和XDR-TB治療成功率低，花費大，不良反應多，而在COVID-19大流行的背景下，MDR/RR-TB患者接受治療的例數(shù)較2019年下降15%，增加了結核病防治的難度。

近年來，貝達喹啉(bedaquiline，Bdq)和氯法齊明(clofazimine，Cfz)的使用對縮短MDR/RR-TB和XDR-TB治療療程和改善患者治療結局起到相當大的作用。2019年世界衛(wèi)生組織推薦Bdq與Cfz作為治療MDR/RR-TB的A組和B組藥物，是治療MDR/RR-TB的強有力武器[3]。Bdq和Cfz均通過損害分枝桿菌的能量代謝來發(fā)揮作用[4]，具體作用機制不同。盡管Bdq與Cfz之間存在交叉耐藥，但兩者聯(lián)合使用時仍具有額外的殺菌效果[5-6]，筆者旨在總結Bdq和Cfz的耐藥機制，以及臨床治療中Bdq和Cfz耐藥的出現(xiàn)情況，討論如何延緩Bdq和Cfz獲得性耐藥的積累和傳播。

一、Bdq和Cfz用于MDR/RR-TB和XDR-TB的治療現(xiàn)狀

Bdq是一種抑制三磷酸腺苷(ATP)的抗分枝桿菌藥物[7-8]。近幾年有許多研究表明：Bdq治療MDR/RR-TB和XDR-TB可以縮短痰培養(yǎng)陰轉(zhuǎn)時間，改善患者治療結局，并且在全口服、短療程RR-TB 治療方案中的使用也取得令人鼓舞的研究結果[9-11]。2019年世界衛(wèi)生組織推薦Bdq作為MDR/RR-TB標準治療方案中的核心藥物[3]。到2020年年底為止，已有109個國家使用Bdq作為MDR/RR-TB和XDR-TB治療的藥物[2]。因此，在臨床的應用過程中除了需要警戒Bdq的藥物不良反應[12]，還應迅速識別Bdq的耐藥性，從而預防耐藥結核病患者治療失敗的發(fā)生。

Cfz于20世紀50年代在都柏林合成，最初于1969年被用于治療麻風病。孟加拉國進行的短程MDR-TB治療方案得出令人驚喜的結果[13]，證明了Cfz的重要性。隨后，中國的臨床試驗也證明Cfz可以縮短MDR-TB的治療時間，改善MDR-TB的治療結局[14-15]。鑒于這些重要的結果，并考慮到與其他二線抗結核藥物相比，其價格相對較低，所以2019年世界衛(wèi)生組織治療指南將Cfz列為MDR/RR-TB的B組藥物，與環(huán)絲氨酸和特立齊酮推薦為首選治療藥物的一部分[3]。目前，Cfz的確切作用機制尚不清楚，但認為可能是干擾氧化還原循環(huán)導致膜不穩(wěn)定和功能障礙，產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)和抑制呼吸鏈等，干擾結核分枝桿菌的生長[16-19]。

二、Bdq和Cfz耐藥的發(fā)生率及檢測現(xiàn)狀

Bdq在MDR/RR-TB中的耐藥發(fā)生率較低，約為2.3%[20]。2005年，Andries等[21]在體外分離了Bdq的耐藥菌株，其突變率在4倍最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)時約為5×10-7，8倍MIC時突變頻率為5×10-8[21]。目前，結核分枝桿菌對Bdq耐藥相關的基因有3個，分別為atpE、Rv0678和Rv2535c(表1)。atpE基因突變株大多數(shù)是在體外分離株中獲得的，這與Huitric等[22]研究結果一致。Zheng等[20]、Liu等[23]、Xu等[24]、Ismail等[25]對Bdq耐藥結核分枝桿菌臨床分離株測序均未見atpE基因突變。但Zimenkov 等[26]及Migliori等[27]對Bdq耐藥結核分枝桿菌臨床分離株進行基因檢測發(fā)現(xiàn)有atpE基因突變，而隨后atpE突變基因被Rv0678突變基因取代，這可能與該突變體的適應度成本增加有關[27]。對Bdq治療3個月以上、痰培養(yǎng)持續(xù)陽性并且出現(xiàn)MIC值升高的結核分枝桿菌臨床分離株進行全基因組測序，發(fā)現(xiàn)大部分菌株顯示Rv0678基因發(fā)生點突變和插入突變[28-31]。上述研究也表明，在使用Bdq的治療過程中可能會產(chǎn)生Bdq耐藥，并強調(diào)了使用全基因組測序聯(lián)合MIC值檢測對于耐藥性監(jiān)測的重要性。Rv0678[32]和Rv2535c[33]基因的突變與Bdq和Cfz交叉耐藥相關。

