牛佳雯，雒江菡，張雨欣，李 婧，禚 昊

(哈爾濱商業(yè)大學細胞與分子生物學研究所，黑龍江哈爾濱 150076)

月見草(OenotherabiennisL.)為柳葉菜科月見草屬下的一個種，是黑龍江省大慶市大同區(qū)典型的道地藥材，大同區(qū)自然環(huán)境、土壤優(yōu)勢非常適宜月見草生長，藥材品質(zhì)好、有效成分含量高[1]，月見草被譽為“皇室御藥”，可治療多種疾病，在調(diào)節(jié)血液中類脂物質(zhì)，對高膽固醇、高血脂引起的冠狀動脈栓塞、粥樣硬化及腦血栓等癥有顯著療效，是最有開發(fā)前景的物種之一[2-4]。目前國內(nèi)月見草種植已形成規(guī)模，其生態(tài)價值、藥用和保健價值已被人們逐漸所認識。目前，從月見草的葉、根、莖、種子中已分離得到多種類型的化合物，主要為黃酮類化合物、萜類化合物、揮發(fā)油、鞣質(zhì)和多酚等[5]。對于這些成分的提取也有相對較成熟的工藝方法，但是對于月見草多酚提取的研究相對較少。多酚類物質(zhì)具有很強的抗菌、抗氧化活性，能夠預(yù)防糖尿病和心血管疾病、抑制癌細胞增殖等生理功能[6-9]。該研究采用單因素試驗考察浸提溫度、提取時間、料液比和乙醇濃度對總多酚提取量的影響，采用正交試驗優(yōu)化月見草總多酚的提取工藝，以期為今后月見草的開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1試材。月見草，黑龍江省大慶市大同區(qū)典型的道地藥材。沒食子酸標準品(純度≥98%)，250 mg/瓶，北京萬佳標準物質(zhì)研發(fā)中心；福林酚試劑，100 mL/瓶，北京萬佳標準物質(zhì)研發(fā)中心；無水乙醇，500 mL/瓶，天津市天力化學試劑有限公司；無水碳酸鈉，500 g/瓶，天津市致遠化學試劑有限公司。

1.1.2儀器。高速多功能粉碎機，天津泰斯特儀器有限公司；電子分析天平，賽多利斯(上海)貿(mào)易有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州市恒久儀器制造有限公司；紫外可見分光光度計，上海譜元儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1沒食子酸標準曲線的繪制。稱取沒食子酸標準品0.025 g，加入蒸餾水溶解，用500 mL容量瓶定容，得質(zhì)量濃度0.05 mg/mL沒食子酸標準溶液。準確量取0、0.10、0.20、0.30、0.50、0.80、1.00 mL的沒食子酸標準溶液，將標準液分別放在50 mL棕色容量瓶中，加入4 mL福林酚試劑，搖勻，加入4 mL的10%Na2CO3溶液，充分混勻后定容，室溫靜置反應(yīng)1 h，于765 nm波長處測吸光度，不加沒食子酸標準溶液為空白對照組。以標準液沒食子酸的質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線[10]。月見草總多酚提取量(mg/g)=標準曲線計算的總多酚濃度×提取液定容的體積/月見草藥材質(zhì)量。

1.2.2單因素試驗。

1.2.2.1浸提溫度對月見草總多酚提取量的影響。精密稱定5份1.0 g月見草粉末，置100 mL圓底燒瓶中，加70%乙醇30 mL，在50、60、70、80、90 ℃水浴鍋提取3 h，抽濾，加入適量蒸餾水定容至50 mL。從5支具塞試管中精密吸取5 mL濾液，分別置25 mL具塞試管中，編號1～5，加70%乙醇稀釋并定容至刻度，搖勻。再從這5 支試管中分別取出溶液適量放于比色皿中，空白對照選用70%乙醇，在765 nm處測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算月見草總多酚提取量，考察浸提溫度對月見草總多酚提取量的影響。

