吳興兵，楊德國(guó)，楊少榮，朱永久，胡文靜，朱挺兵，李學(xué)梅，孟子豪，何勇鳳

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430223；2.中國(guó)三峽建工(集團(tuán))有限公司，成都 610041)

圓口銅魚(yú)(Coreiusguichenoti)屬鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)鮈亞科(Gobioninae)銅魚(yú)屬(Coreius)，俗稱(chēng)水密子、圓口等，是長(zhǎng)江上游特有魚(yú)類(lèi)[1-2]。圓口銅魚(yú)曾是長(zhǎng)江上游江段主要優(yōu)勢(shì)種和重要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，因受水電工程建設(shè)、過(guò)度捕撈等影響，野生資源急劇衰減，2016年被《中國(guó)脊椎動(dòng)物紅色名錄》列為極危物種，2021年被《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物名錄》列為二級(jí)保護(hù)動(dòng)物(僅限野外種群)[3-5]。實(shí)現(xiàn)圓口銅魚(yú)規(guī)?；斯し庇?，進(jìn)行人工增殖放流成為保護(hù)和恢復(fù)其種群資源的必然選擇之一。

2010年以來(lái)，多家單位開(kāi)展了圓口銅魚(yú)人工繁殖技術(shù)研究，直至2013年才開(kāi)始獲得突破性進(jìn)展[6-7]。圓口銅魚(yú)人工繁殖主要技術(shù)難點(diǎn)是應(yīng)激反應(yīng)、親魚(yú)性腺發(fā)育和病蟲(chóng)害。親魚(yú)的營(yíng)養(yǎng)狀況對(duì)雌魚(yú)產(chǎn)卵量、卵子質(zhì)量有較大影響，進(jìn)而影響到受精率和孵化率等，對(duì)親魚(yú)進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化有助于提高其繁殖性能[8-9]。較高的飼料蛋白水平有利于卵黃蛋白原合成，促進(jìn)魚(yú)類(lèi)性腺發(fā)育[10]。常規(guī)高蛋白配合飼料的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通常是為了滿(mǎn)足魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)需要，但難以完全滿(mǎn)足性腺正常發(fā)育需要[11]。因此，在投喂較高蛋白含量配合飼料的同時(shí)，針對(duì)性添加其他的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或者輔以天然餌料是親魚(yú)培育的常用手段。

圓口銅魚(yú)是以肉食性為主的雜食性魚(yú)類(lèi)，其食物種類(lèi)中淡水殼菜等動(dòng)物餌料占較大比例[15]。在日糧中添加脂肪酸、維生素E、卵磷脂和動(dòng)物餌料可提高水產(chǎn)動(dòng)物繁殖性能[11-14]。因此，為突破圓口銅魚(yú)人工養(yǎng)殖條件下性腺發(fā)育難關(guān)，本研究以高蛋白配合飼料作為基礎(chǔ)日糧，通過(guò)向基礎(chǔ)日糧中添加魚(yú)油、維生素E、卵磷脂及附加投喂動(dòng)物餌料等方式，進(jìn)行圓口銅魚(yú)親魚(yú)培育實(shí)驗(yàn)，研究了飼料中不同營(yíng)養(yǎng)源對(duì)圓口銅魚(yú)親魚(yú)生長(zhǎng)發(fā)育的影響，以期為圓口銅魚(yú)規(guī)?；斯し庇陀H魚(yú)飼料配制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚(yú)和實(shí)驗(yàn)條件

實(shí)驗(yàn)用圓口銅魚(yú)收集自長(zhǎng)江瀘州江段，人工馴養(yǎng)3年以上，年齡≥5齡，均為成熟個(gè)體，規(guī)格整齊、無(wú)病無(wú)傷。

實(shí)驗(yàn)在室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行。循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)水體總體積60 m3，養(yǎng)殖桶16個(gè)，單個(gè)養(yǎng)殖桶直徑1.98 m、水深70～75 cm、進(jìn)水口流量3.0～3.2 m3/h。

實(shí)驗(yàn)期間水溫8～23 ℃、pH 7.43～8.73、溶氧9.15～12.97 mg/L、氨氮0.03～0.16 mg/L、亞硝酸鹽氮0.003～0.026 mg/L。

