UPLC-MS/MS方法評(píng)估人對(duì)食物中雜環(huán)胺的攝入

楊婉琪，彭利娟*，王亞南，李青，陳季旺，吳波

（1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，農(nóng)產(chǎn)品加工與轉(zhuǎn)化湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430023）（2.南京醫(yī)科大學(xué)姑蘇學(xué)院，蘇州市立醫(yī)院，南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院，江蘇蘇州，215002）

雜環(huán)胺（HAAs）是魚肉、紅肉、禽肉等高蛋白食物在熱加工過程中以及一些煙草在燃燒時(shí)產(chǎn)生的一類多環(huán)芳香族化合物，對(duì)于人類及鋸齒類動(dòng)物具有致癌和致突變性。迄今為止已分離出了 20種食源性HAAs[1]。一些流行病學(xué)研究報(bào)告顯示，頻繁食用熟肉與結(jié)直腸癌、胰腺癌和前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)升高之間存在一定關(guān)聯(lián)[2-5]。由于人們的飲食結(jié)構(gòu)和飲食習(xí)慣存在差異，且食物種類、烹制方式、加工時(shí)間、外源添加物等對(duì)熟肉中HAAs的含量影響極大[6-9]。目前無法對(duì)長期攝入的HAAs進(jìn)行有效地定量評(píng)估，因而熟肉中產(chǎn)生的HAAs與癌癥風(fēng)險(xiǎn)之間的聯(lián)系也一直難以確定。目前常見的生物標(biāo)記物有HAAs在尿液中的代謝物、毛發(fā)中的HAA、DNA-HAA加合物和蛋白質(zhì)-HAA加合物，但尿液中的代謝物反應(yīng)HAAs攝入周期有限，而毛發(fā)中的HAAs易受化學(xué)劑影響，DNA又具有自我修復(fù)能力。近年來，通過確立穩(wěn)定的、長期的生物標(biāo)記物對(duì)HAAs的攝入進(jìn)行定量評(píng)估，以研究HAAs與癌癥風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系備受期待。

2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并[4,5-b]吡啶（PhIP）是煎烤紅肉過程中產(chǎn)生最多的HAAs[10]。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）早已將PhIP定義為潛在人類致癌物（2B級(jí)）[11]。人體內(nèi)的PhIP在細(xì)胞色素P450的作用下N-羥基化，再經(jīng)II期酶的進(jìn)一步激活產(chǎn)生nitrenium離子，然后與DNA反應(yīng)誘發(fā)變異；N-羥基化的 PhIP代謝物（HONH-PhIP）也能在細(xì)胞色素P450或過渡金屬的作用下氧化生成 N-亞硝化代謝物（NO-PhIP）。PhIP的N-氧化代謝物能與人血清白蛋白（HSA）34號(hào)位的半胱氨酸殘基（Cys34）結(jié)合形成PhIP-HSA加合物[4,5]（圖1）。其中，PhIP-HSA亞磺酰胺加合物為主要的HSA加合產(chǎn)物，且在酸堿條件下不穩(wěn)定性，易水解產(chǎn)生PhIP。本研究依據(jù) PhIP在人體內(nèi)的代謝途徑，于體外合成PhIP-HSA加合物，通過高靈敏度的超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（UPLC-MS/MS）對(duì)PhIP-HSA加合物水解產(chǎn)物PhIP的定量，進(jìn)而推測人血漿中的PhIP-HSA亞磺酰胺加合物的含量。以期通過人血漿中的PhIP-HSA亞磺酰胺加合物評(píng)估HAAs的攝入與相關(guān)癌癥風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。

圖1 PhIP人體內(nèi)的代謝途徑Fig.1 Metabolic pathway of PhIP in human body

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料

HRP固相萃取小柱（10 mg/1 mL）Pierce白蛋白去除樹脂和Aquasil C18反相柱（2.1×150 mm，3 μm）購自美國Thermo公司。Amicon?Ultra-0.5-10 K超濾離心管購自美國Millipore公司。HiTrap Blue HP（5×1 mL）購自美國Cytiva公司。PD-10柱購自GE公司。

