AHR抑制劑CH223191提高輻照小鼠骨髓移植效果

龐瑞洋，周 力，呂家迪

中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院 免疫學系 醫(yī)學分子生物學國家重點實驗室，北京 100005

造血干細胞移植在臨床上最初用于治療嚴重的造血缺陷疾病以及腫瘤患者放化療后的造血系統(tǒng)重建，目前也是許多自身免疫性疾病和惡性腫瘤的過繼免疫治療手段之一[1]。移植的造血干細胞可以來源于骨髓、臍帶血或外周血，其中骨髓的造血干細胞最為豐富，小鼠骨髓移植實驗也成為了探究造血干細胞分化發(fā)育和移植物抗宿主病的重要研究模型[2]。在小鼠骨髓移植前，需要采用全身輻照(total body irradiation，TBI)清除受體小鼠原有的骨髓細胞及免疫細胞，而全身輻照不僅對受到輻照的小鼠自身細胞造成損傷，非輻照的移植供體細胞也會受到損害，稱為輻射誘導的旁觀者效應(radiation-induced bystander effect，RIBE)，嚴重影響了植入供體細胞的生存和功能以及小鼠骨髓移植效果[3]。

RIBE主要是通過受輻照宿主中產生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)對移植的造血干細胞造成損傷，可以通過調節(jié)ROS的解毒來恢復HSC的再生潛力[4]。芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor，AHR)是一類能夠感受外界環(huán)境中的刺激，并介導胞內轉錄調控的因子，在多種免疫和炎性反應疾病中發(fā)揮重要作用[5]。有多項研究表明AHR與氧化應激反應具有密切聯(lián)系，激活的AHR通過誘導細胞色素P450 1A1(CYP1A1)的表達刺激ROS的產生，造成DNA損傷與細胞凋亡[6]。而CH223191是一種強效特異性的AHR拮抗劑，能夠抑制AHR的核轉位以及AHR與DNA的結合，減少依賴于AHR激活所誘導的ROS生成[7]。

因此，本研究旨在證明小鼠骨髓移植過程中RIBE對供體骨髓細胞和骨髓移植效果的影響，初步探究使用AHR抑制劑CH223191能否實現對供體骨髓細胞的保護，為小鼠骨髓移植模型及臨床患者輻照損傷提供優(yōu)化和治療方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：8 周雌性SPF級C57BL/6小鼠(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所實驗動物中心)；8周雌性SPF級紅色熒光小鼠(actin-IRES-tdTomato)(上海南方模式生物科技股份有限公司)。

1.1.2 主要試劑：Zombie VioletTMFixable Viability Kit (Biolegend公司)；小鼠活性氧簇(ROS)ELISA 檢測試劑盒(酶聯(lián)生物公司)；CellTiter-Glo?發(fā)光法細胞活力檢測試劑盒(Promega公司)；Annexin V-APC 凋亡檢測試劑盒(BD公司)；CellROXTMGreen Reagent(Invitrogen公司)；動物RNA抽提試劑盒(碧云天公司)；反轉錄試劑盒(Applied Biosystems公司); SYBR Green預混液(Bio-Rad公司)；StemSpan SFEM Medium無血清造血干細胞培養(yǎng)基(STEMCELL Technologies公司)。

1.2 方法

1.2.1 骨髓細胞的分離：小鼠脫頸椎處死后，浸泡乙醇消毒，無菌操作分離出小鼠股骨，使用1 mL注射器吸取PBS沖洗出骨髓細胞，過濾后500×g離心5 min，使用紅細胞裂解液裂解紅細胞，再次離心5 min得到沉淀為骨髓細胞。

1.2.2 動物實驗分組及處理：將小鼠分為9 Gy輻照組和12 Gy輻照組，每組6只。小鼠輻照使用生物輻照儀Rad Source RS2000，選擇輻照劑量率為1.209 Gy/min，間隔4 h分兩次進行輻照，每次輻照3 min 43 s的累計劑量即為9 Gy，每次輻照4 min 58 s的累計劑量即為12 Gy。輻照后12 h內每只小鼠尾靜脈移植供體骨髓細胞3×106個，供體骨髓細胞來自紅色熒光小鼠(actin-IRES-tdTomato)，記錄小鼠生存情況。移植后每周1次采集受體小鼠外周血，使用流式細胞儀檢測外周血細胞總數、供體細胞嵌合率和數量，比較不同輻照劑量對骨髓移植的影響。

將骨髓移植小鼠分為CH223191治療組和對照組，每組5只；藥物治療組小鼠骨髓移植前后每兩天腹腔注射CH223191 (10 mg/kg)共8次，對照組腹腔注射藥物溶劑；小鼠間隔4 h分兩次進行12 Gy輻照，輻照后12 h內每只小鼠尾靜脈移植供體骨髓細胞3×106個，記錄小鼠體質量；移植后每周1次采集受體小鼠外周血，使用流式細胞儀檢測供體細胞嵌合率和數量；小鼠骨髓移植1個月后，取受體小鼠股骨，檢測骨髓中供體細胞嵌合率。