1.2 實(shí)驗(yàn)飼料及添加物

實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)日糧為商品膨化飼料，粗蛋白42%、粗脂肪5.2%、灰分16.4%、水分12.1%。魚(yú)油為商品飼用魚(yú)油，EPA+DHA含量≥20%。卵磷脂為商品改性大豆磷脂(有效物質(zhì)含量95%)。黃粉蟲(chóng)(Tenebriomolitor)為鮮活個(gè)體。螺肉為新鮮去殼中華圓田螺肉，冷凍保存時(shí)間不超過(guò)5 d。

魚(yú)油、卵磷脂、維生素E(VE)采用噴灑法拌于基礎(chǔ)日糧中，干燥后投喂[16]。魚(yú)油、卵磷脂、維生素E添加量以基礎(chǔ)日糧日投喂量為基準(zhǔn)進(jìn)行計(jì)算(質(zhì)量比)。黃粉蟲(chóng)、螺肉在投喂基礎(chǔ)日糧時(shí)投喂，投喂量為基礎(chǔ)日糧日投喂量(質(zhì)量)的25%。

基礎(chǔ)日糧、拌有卵磷脂等物質(zhì)的飼料每天采用表觀飽食法投喂2次(8:30-9:30，21:00-22:00)，日投喂量根據(jù)魚(yú)體重計(jì)算，每次投喂量為日投喂量的1/2，并根據(jù)攝食情況和水溫變化及時(shí)調(diào)整，以實(shí)驗(yàn)魚(yú)飽食且無(wú)剩餌為準(zhǔn)。黃粉蟲(chóng)、螺肉每天8:30投喂。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)分A、B、C三組進(jìn)行。A組添加魚(yú)油、卵磷脂、黃粉蟲(chóng)，設(shè)置4個(gè)實(shí)驗(yàn)組(A1、A2、A3、A4)和1個(gè)對(duì)照組(A0)，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2015年7月31日-2016年5月24日。B組添加維生素E，設(shè)置2個(gè)實(shí)驗(yàn)組(B1、B2)和1個(gè)對(duì)照(B0)，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2015年7月31日-2016年5月24日。C組添加卵磷脂、維生素E和螺肉，設(shè)置2個(gè)實(shí)驗(yàn)組(C1、C2)和1個(gè)對(duì)照(C0)，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2016年9月28日-2017年5月23日。具體設(shè)置詳見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)分組情況Tab.1 The experimental grouping

1.4 親魚(yú)成熟度判斷標(biāo)準(zhǔn)

雄魚(yú)成熟度采用精子活力觀察法判斷。取精子于顯微鏡下觀察精子活力，當(dāng)精子快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間≥10 s時(shí)認(rèn)定為成熟精子，其個(gè)體為成熟雄魚(yú)。

雌魚(yú)成熟度采用親魚(yú)外部特征和挖卵相結(jié)合的方法判斷。腹部膨大，卵巢輪廓明顯，生殖孔變紅；卵粒大小整齊、飽滿(mǎn)，經(jīng)魚(yú)卵透明液處理后，全部或大部分卵核出現(xiàn)偏位的認(rèn)定為成熟卵，其個(gè)體為成熟雌魚(yú)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，測(cè)定實(shí)驗(yàn)魚(yú)體長(zhǎng)、體重，統(tǒng)計(jì)各組實(shí)驗(yàn)魚(yú)數(shù)量、成熟雌魚(yú)數(shù)量、成熟雄魚(yú)數(shù)量，計(jì)算肥滿(mǎn)度(CF)、特定生長(zhǎng)率(SCR)、成熟率(MR)、成活率(SR)。相關(guān)計(jì)算公式如下：

肥滿(mǎn)度(CF)=W/L3×100

特定生長(zhǎng)率(SCR)=(lnW1-lnW0)/D×100%

成熟率(MR)=N1/N2×100%

成活率(SR)=N3/N0×100%

式中：W、L分別為實(shí)驗(yàn)魚(yú)體重(g)和體長(zhǎng)(cm)；W0、W1分別為實(shí)驗(yàn)魚(yú)起始、結(jié)束時(shí)的體重(g)；D為實(shí)驗(yàn)時(shí)間(d)；N1、N2分別為實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)成熟雌(雄)魚(yú)的數(shù)量(尾)和成活雌(雄)魚(yú)的數(shù)量(尾)。N3為實(shí)驗(yàn)魚(yú)終末數(shù)量(尾)，N0為實(shí)驗(yàn)魚(yú)初始數(shù)量(尾)。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0和Microsoft Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)檢驗(yàn)各組之間的差異顯著性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，顯著性水平定義為0.05。