健康人血漿樣本由南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院提供。

1.1.2 試劑

PhIP 及 2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并[4,5-b]吡啶-d3（[2H3]-PhIP，同位素純度99%）購自加拿大Toronto Research Chemicals公司。HSA、水合肼（50%~60%）以及碳負(fù)載鈀催化劑（Pd/C，10%）購自美國 Sigma公司。LC-MS級(jí)甲醇、乙腈、水和甲酸（50%）購自美國 Thermo公司。生物純二甲基亞砜（DMSO）、色譜級(jí)乙酸、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和無水四氫呋喃（THF）購自阿拉丁化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

高效液相色譜采用美國 Thermo UtiMate 3000 UPLC系統(tǒng)，美國Thermo公司的Q Exactive高分辨率質(zhì)譜儀，江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司的MX-S漩渦混勻儀，上?？得魴z驗(yàn)設(shè)備有限公司的MTC-100恒溫混勻儀，上海安亭科學(xué)儀器廠TGL-16C臺(tái)式離心機(jī)，ZLS-1真空離心濃縮儀，Evolution 220掃描型紫外可見分光光度計(jì)。

1.2 方法

1.2.1 人血漿中HSA的提取

1.2.1.1 HiTrap blue柱（1 mL）提取白蛋白

取200 μL 血漿與4 mL A（50 mmol/L KH2PO4，pH值7.0）在15 mL離心管中混勻，然后3 000 r/min離心5 min，取上層清液。上樣前使用10 mL A液平衡HiTrap Blue小柱，然后以1 mL/min的速度上樣。上樣后10 mL A洗脫雜質(zhì)，最后用3 mL B（50 mmol/L KH2PO4，1.5 mol/L KCl，pH值7.0）洗脫HSA，并收集。

1.2.1.2 Pierce白蛋白去除樹脂提取白蛋白

取0.4 mL樹脂液于微量離心柱中，12 000 r/min離心1 min，棄掉廢液。向柱中加入200 μL Tris緩沖液（25 mmol/L Tris，75 mmol/L NaCl，pH值7.5），12 000 r/min離心1 min，棄掉廢液。取40 μL血漿加入柱中，室溫放置2 min后，12 000 r/min離心1 min，棄掉廢液。加入50 μL Tris緩沖液洗脫雜質(zhì)，并重復(fù)四次。最后加入200 μL B，12 000 r/min離心1 min，收集洗脫液。

1.2.1.3 Amicon?Ultra-0.5-10K 脫鹽

將洗脫液移入Amicon?Ultra-0.5-10K超濾離心管中，15 000 r/min離心15 min，棄掉廢液。然后用超純水洗滌樣品2次，15 000 r/min離心15 min，棄廢液。收集超濾離心管里的樣品，40 ℃下真空旋干。

1.2.2 PhIP-HSA亞磺酰胺加合物的酸水解

1.2.2.1 PhIP-HSA加合物的制備

PhIP-HSA亞磺酰胺加合物的制備方法參考文獻(xiàn)并作了一定調(diào)整[12,13]。首先PhIP與NaNO2反應(yīng)生成硝化代謝物（NO2-PhIP）。隨后，以Pd/C為催化劑，通過還原NO2-PhIP合成HONH-PhIP。

取2 mg HSA溶于1 mL10 mM磷酸鉀緩沖液（pH值 7.4），加入 30 nmol HONH-PhIP（HSA：HONH-PhIP的摩爾比=1:1）充分混合?；旌弦?0 ℃下反應(yīng)18 h。反應(yīng)結(jié)束后，使用PD-10柱子去除未反應(yīng)的PhIP代謝物。根據(jù)加合物在 320 nm的吸收對(duì)其進(jìn)行初步定量。

1.2.2.2 PhIP-HSA亞磺酰胺加合物的酸水解

于2 mL離心管中加入75 fmol PhIP-HSA亞磺酰胺加合物和100 fmol [2H3]-PhIP。使用12 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)其鹽酸濃度，然后 37 ℃下反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至~10，再用乙酸乙酯萃取。萃取液真空濃縮至約0.1 mL，加1 mL超純水稀釋。