Cfz在0.25 mg/L的藥物濃度下突變頻率為5×10-6。在>1 mg/L的情況下無Cfz耐藥突變體生長[19]。有明確的證據(jù)表明，ROS水平與細菌細胞的突變率有關[34]。南非的一項研究表明，Cfz的耐藥率為7.4%(29/391)[25]，在沒有使用過Cfz的患者體內(nèi)分離出的結核分枝桿菌耐藥率為5.8%，考慮主要是由耐藥菌株的傳播引起的[35]。國內(nèi)西南地區(qū)MDR-TB患者對Cfz耐藥率為3.4%(3/88)[20]。目前，Cfz耐藥相關基因有4個，分別為Rv0678、Rv1979c、Rv2535c和Rv1453(表1)。

表1 貝達喹啉和氯法齊明的耐藥基因

三、Bdq和Cfz的耐藥機制

抗結核藥物的耐藥性通過多種機制進化，主要涉及以下兩種機制[36]：一是原發(fā)性或傳播性耐藥；二是繼發(fā)性或獲得性耐藥。獲得性耐藥的產(chǎn)生往往是與患者治療方案不合格或治療依從性差、藥物吸收不良或藥物-藥物相互作用導致血藥濃度不達標等原因有關，進而導致菌株基因突變產(chǎn)生耐藥。

1. Bdq耐藥基因：2005年，Andries等[21]最先提出Bdq耐藥與atpE基因突變有關，該基因是一種編碼分枝桿菌ATP亞基C的高度保守基因[37]，具有81個氨基酸序列。當該基因發(fā)生突變時，可以阻止Bdq與C亞基結合，從而導致H+轉(zhuǎn)移和ATP產(chǎn)生減少[7]。目前已知的該基因突變位點有9個[21-22, 27, 37]，分別來自于體外誘導菌株和臨床株。atpE基因突變使Bdq MIC值增加了4～128倍[22]。有72%的耐藥菌株中未發(fā)現(xiàn)atpE基因突變，這也表明至少存在1個與ATP合成酶無關的Bdq耐藥位點[22]。最新研究表明，atpE基因187G→C點突變導致的A63P突變與Bdq耐藥密切相關[38]。

2. Cfz耐藥基因：(1)Rv1979c基因：Rv1979c基因編碼了具有滲透酶活性的氨基酸膜轉(zhuǎn)運蛋白，該轉(zhuǎn)運蛋白具有481個氨基酸，可能與Cfz耐藥性有關[19]。Zhang等[19]描述的體外誘導耐藥菌株Rv1979c基因的突變位點為V351A，Xu等[24]發(fā)現(xiàn)在1株耐藥臨床分離株中，Rv1979c突變位點為 V52G。但仍有一些Cfz耐藥菌株經(jīng)過序列分析后未見Rv0678和Rv1979c基因的突變[4, 20]。Xu等[24]和Pang等[39]的研究發(fā)現(xiàn)，未使用過Cfz的患者分離出具有Rv1979c突變的菌株，可能與Phelan等[40]的研究中提及的Rv1979c與異煙肼耐藥性相關。Rv1979c基因的突變對Cfz的MIC值變化的影響最小，MIC值增加2～4倍[19, 24, 33]。(2)Rv1453基因：Rv1453基因全長為1266 bp，與qor、Rv1455和PE_PGRS28基因相鄰，Li等[41]首次證實了Rv1453基因影響了結核分枝桿菌對Cfz的易感性，可導致菌株的MIC值增加4倍。Rv1453基因編碼的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白可以與包含RNA聚合酶結合位點的qor基因序列結合，從而抑制轉(zhuǎn)錄過程，通過增加ATP、降低ROS和氧化應激來降低菌株對Cfz的敏感性。