2 結(jié)果

2.1 添加魚(yú)油、卵磷脂和黃粉蟲(chóng)對(duì)圓口銅魚(yú)親魚(yú)生長(zhǎng)與性腺發(fā)育的影響

經(jīng)過(guò)300 d養(yǎng)殖，各組實(shí)驗(yàn)魚(yú)成活率為100%。從生長(zhǎng)指標(biāo)看，卵磷脂組和組合組特定生長(zhǎng)率最低，魚(yú)油組最高。卵磷脂組肥滿(mǎn)度最低，黃粉蟲(chóng)組最高，魚(yú)油組和對(duì)照組次之(表1)。各組雄魚(yú)成熟率為100%，組合組(基礎(chǔ)日糧+5%魚(yú)油+2%卵磷脂+黃粉蟲(chóng))和卵磷脂組雌魚(yú)成熟率高于對(duì)照組(表2)。

表2 添加魚(yú)油、卵磷脂和黃粉蟲(chóng)對(duì)圓口銅魚(yú)親魚(yú)生長(zhǎng)與成熟率的影響Tab.2 Growth，survival rate and gonadal development of C.guichenoti fed diets adding fish oil，lecithin or T.molitor(L.)

2.2 添加維生素E對(duì)圓口銅魚(yú)親魚(yú)生長(zhǎng)與性腺發(fā)育的影響

經(jīng)過(guò)300 d養(yǎng)殖，各組實(shí)驗(yàn)魚(yú)成活率均在90%以上。添加0.1%維生素E組、添加0.2%維生素E組和基礎(chǔ)日糧組實(shí)驗(yàn)魚(yú)末體質(zhì)量、肥滿(mǎn)度均無(wú)較大的差異。各實(shí)驗(yàn)組特定生長(zhǎng)率隨著維生素E添加量呈現(xiàn)升高趨勢(shì)(表2)。各組雄魚(yú)成熟率為100%，添加0.1%維生素E組、添加0.2%維生素E組雌魚(yú)成熟率均高于基礎(chǔ)日糧組(表3)。

表3 添加維生素E對(duì)圓口銅魚(yú)親魚(yú)生長(zhǎng)與成熟率的影響Tab.3 Growth，survival rate and gonadal development of C.guichenoti fed diets adding vitamin E

2.3 添加卵磷脂、維生素E和螺肉對(duì)圓口銅魚(yú)生長(zhǎng)與性腺發(fā)育的影響

經(jīng)過(guò)240 d養(yǎng)殖，C0組(對(duì)照組)和C1組(基礎(chǔ)日糧+0.2%維生素E+2%卵磷脂)實(shí)驗(yàn)魚(yú)成活率分別為(92.80±4.59)%、(92.93±9.74)%，C2組(基礎(chǔ)日糧+0.2%維生素E+2%卵磷脂+螺肉)因2個(gè)養(yǎng)殖桶(平行組)實(shí)驗(yàn)魚(yú)實(shí)驗(yàn)期間患病，成活率為(78.79±10.93)%，不過(guò)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組成活率無(wú)顯著差異。各組肥滿(mǎn)度、增重率和特定生長(zhǎng)率均無(wú)顯著差異(表4)。

各組雄魚(yú)成熟率為100%，雌魚(yú)成熟情況呈現(xiàn)組間差異。C1組和C2組雌魚(yú)成熟率均顯著高于對(duì)照組，C1、C2組之間無(wú)顯著差異(表4)。

表4 添維生素E、卵磷脂和螺肉對(duì)圓口銅魚(yú)親魚(yú)生長(zhǎng)與成熟率的影響Tab.4 Growth，survival rate and gonadal development of C.guichenoti fed diets adding lecithin，vitamin E or C.cathayensis meat