1.2.2.3 PhIP的固相萃取

HRP固相萃取小柱預(yù)先用1 mL甲醇和1 mL超純水預(yù)洗。樣品以1 mL/min注入HRP小柱上后，2 mL 10%甲醇水溶液洗雜質(zhì)，1 mL的甲醇洗脫P(yáng)hIP并收集。洗脫液真空濃縮至全干。加入30 μL 50% DMSO復(fù)溶。

1.2.3 UPLC-MS/MS的分析

使用美國Thermo公司Hypersil GOLD C18色譜柱（2.1×100 mm，3 μm粒徑）在UltiMate 3000 UPLC系統(tǒng)上對(duì)PhIP進(jìn)行色譜分析。流動(dòng)相A為φ=0.01%甲酸，5%乙腈水溶液；B為0.01%甲酸，95%乙腈。流速設(shè)置為200 μL/min，洗脫梯度：0~1 min 100% A到35% B，6 min到達(dá)100% B，并保持100% B 2 min。

使用高分辨率質(zhì)譜儀Q Exactive（美國Thermo公司）在正電離模式下采集質(zhì)譜。鞘氣流速25 mL/min；輔助氣流速15 mL/min；噴霧電壓3.50 kV；毛細(xì)管溫度設(shè)定為320 ℃。碰撞能為35。監(jiān)測反應(yīng)離子和保留時(shí)間（tR）如下：PhIP（[M+H]+）m/z225.10＞210.09；[2H3]-PhIP（[M+H]+）m/z228.1＞210.09，tR=5.63 min。碎片離子的m/z容差設(shè)置為5×10-6，保留時(shí)間的偏差不超過5%。

1.2.4 方法驗(yàn)證

檢測方法在特異性、回收率、準(zhǔn)確度、精密度和線性方面加以驗(yàn)證。通過監(jiān)測陰性對(duì)照樣品的潛在干擾離子信號(hào)，研究方法的特異性。

取 78 μg/mL的 PhIP標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用φ=50%DMSO 配制 0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10 nmol/L系列濃度的PhIP標(biāo)準(zhǔn)液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

于 300 μL HSA（10 mg）水溶液中，分別加入0.20~200 fmol PhIP，其中未加PhIP的HSA樣品用作陰性對(duì)照。每個(gè)濃度進(jìn)行三次平行試驗(yàn)。于各樣品中加入適量的12 M鹽酸，使其終濃度為0.16 mol/L。37 ℃下水解1 h；反應(yīng)完成后，1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至10，乙酸乙酯萃取。萃取液真空濃縮后，加1 mL超純水進(jìn)行固相萃取，50% DMSO復(fù)溶待測。

1.2.5 PhIP-HSA亞磺酰胺加合物的定量分析

取300 μL HSA（10 mg）水溶液，分別加入0、10、25、50、100、200 fmol PhIP-HSA 加合物和 100 fmol[2H3]-PhIP。0.16 mol/L HCl，37 ℃，水解1 h。經(jīng)乙酸乙酯萃取及固相萃取后，加入30 μL 50% DMSO復(fù)溶。使用UPLC-MS/MS檢測。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

使用Xcalibur 4.0版和Microsoft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。定量分析在選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM）掃描模式下進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 HSA的提取方法對(duì)比

在對(duì)人血漿樣本中HSA的提取對(duì)比發(fā)現(xiàn)，HiTrap Blue親和柱的HSA提取量要稍高于Pierce白蛋白去除樹脂的HSA提取量，大約高8%左右。而回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HiTrap Blue親和柱對(duì)HSA的回收率高于90%，實(shí)驗(yàn)的相對(duì)誤差小于 5%。另外，HiTrap Blue親和柱可以重復(fù)使用，在檢測成本方面要遠(yuǎn)低于Pierce白蛋白去除樹脂。因而在實(shí)際血漿樣品處理時(shí)，選擇使用HiTrap Blue親和柱。