1.2.3 分離小鼠血清及ELISA檢測血清ROS：從C57BL/6小鼠眼眶靜脈叢采血，待血液凝固后，3 000 r/min離心10 min，小心吸取上層液體即為血清。使用試劑盒進行ROS檢測，設置標準品孔和樣本孔，分別加入標準品或稀釋后的小鼠血清，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體后37 ℃ 1 h，洗板后加入底物，37 ℃避光孵育15 min，加入終止液后在 450 nm 波長處測定各孔的A值，計算得出血清ROS相對水平。

1.2.4 供體骨髓細胞體外實驗分組和處理：骨髓細胞使用StemSpan SFEM Medium無血清造血干細胞培養(yǎng)基并添加細胞因子進行體外培養(yǎng)。將供體骨髓細胞分為對照組、9 Gy輻照組和12 Gy輻照組，分別于培養(yǎng)基中加入未輻照小鼠血清、9 Gy輻照小鼠血清和12 Gy輻照小鼠血清100 μL，處理24 h后收集細胞檢測。將輻照血清處理的供體骨髓細胞分為DMSO組和CH223191組，CH223191組加入濃度為2 μmol/L的CH223191，DMSO組加入DMSO，處理24 h后收集細胞檢測。

1.2.5 細胞活力的檢測：使用CellTiter-Glo發(fā)光細胞活力測定試劑盒測定細胞活力，該試劑盒基于熒光素酶反應測定活細胞中ATP的量，細胞中ATP的量與細胞活力相關，根據熒光強度即可反映出細胞活力。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡和細胞內ROS：用Annexin V-APC 凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡情況，收集處理后的骨髓細胞1×106個并用PBS清洗2次，100 μL 結合緩沖液重懸，加入5 μL Annexin V-APC和1 μL 7-AAD，室溫避光孵育15 min，加入400 μL結合緩沖液中和，上機檢測；收集處理后的骨髓細胞，100 μL PBS重懸，加入CellROXTMGreen Reagent 0.5 μL，避光37 ℃ 0.5 h，PBS洗3遍后上機檢測。該實驗使用Thermo Fisher公司Attune NxT流式細胞儀，所有數據均采用FlowJo 10.5.3統(tǒng)計分析。

1.2.7 RT-qPCR檢測mRNA：使用RNA抽提試劑盒提取細胞總RNA，使用反轉錄試劑盒將RNA反轉為cDNA，使用SYBR Green 預混液配制相應的PCR反應體系。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 高劑量輻照不利于小鼠骨髓移植

C57小鼠分別經過不同劑量的X線輻照后，未進行骨髓移植小鼠均在6～11 d死亡，進行骨髓移植小鼠均能存活，重建造血系統(tǒng)(圖1A)。輻照后第2天，小鼠外周血細胞總數與未輻照小鼠相比出現明顯下降(P<0.01)，并且12 Gy輻照組小鼠外周血細胞數少于9 Gy輻照組(P<0.05)(圖1B)。然而骨髓移植后1個月內，12 Gy輻照組小鼠外周血供體細胞嵌合率與9 Gy輻照組相比無明顯差異(圖1C)。骨髓移植后第7、14、21天，12 Gy輻照組小鼠外周血供體細胞數明顯少于9 Gy輻照組(P<0.05)(圖1D)。

2.2 輻照小鼠的血清使骨髓細胞活力下降

小鼠經輻照后，血清ROS水平明顯上升， 且12 Gy輻照組血清ROS水平高于9 Gy輻照組(P<0.01)(圖2A)。經輻照小鼠血清處理的供體骨髓細胞活力低于未輻照小鼠血清處理的供體骨髓細胞，并且輻照劑量越大，血清對骨髓細胞活力影響更顯著(P<0.001)(圖2B)。輻照小鼠血清處理的供體骨髓細胞凋亡比例高于對照組，且高劑量輻照組血清處理后，骨髓細胞凋亡比例高于低劑量輻照組，活細胞比例則相反(P<0.05)(圖2C)。

A.survival of transplantation group and control group with different radiation doses; B.peripheral blood cells of mice after irradiation; C.donor cells chimerism rate in peripheral blood of mice after bone marrow transplantation; D.number of donor cells in peripheral blood of mice after bone marrow transplantation; *P<0.01， **P<0.001 compared with control group，#P<0.05 compared with 9 Gy group