3. Bdq與Cfz交叉耐藥基因：南非的一項研究表明，曾經(jīng)暴露于Cfz是患者出現(xiàn)Bdq耐藥的危險因素，Cfz和Bdq的交叉耐藥可能會削弱Bdq對MDR/RR-TB的臨床應用價值[42]。Cfz耐藥性的分離株中有接近1/3會對Bdq具有交叉耐藥性[23, 25]，但研究中Cfz耐藥結核分枝桿菌分離株的樣本數(shù)量較少。目前，關于Bdq和Cfz交叉耐藥的相關基因主要是Rv0678和Rv2535c。

Rv0678基因：Rv0678是一種有翼螺旋DNA結合域的轉(zhuǎn)錄抑制因子[43]，已被證明與鄰近外排泵基因MmpS5/MmpL5間區(qū)的回文序列結合，Rv0678基因的突變使得該位點的抑制解除，從而導致Rv0678、mmpS5和mmpL5的轉(zhuǎn)錄上調(diào)，繼而促使藥物外排。Hartkoorn等[32]使用定量PCR發(fā)現(xiàn)攜帶Rv0678突變的H37Rv相對于野生型H37Rv，mmpL5和Rv0678表達量分別增加11.6和11.2倍。MmpS5/MmpL5外排泵的最基本的功能是輸出鐵載體[44]，在高鐵條件下外排泵的表達被下調(diào)，在低鐵條件下外排泵的表達可被上調(diào)[45]，但未在女性患者分離菌株中觀察到Rv0678高突變率[46]，Rv0678突變與特定的結核分枝桿菌譜系無關[46]。Andries等[47]的研究表明，體外Bdq獲得性耐藥菌株耐藥機制是由Rv0678的突變引起的，此基因突變時會導致Bdq和Cfz交叉耐藥。與維拉帕米聯(lián)用時可以降低Cfz和Bdq的MIC值，這也表明Bdq耐藥機制除了atpE靶點的突變外，還存在藥物外排耐藥機制[48]。Rv0678基因的變異數(shù)量眾多且分散在整個基因中，可在其209個不同位置鑒定出237個獨特的變異[38]，常見的突變是在nt192-198、nt138-144或nt212-216區(qū)域的移碼突變[46-47]，一般發(fā)生在nt138-144和nt212-216的移碼突變中，Bdq的MIC值增加了至少8倍[49]。若發(fā)生 Gln31Arg和Ser53Pro的堿基互換[20]，一般會使Bdq和Cfz的MIC值增加2～4倍(表2)。最新的研究表明，Rv0678138-139insG與Bdq耐藥相關(OR=6.91，P=0.016)。Rv0678基因的突變是目前Bdq與Cfz交叉耐藥的主要原因。但最近研究發(fā)現(xiàn)，未曾使用過Bdq或Cfz的患者中也報道了該基因突變[24]，可能與Rv0678基因突變導致藥物外排與Bdq或Cfz內(nèi)在性和獲得性耐藥機制有關[47]。目前，Rv0678基因突變導致低水平耐藥對治療結果的影響尚不清楚[42]。一些臨床研究顯示，出現(xiàn)Rv0678突變的患者臨床結局較差，但研究患者數(shù)量較少[23, 30, 42]。在對準廣泛耐藥結核病和XDR-TB患者給予Bdq和Cfz治療時，因交叉耐藥機制的存在，需要警惕治療過程中Bdq耐藥性的出現(xiàn)[50]。為了提高對Bdq和Cfz表型-基因型相關性的認識，需要全面報告基因型和表型數(shù)據(jù)，以及治療結果的信息，特別是藥物治療失敗的患者。