2.2 PhIP-HSA亞磺酰胺加合物的酸水解條件

通過調(diào)整酸水解的鹽酸濃度和反應(yīng)時(shí)間得出優(yōu)化的酸水解條件：鹽酸濃度為0.16 mol/L；反應(yīng)時(shí)間：1 h。在優(yōu)化的條件下，PhIP-HSA亞磺酰胺加合物的水解效率高達(dá)96%，相對(duì)偏差3.30%。重復(fù)性好。

2.3 加標(biāo)回收率

由于未加 PhIP的陰性對(duì)照樣品中沒有檢測到任何干擾信號(hào)，說明該檢測方法具有特異性。樣品中PhIP的量在5~200 fmol（1.12~44.80 pg）時(shí)，其回收率在57%~92%之間（表1）。PhIP的結(jié)構(gòu)中含有苯環(huán)等相關(guān)官能團(tuán)，在塑料離心管及玻璃進(jìn)樣瓶中均會(huì)發(fā)生一定的吸附。因而，當(dāng)樣品中PhIP處于較低含量的范圍時(shí)，PhIP的吸附損耗對(duì)PhIP的回收率的影響隨樣品中PhIP含量的減少而逐步明顯，導(dǎo)致PhIP的回收率隨樣品中 PhIP含量的減少而呈現(xiàn)明顯的下降趨勢。然而，當(dāng)樣品中PhIP的含量接近方法的檢測限時(shí)，儀器的噪音對(duì)PhIP信號(hào)的干擾逐漸增大，PhIP的回收率呈現(xiàn)假增高趨勢。因此，為了提高檢測方法的準(zhǔn)確性，在實(shí)際樣品分析時(shí)，PhIP同位素標(biāo)記的化合物[2H3]-PhIP作為內(nèi)標(biāo)添加到樣品中對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行校正。

表1 加標(biāo)回收率Table 1 Spike recovery

根據(jù)加標(biāo)數(shù)據(jù)繪制 PhIP的校正標(biāo)準(zhǔn)曲線。PhIP的含量與其定量離子的信號(hào)強(qiáng)度（峰面積）呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=149 086x-9 903.2，相關(guān)系數(shù)R2=1。

HiTrap Blue親和柱對(duì)HSA的回收率＞90%，且PhIP-HSA亞磺酰胺加合物的水解效率高達(dá)96%。通過信噪比3（S/N=3）和 10（S/N=10）分別對(duì)血漿中PhIP-HSA亞磺酰胺加合物的檢測限和定量限進(jìn)行估算，檢測限低至 5×10-3fmol/mg HSA，定量限低至1.50×10-3fmol/mg HSA。

2.4 PhIP-HSA亞磺酰胺加合物加合物的定量分析

同日及異日分析的所有樣品中內(nèi)標(biāo)[2H3]-PhIP的回收率均在70%~77%之間，這說明方法的重復(fù)性及精密度均良好。

不同濃度 PhIP-HSA亞磺酰胺加合物樣品的UPLC-MS/MS檢測結(jié)果如表2所示。PhIP-HSA亞磺酰胺加合物的含量與 PhIP的信號(hào)強(qiáng)度呈現(xiàn)線性正相關(guān)，y=1.011 7x+3.256 3，R2=0.998 7，滿足定量分析標(biāo)準(zhǔn)。PhIP-HSA亞磺酰胺加合物的實(shí)際檢測量與理論添加量的誤差均＜13%，在誤差可容范圍內(nèi)。

表2 UPLC-MS/MS檢測PhIP-HSA亞磺酰胺加合物Table 2 Determination of the PhIP-HSA sulfinamide adduct by UPLC-MS/MS