1.2.2.2乙醇濃度對月見草總多酚提取量的影響。精密稱定5份1.0 g月見草粉末，置100 mL圓底燒瓶中，加30 mL 60%、70%、80%、90%、100%乙醇，70 ℃水浴鍋提取3 h，抽濾，加適量蒸餾水定容至50 mL。從5支具塞試管中精密吸取濾液5 mL，分別置25 mL具塞試管中，編號16～20，加相應(yīng)乙醇稀釋并定容至刻度，且搖勻。再從這5支試管中分別取出溶液適量放于比色皿中，空白對照選用相應(yīng)濃度的乙醇，在765 nm處測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算月見草總多酚的提取量，考察乙醇濃度對月見草總多酚提取量的影響。

1.2.2.3料液比對月見草總多酚提取量的影響。精密稱定5份1.0 g月見草粉末，置100 mL圓底燒瓶，加10、20、30、40、50 mL 70%乙醇，70 ℃水浴鍋提取3 h，抽濾，加蒸餾水，并定容至50 mL。從5 支具塞試管中精密吸取濾液5 mL，分別置25 mL具塞試管中，編號11～15，向各試管中加80%乙醇稀釋并定容至刻度，且搖勻。再從這5 支試管中分別取出溶液適量于比色皿中，空白對照選用70%乙醇，在765 nm處測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算月見草總多酚提取量，考察料液比對月見草總多酚提取量的影響。

1.2.2.4提取時間對月見草總多酚提取量的影響。精密稱定5份1.0 g月見草粉末，置100 mL圓底燒瓶，加70%乙醇30 mL，70 ℃水浴鍋提取1、2、3、4、5 h，抽濾，向抽濾液中加入適量蒸餾水，并定容至50 mL。從5支具塞試管中精密吸取濾液5 mL，分別置25 mL具塞試管中，編號6～10，加70%乙醇稀釋并定容至刻度，并搖勻。再從這5支試管中分別取出適量的溶液放于比色皿，空白對照選用70%乙醇，在765 nm處測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算月見草總多酚提取量，考察提取時間對月見草總多酚提取量的影響。

1.2.3正交試驗設(shè)計。在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取浸提溫度、提取時間、料液比、乙醇濃度4個變量為參考因素，選出對試驗影響較大的3個水平，進行4因素3水平正交試驗設(shè)計，正交試驗因素水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸標準曲線的繪制根據(jù)“1.2.1”中的線性關(guān)系考察配制溶液后，采用紫外分光光度法于765 nm波長處測定吸光度。以標準液沒食子酸的質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線(圖1)，得出回歸方程為y=7.009 7x+0.004 8(R2=0.999 3)。

圖1 沒食子酸標準曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

2.2 單因素試驗

2.2.1浸提溫度對月見草總多酚提取量的影響。從圖2可以看出，隨著浸提溫度的升高，總多酚提取量呈現(xiàn)出先升高后逐漸降低的趨勢。在浸提溫度為80 ℃時，月見草總多酚提取量達到最大值。這是由于隨著浸提溫度的提高，乙醇分子作為溶劑，運動速度加快，與月見草接觸充分，加大月見草總多酚溶出量，但當溫度超過80 ℃以后，高溫使提取物總多酚發(fā)生氧化，從而使月見草總多酚提取量降低，因此，提取的最佳浸提溫度為80 ℃。

圖2 浸提溫度對月見草總多酚提取量的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on total polyphenol extraction amount of Oenothera biennis

2.2.2乙醇濃度對月見草總多酚提取量的影響。從圖3可以看出，隨著乙醇濃度的提高，月見草總多酚提取量呈現(xiàn)出先升高后平穩(wěn)的趨勢。當乙醇濃度由60%增加至70%時，總多酚提取量明顯提高，但當乙醇濃度超過70%以后，隨著乙醇濃度的增加，提取量變化不大。主要是因為溶劑濃度越高，溶劑傳質(zhì)推動力越大，浸提效果越好；但使用過多的提取劑，會導(dǎo)致后續(xù)提取劑的回收成本及耗能增加，使經(jīng)濟效益下降，污染物的排放也會增加，所以，應(yīng)該選擇合適的提取劑濃度。根據(jù)以上分析，確定提取的最佳乙醇濃度為70%。