2.3 CH223191通過抑制AHR提高骨髓細胞活力

輻照小鼠血清處理的供體骨髓細胞中的AHR下游基因Cyp1a1與Cyp1b1mRNA均升高(P<0.05)(圖3A)。輻照小鼠血清處理的供體骨髓細胞加入CH223191后，Cyp1a1與Cyp1b1mRNA水平降低， AHR激活被抑制(P<0.05)(圖3B)。輻照小鼠血清處理的骨髓細胞加入CH223191處理后，細胞活力明顯高于DMSO組(P<0.001)(圖3C)。CH223191組細胞內ROS水平低于DMSO組(P<0.001)(圖3D)。CH223191組細胞凋亡比例減少，活細胞比例增多(P<0.01)(圖3E)。

2.4 CH223191能夠提高小鼠骨髓移植效果

CH223191治療組小鼠體質量在輻照后第8、15、22天相對于對照組減輕較少(P<0.05)(圖4A)。骨髓移植后1個月內，CH223191治療組小鼠外周血供體細胞嵌合率高于對照組(P<0.05)(圖4B)，外周血供體細胞數明顯多于對照組(P<0.05)(圖4C)。在小鼠骨髓移植1個月后，CH223191治療組小鼠骨髓內供體細胞比例高于對照組，且供體骨髓細胞數比對照組明顯增多(P<0.05)(圖4D)。

A.relative levels of ROS in irradiated mice serum; B.cell viability of bone marrow cells treated with mouse serum measured by ATP cell viability assay; C.apoptosis of bone marrow cells treated with serum from different irradiated mice; *P<0.01,**P<0.001 compared with control group; #P<0.05，##P<0.01，###P<0.001 compared with 9 Gy group

A.expression of AHR,Cyp1a1,Cyp1b1 mRNA in bone marrow cells treated with irradiated mouse serum detected by fluorescence quantitative PCR; B.expression of AHR, Cyp1a1,Cyp1b1 mRNA in bone marrow cells treated with DMSO and CH223191 detected by fluorescence quantitative PCR;C.cell viability of bone marrow cells treated with DMSO and CH223191 measured by ATP cell viability assay; D.levels of ROS in bone marrow cells treated with DMSO and CH223191；E.apoptosis of bone marrow cells treated with DMSO and CH223191; *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 compared with control group

3 討論

在本研究中，接受骨髓移植的小鼠在全身輻照后，自身骨髓細胞與免疫細胞明顯減少，并且更大劑量的輻照具有更明顯的清除效果。而高效的清除效果并不能夠提升骨髓移植后的供體細胞嵌合率，因為移植相同數量的骨髓細胞后，高劑量輻照小鼠體內存活的供體細胞明顯少于低劑量輻照組。在體外檢測輻照小鼠血清中ROS水平時發(fā)現，小鼠經輻照后，血清ROS水平明顯上升，且12 Gy輻照組血清ROS水平高于9 Gy輻照組。未經輻照的供體細胞在體外接受輻照小鼠血清處理后，表現出了細胞活力下降，細胞凋亡增加的現象，原因就在于輻照產生的不利因素如ROS對未經輻照的供體細胞同樣造成損傷。本研究發(fā)現經輻照小鼠血清處理的供體骨髓細胞AHR被激活，AHR激活后通過細胞色素P450在胞內誘導產生更多ROS，胞內的ROS累積嚴重影響HSC的自我更新與分化能力。而CH223191作為AHR特異性拮抗劑，阻斷AHR信號通路后，能夠降低供體細胞內ROS水平，明顯提高了骨髓細胞的活力。在體內骨髓移植實驗中，使用CH223191治療的受體小鼠狀態(tài)和骨髓移植后的供體細胞嵌合率均有一定改善，從而達到了更好的骨髓移植效果。

A.weight of mice treated with CH223191 after bone marrow transplantation; B.donor cells chimerism rate in peripheral blood of mice treated with CH223191 after bone marrow transplantation; C.number of donor cells in peripheral blood of mice treated with CH223191 after bone marrow transplantation; D.proportion and number of donor bone marrow cells in mice treated with CH223191 after bone marrow transplantation; *P<0.05 compared with control group

此外，RIBE在人造血干細胞中同樣得到證明，移植后的人HSC由于氧化應激產生更強的DNA損傷、細胞周期停滯和p53依賴性細胞凋亡[8]。同時，在腫瘤放射治療中，RIBE和輻照的非靶向作用也導致了非輻照組織表觀遺傳功能障礙，DNA損傷和細胞死亡，因此輻射致癌機制也是目前臨床上亟需解決的問題之一[9]。本研究證明CH223191對移植骨髓細胞具有保護作用，還需要進一步研究該結論是否適用于人的造血干細胞以及能否解決臨床造血干細胞移植問題，對于解決腫瘤放射治療中非輻照組織的旁觀者效應也具有潛在的研究意義和應用前景。