2.5 討論

現(xiàn)有流行病學(xué)研究的數(shù)據(jù)尚不足以對(duì)HAAs攝取與相關(guān)癌癥之間的關(guān)系進(jìn)行有效評(píng)估。食用熟肉后，其中的HAAs通過消化吸收進(jìn)入血液，在酶的作用下經(jīng)系列代謝與HSA結(jié)合形成加合物。因此HAA-蛋白質(zhì)加合物的含量要遠(yuǎn)低于食物中HAAs的含量，因此對(duì)于檢測方法靈敏度的要求要遠(yuǎn)高于檢測食品中HAA的檢測要求。通過選擇穩(wěn)定、可長期存在的HAAs生物標(biāo)記物來對(duì)飲食攝入的HAAs進(jìn)行定量，將有助于癌癥風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估。目前，在研究的HAAs生物標(biāo)記物較多，包括尿液中HAAs的相關(guān)代謝物、毛發(fā)中沉積的HAAs、HAAs與DNA形成加合物以及HAAs的蛋白質(zhì)加合物等[14-16]。從理論上來說，選擇標(biāo)靶組織中 HAA-DNA加合物作為生物標(biāo)記物評(píng)估HAAs的致癌風(fēng)險(xiǎn)最為直觀合理。但對(duì)此類HAA-DNA加合物的研究極大地受限于人體活檢標(biāo)本的采集。血漿中HSA含量高3.40~5.40 g/dL，在長期攝入HAAs的情況下，血漿中形成的HAA-HSA加合物可能會(huì)在 HSA的生命周期內(nèi)進(jìn)行積累。因此人血中HAA-HSA加合物可能相對(duì)容易進(jìn)行定量檢測。

使用加速器質(zhì)譜技術(shù)檢測PhIP-HSA加合物的研究發(fā)現(xiàn)，攝入70~84 μg PhIP（相當(dāng)于175 g的熟雞肉的PhIP量）的24 h后，人血中每毫克HSA所含的加合物量在飛摩爾級(jí)（fmol）水平最高可達(dá)到20.81 fmol PhIP/mg HSA[17]。Bellamri等[10]的研究也發(fā)現(xiàn)，隨著熟肉攝入的增加，人血中PhIP-HSA加合物的含量顯著增加。同時(shí)，隨著熟肉的持續(xù)食用，人血中PhIP-HSA加合物有一定程度的積累。本研究通過優(yōu)化血漿中蛋白質(zhì)的提取方法和酸水解條件等手段，建立了高靈敏度的血漿中PhIP-HSA亞磺酰胺加合物的 UPLC-MS/MS方法。方法在一定程度節(jié)省檢測成本及檢測時(shí)間的同時(shí)，可以對(duì)人血中高于5×10-3fmol/mg HSA濃度的PhIP-HSA亞磺酰胺加合物進(jìn)行有效檢測，比文獻(xiàn)檢測方法的靈敏度提高了7~8倍[10]。考慮到目前血漿樣本的取樣量僅200 μL，如果適當(dāng)增加血漿的用量至1 mL，PhIP-HSA亞磺酰胺加合物的檢測限應(yīng)該可以再降低5倍。在研究食物致癌物HAAs與相關(guān)癌癥風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系時(shí)，使用該方法評(píng)估常食用熟肉的健康人及腸癌患者的HAAs攝入是較為可行的。

3 結(jié)論

本研究采用 UPLC-MS/MS技術(shù)，建立了食物致癌物HAAs與HSA形成的亞磺酰胺加合物的準(zhǔn)確、高靈敏度檢測方法。在對(duì)人血漿樣本中 HSA的提取對(duì)比發(fā)現(xiàn)，HiTrap Blue親和柱對(duì)HSA的回收率＞90%，在鹽酸濃度為0.16 mol/L，反應(yīng)時(shí)間為1 h的情況下，PhIP-HSA亞磺酰胺加合物的水解效率高達(dá) 96%。樣品中PhIP的量在5~200 fmol（1.12~44.80 pg）時(shí)，其回收率在57%~92%之間，PhIP的回收率隨樣品中PhIP含量的減少明顯降低，樣品中內(nèi)標(biāo)[2H3]-PhIP的回收率均在70%~77%。通過信噪比3（S/N=3）和10（S/N=10）分別對(duì)血漿中PhIP-HSA亞磺酰胺加合物的檢測限和定量限進(jìn)行估算，檢測限低至5×10-3fmol/mg HSA，定量限低至1.50×10-3fmol/mg HSA。所以，該方法可以在節(jié)約樣本的基礎(chǔ)上具有特異性的檢測 HAAs與HSA形成的亞磺酰胺加合物。