圖3 乙醇濃度對月見草總多酚提取量的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on total polyphenol extraction amount of Oenothera biennis

2.2.3料液比對月見草總多酚提取量的影響。從圖4可以看出，隨著料液比的降低，月見草總多酚提取量呈現(xiàn)出先升高后平穩(wěn)的趨勢。料液比為1∶30時，總多酚提取量最大，超過1∶30以后總多酚提取量趨于穩(wěn)定。這主要是由于1∶30 的料液比就能較充分地提取月見草中的多酚類物質(zhì)，即使溶劑量增加，總多酚提取量未見明顯提高，反倒給后續(xù)的活性物質(zhì)分離純化及溶劑回收帶來麻煩，成本增加。因此，確定提取的最佳料液比為1∶30。

圖4 料液比對月見草總多酚提取量的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on total polyphenol extraction amount of Oenothera biennis

2.2.4提取時間對月見草總多酚提取量的影響。從圖5可以看出，隨著提取時間的延長，月見草總多酚提取量呈現(xiàn)出先升高而后逐漸降低的趨勢。當提取時間為4 h時，總多酚提取量最大，之后由于提取時間的延長，浸提液中多酚類物質(zhì)長時間與空氣接觸，發(fā)生氧化作用，從而導(dǎo)致總多酚提取量降低，但提取時間由3 h 延長至4 h以后，總多酚提取量增加并不明顯?？紤]到節(jié)能原因，并結(jié)合以上分析，確定提取的最佳提取時間為4 h。

圖5 提取時間對月見草總多酚提取量的影響Fig.5 Effect of extraction time on total polyphenol extraction amount of Oenothera biennis

2.3 正交試驗為了進一步優(yōu)化提取工藝條件，在單因素試驗基礎(chǔ)上進行L9(34)正交試驗(表1)。正交試驗結(jié)果與分析如表2所示。從表2可以看出，各因素對月見草總多酚提取量的影響從大到小依次為A>B>D>C，即浸提溫度的影響最大，其次是乙醇濃度、提取時間，料液比的影響最小。方差分析結(jié)果表明，浸提溫度對總多酚提取效果影響顯著，而料液比對多酚提取效果影響并不明顯。試驗得出月見草總多酚的最佳提取工藝為A3B2C2D2，即浸提溫度80 ℃、乙醇濃度70%、料液比1∶30、提取時間3 h，此時，吸光度為0.632，總多酚提取量為4.47 mg/g。

2.4 方法學考察

2.4.1精密度試驗。用移液管吸取1.0 mL沒食子酸配制的對照品溶液，置于25 mL具塞試管中，向其中加入95%乙醇溶液定容至刻度并振蕩搖勻，用紫外分光光度計在765 nm處重復(fù)測定吸光度6次，計算得出其RSD為0.13%，表明精密度良好。

表1 正交試驗因素和水平Table 1 Orthogonal test factors and levels

表2 正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test

2.4.2穩(wěn)定性試驗。移液管取同一供試品溶液1.0 mL，置于25 mL具塞試管中，加100%乙醇定容。分別經(jīng)過0、1、2、3、4、5 h后，采用紫外分光光度計在765 nm處分別測定吸光度，每次測定需重復(fù)操作3次，計算得出其RSD為0.98%，表明樣品溶液在5 h內(nèi)檢測穩(wěn)定。

2.4.3重復(fù)性試驗。取同一批1.0 mL月見草總多酚提取液5份，按“1.2.1”方法制備供試品溶液，765 nm處測定吸光度，計算吸光度平均值為0.630，總多酚提取量為4.46 mg/g，表明該試驗重復(fù)性良好。

3 結(jié)論

該研究通過單因素試驗和正交試驗確定了月見草總多酚提取的最佳工藝：浸提溫度80 ℃、乙醇濃度70%、料液比1∶30、提取時間3 h，此時，吸光度為0.632，總多酚提取量為4.47 mg/g；通過精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復(fù)性試驗3種方法學考察，驗證了該試驗的重復(fù)性良好，該試驗結(jié)果可為植物中多酚類化合物的提取奠定一定的理論基礎(chǔ)。