表2 貝達喹啉和氯法齊明的基因突變位點

Rv2535c：Rv2535c是一種脯氨酸特異性氨基肽酶，與大腸埃希菌中的PepP、乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌中的PapA(YqhT)具有同源性[33]。Rv2535c的點突變是在使用Bdq治療的小鼠中被選擇出來的[33]。與外排泵抑制劑聯(lián)用時, Bdq的MIC值出現(xiàn)下降說明藥物外排可能參與耐藥的機制，但其作用機制可能與Rv0678的突變導致的外排泵高表達不同，Rv2535c突變可能通過不同的方式增加該轉(zhuǎn)運體的外排，如防止mmpL5的降解，因其在氨基端附近包含一個Val-Pro-Pro延伸[33]。Rv2535c基因突變位點目前有6種[19, 33, 51](表2)。Rv2535c突變會使Bdq和Cfz的MIC值均略有增加(4倍)。當菌株出現(xiàn)Rv2535c基因突變，并沒有導致Bdq和Cfz完全耐藥，可以通過增加藥物劑量獲得更好的抗結核作用[33]。Ioerger 等[51]在MDR-TB和XDR-TB患者中發(fā)現(xiàn)Rv2535c基因突變，氨基酸突變類型為Ser66Pro。但Xu等[24]和Liu等[23]的研究表明，Cfz耐藥的臨床分離株中沒有發(fā)現(xiàn)Rv2535c基因突變，說明Rv2535c基因突變主要參與Bdq和Cfz交叉耐藥，并不是Cfz的耐藥機制。Liu等[23]研究也表明，在沒有已知耐藥靶點突變的情況下，Bdq治療后存在Cfz獲得性耐藥，表明可能存在其他交叉耐藥的機制，仍需要對這2個分離株進行全基因組測序分析，以確定新的耐藥機制。

4. 其他分枝桿菌有關Bdq和Cfz交叉耐藥的相關基因：(1)MAB2299c基因：MAB2299c基因編碼TetR轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，MAB2299c的點突變或缺失可導致外排泵基因MmpS/MmpL轉(zhuǎn)錄上調(diào)相關導致膿腫分枝桿菌對Bdq與Cfz的交叉耐藥，會使Bdq與Cfz的MIC值升高2～8倍[52]。(2)mmpT5基因：mmpT5基因的突變與Bdq耐藥相關，該基因調(diào)控鳥分枝桿菌復合群的MmpS5/MmpL5操縱子。該靶點發(fā)生突變時，也會導致藥物外排增加[53]。

四、Bdq和Cfz血藥濃度與耐藥相關性

長期治療方案中的藥物劑量不足或間斷用藥，導致藥物濃度不達標會成為耐藥性突變的一個主要決定因素。半抑菌藥物劑量已被證明可以促進結核分枝桿菌對藥物產(chǎn)生耐受性[55]。若結核病患者的治療方案中只對單一藥物敏感，將選擇出對該藥物耐藥的少量細菌繼續(xù)生存下去，最終導致治療失敗和復發(fā)[3]。Bdq是細胞色素P450同工酶3A4的底物，Cfz是細胞色素P450同工酶3A4的體外抑制劑，理論上當Bdq與Cfz同時給藥時，兩者間可能存在藥代動力學的相互作用，可能導致Bdq劑量增加，從而增加Bdq的毒性。Maartens等[56]研究表明，Cfz對Bdq藥代動力學相互作用差異沒有統(tǒng)計學意義。糖尿病可能會影響B(tài)dq血藥濃度，從而導致Bdq治療失敗，Gour等[57]臨床前研究表明，給予患有糖尿病小鼠400 mg/d的Bdq治療2周，隨后200 mg/次，3次/周的Bdq劑量治療，與正常小鼠相比，Bdq最大藥物濃度為(259±77) ng/ml，AUC0-24下降38%～40%，但仍需進一步的臨床數(shù)據(jù)來支持這一研究結論。性別和體質(zhì)量會影響B(tài)dq和Cfz的血藥濃度，2021年的研究指出，體質(zhì)量與Bdq和Cfz的藥物濃度參數(shù)相關，性別是Bdq的顯著協(xié)變量，男性的最低藥物濃度相對女性較高[58]。南非的一項研究首次從藥物遺傳學角度闡述了rs776746基因(CYP3A45*3)與Bdq血漿清除速度較慢相關(P=0.0017)，rs75285763基因(CNTN5)與Cfz血漿清除率慢相關，但可能存在偶然性[59]。在一項獲得性Bdq耐藥的報告中顯示，對MDR-TB患者分離的菌株進行全基因組測序發(fā)現(xiàn)，盡管Bdq停用1年，菌株仍可能發(fā)生Rv0678突變[60]，停藥后出現(xiàn)Bdq的耐藥考慮可能與其半衰期長有關[61]。國內(nèi)也有報道指出，在完成Bdq治療的患者中可在停藥52周后檢測到Bdq[62]，這表明在治療結束后，Bdq較長的半衰期可能有利于耐藥人群的選擇。因此，應考慮在治療方案中計劃終止伴隨藥物前4～5個月停用Bdq，以減少或避免作為單一藥物的長期暴露[28]。建立Bdq和Cfz藥代動力學/藥效學(PK/PD)模型將有助于預測療效和降低耐藥性[63]。