3 討論

卵磷脂為甘油磷脂混合物，在卵巢發(fā)育過(guò)程中對(duì)脂類(lèi)物質(zhì)從肝胰腺經(jīng)血淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)到卵巢起著重要作用[17]。有研究表明，維生素E能有效去除體內(nèi)各種有害自由基，保證卵膜結(jié)構(gòu)完整性和卵中DNA不被氧化破壞，從而改善親魚(yú)繁殖性能[18]；在施氏鱘飼料中添加2%的卵磷脂，可提高施氏鱘后備親魚(yú)血清E2和Vg濃度，從而改善施氏鱘親魚(yú)的繁殖性能[19]；在真鯛(Pagrusmajor)飼料中維生素E的添加量達(dá)到2 000 mg/kg時(shí)，親魚(yú)的浮卵率、孵化率和正常仔魚(yú)的比例顯著提高[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，在基礎(chǔ)日糧中單獨(dú)添加2%卵磷脂、0.1%VE、0.2%VE，雌性圓口銅魚(yú)成熟率均高于僅投喂基礎(chǔ)日糧。組合添加2%卵磷脂與0.2%VE時(shí)，圓口銅魚(yú)雌魚(yú)成熟率顯著高于基礎(chǔ)日糧組(P<0.05)。這說(shuō)明在基礎(chǔ)日糧中單獨(dú)或組合添加卵磷脂和VE均對(duì)圓口銅魚(yú)性腺發(fā)育有促進(jìn)作用。

圓口銅魚(yú)是一種應(yīng)激性極強(qiáng)的魚(yú)類(lèi)，其應(yīng)激反應(yīng)嚴(yán)重影響了其人工馴養(yǎng)和繁殖等工作的開(kāi)展[7]。應(yīng)激會(huì)影響水產(chǎn)動(dòng)物內(nèi)分泌與繁殖行為[21]。卵磷脂和VE都有緩解魚(yú)類(lèi)應(yīng)激反應(yīng)，增強(qiáng)適應(yīng)能力的作用[22-23]。這也是在基礎(chǔ)日糧中添加卵磷脂和VE可促進(jìn)圓口銅魚(yú)親魚(yú)性腺發(fā)育的原因之一。

魚(yú)油富含DHA和EDA，對(duì)魚(yú)類(lèi)性腺發(fā)育有促進(jìn)作用[24]。本研究中單獨(dú)添加魚(yú)油并未能獲得成熟雌魚(yú)，在添加卵磷脂、黃粉蟲(chóng)的同時(shí)添加魚(yú)油相對(duì)單獨(dú)添加卵磷脂也未能獲得顯著效果，這可能與魚(yú)油的添加量有關(guān)。張燕萍等[25]發(fā)現(xiàn)在黃鱔親本培育過(guò)程中，魚(yú)油在飼料中添加量過(guò)高(4%和6%)會(huì)降低蛋白質(zhì)利用效率，造成雌鱔性腺發(fā)育變緩，絕對(duì)懷卵量減少。李仰真等[11]用沙蠶等鮮活餌料對(duì)半滑舌鰨親魚(yú)進(jìn)行強(qiáng)化培育，獲得良好產(chǎn)卵效果。本研究顯示在圓口銅魚(yú)親魚(yú)培育過(guò)程中，每天增加投喂25%的動(dòng)物餌料(黃粉蟲(chóng)、螺肉)，相對(duì)其它實(shí)驗(yàn)組并未明顯促進(jìn)親魚(yú)性腺發(fā)育，甚至單獨(dú)在基礎(chǔ)日糧中添加黃粉蟲(chóng)并未獲得成熟雌魚(yú)。這可能與圓口銅魚(yú)食性有關(guān)。圓口銅魚(yú)天然餌料中，螺類(lèi)出現(xiàn)頻率為3.33%，且只出現(xiàn)在春季，而黃粉蟲(chóng)并不是圓口銅魚(yú)天然餌料[15]。由此，有關(guān)魚(yú)油、黃粉蟲(chóng)對(duì)圓口銅魚(yú)性腺發(fā)育是否有影響還需進(jìn)一步探究。

卵磷脂、VE以及動(dòng)物餌料對(duì)魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用[17-18,24]。本研究中，除VE單獨(dú)添加組特定生長(zhǎng)率隨添加量增多而升高外，其他各實(shí)驗(yàn)組圓口銅魚(yú)相對(duì)基礎(chǔ)日糧組并沒(méi)有出現(xiàn)顯著生長(zhǎng)效果。這可能與本研究所用實(shí)驗(yàn)魚(yú)均為成熟個(gè)體，且年齡都在5齡及以上有關(guān)。魚(yú)類(lèi)快速生長(zhǎng)期一般是在性成熟之前和性成熟1～2年，且在性成熟之后所消耗餌料大部分用于性腺發(fā)育及越冬物質(zhì)積累[26]。

本研究表明，在進(jìn)行圓口銅魚(yú)親魚(yú)培育時(shí)，在基礎(chǔ)日糧中單獨(dú)或組合添加卵磷脂與維生素E投喂圓口銅魚(yú)親魚(yú)可顯著提高雌魚(yú)成熟率。