五、預防Bdq和Cfz耐藥性的產(chǎn)生

為了更早發(fā)現(xiàn)藥物的耐藥性及預防耐藥的產(chǎn)生，建議采取以下措施：(1)早期發(fā)現(xiàn)藥物的耐藥性是阻止耐藥菌株傳播的關鍵措施，建議在使用這兩種藥物前進行基線MIC值的檢測。世界衛(wèi)生組織強烈呼吁為Bdq開發(fā)準確和可重復的藥物敏感性檢測方法，并建議在沒有特定藥物敏感性試驗的情況下，通過MIC值評估監(jiān)測Bdq的耐藥情況直至培養(yǎng)陰轉(zhuǎn)[28]。連續(xù)對治療過程中的菌株進行全基因測序也有助于將MIC值與耐藥位點相聯(lián)系，并有助于預測藥物的耐藥性；(2)多種有效藥物聯(lián)用(至少4種有效藥物)可以防止藥物耐藥性的產(chǎn)生，新型抗結核藥物和現(xiàn)有抗結核藥物的各種聯(lián)合療法應成為未來研究的重點；(3)監(jiān)測治療期間患者的血藥濃度有助于優(yōu)化治療[64]，同時需要注意與Bdq和Cfz有共同代謝途徑的藥物，例如艾滋病的抗病毒藥物、乙型肝炎的抗病毒藥物等，如果這些藥物與Bdq和Cfz一起使用應監(jiān)測血漿藥物濃度，以確保適當?shù)乃幬镏委?，并盡量減少獲得耐藥性的風險[28]。

六、展望

Bdq與Cfz作為世界衛(wèi)生組織推薦用于治療耐多藥肺結核的A組和B組藥物[3]，是治療MDR-TB的強有力武器。目前，對于Bdq和Cfz的耐藥機制，仍亟待加強研究，如體外誘導的Cfz突變菌株97%具有Rv0678突變[19]，但Cfz臨床耐藥菌株中只有不到40%的分離株存在已知的Cfz耐藥的基因突變，我們?nèi)孕鑼fz耐藥機制進行研究；Rv2535c功能的喪失會導致Bdq和Cfz的交叉耐藥，但具體作用機制目前仍不十分清楚；Rv0678和Rv2535c基因的多樣性對藥物MIC值的影響及治療結局的影響仍需更多的臨床數(shù)據(jù)說明它們之間的聯(lián)系。對于含Bdq和Cfz的治療方案，最重要的問題是對Bdq和Cfz藥物進行耐藥性監(jiān)測(MIC值、全基因組測序)、探索Bdq與Cfz的耐藥新機制，以及評價在藥物治療過程中MIC值的變化與臨床治療療效的關系，能夠?qū)ξ磥黹_發(fā)Bdq和Cfz耐藥快速檢測方法和針對耐藥結核病患者進行個體化治療奠定基礎。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻尚園園：閱讀文獻、撰寫論文；聶文娟：提供基金項目支持；黃海榮：指導內(nèi)容修改；初乃惠：指導綜述選題及評閱修改論文